戊二醛對羅非魚非特異性免疫功能的影響

摘要：為研究戊二醛對羅非魚非特異性免疫功能的影響。在養殖水箱中分別添加不同濃度戊二醛藥液（0、12.82、15.10、17.78、21.00、24.73、29.12和34.29 mg/L），測定羅非魚肝臟和肌肉組織中超氧化物歧化酶（SOD）和溶菌酶（LZM）活性變化情況。結果表明，隨著戊二醛濃度的不斷增加，肝臟和肌肉組織中SOD、LZM活性基本呈現先升后降的趨勢。適宜濃度的戊二醛可以增強羅非魚的免疫能力，而戊二醛濃度過高則會抑制魚體免疫能力。

關鍵詞：戊二醛；羅非魚；超氧化物歧化酶；溶菌酶；非特異性免疫

中圖分類號：S94""" 文獻標志碼：A

羅非魚（Oreochromis mossambicus）隸屬鱸形目（Perciforms）麗魚科（Cichlidae），原產于非洲，具有生長快、食性廣、肉質好和產量高等優點，現已成為世界范圍內重要的淡水養殖魚類[1]。我國自20世紀50年代開始引進羅非魚，已經成功培育出一批深受消費者歡迎的品種[2]。近年來，羅非魚作為我國重要的水產養殖品種，養殖模式也越來越多地被人們開發，包括工廠化養殖、網箱養殖、集裝箱養殖和傳統池塘養殖等。隨著養殖環境的不斷惡化，養殖水體的富營養化，如何提高羅非魚的抗病能力，提高免疫能力，特別是非特異性免疫能力，成為羅非魚養殖的重要研究方向。戊二醛是一種廣譜殺菌劑，能夠殺滅細菌、病毒和芽孢等，具有安全、廣譜、高效和刺激性小等優點，目前在國內已經得到廣泛應用[3]。戊二醛對繁殖型的細菌、病毒、分枝桿菌、致病性霉菌和細菌芽孢有高度殺滅效果，在水產養殖過程中得到廣泛應用，多用于魚體、池塘消毒，都具有良好的效果。然而，戊二醛不同用法、用量對魚類非特異性免疫具有不一樣的影響，目前在實際應用方面參考信息較少。本研究通過添加不同濃度的戊二醛，分析其對羅非魚非特異性免疫功能的影響，以期為水產養殖的疾病防治提供數據支持和理論指導。

1""" 材料與方法

1.1""" 試驗動物

羅非魚來自廣西水產引育種中心武鳴基地。羅非魚平均體長8.29 ±0.81 cm，平均體重9.36 ±2.49 g， 運輸回來后放在水泥長池中，流水養殖，暫養兩個星期至魚沒有死亡，活動正常，無病，反應靈敏，再進行試驗。

1.2""" 養殖水箱

養殖水箱采用規格為600 mm ×420 mm ×355 mm （長×寬×高）的康之好儲物箱。

1.3""" 試驗用品與準備

1.3.1""" 試驗前的準備

試驗前，準備試驗的器材，做好水族箱的消毒。在試驗前1 d，在每個水箱準確放入20 L水，曝氣1 d 以除去水中的氯氣。配好所需濃度的戊二醛溶液（見下表2），再將試驗魚放進水箱內。試驗期間不投食。

1.3.2""" 試驗藥品

試驗藥品為戊二醛、高鎰酸鉀、冰醋酸、無水乙醇和鉬酸銨，其品級與產地見表1。

1.4""" 急性毒性試驗

1.4.1""" 試驗濃度設置

每個水族箱先加水20 L，再加入戊二醛藥液，用隔網把水族箱分成兩部分，每部分隨機放入羅非魚魚種5尾。為了確定藥物質量濃度的大概范圍，正式試驗前先根據魚病防治通常使用的劑量適當擴大或縮小進行24h預備試驗。觀察羅非魚魚種的活動與存活情況，確定試驗濃度區間后，再按等對數間距設置7個濃度組，每個濃度設置兩個重復，并設置一個空白對照組。正式試驗在容量為50 L的水族箱中進行，試驗用魚為10尾/箱。試驗用水為曝氣3 d的自來水，pH 為7.2～7.8，水溫變化范圍為19～23℃，溶氧為6.8～9.3 mg/L，在每箱加入已配制好的戊二醛藥液10 mL。

1.4.2""" 試驗藥液配置

配制所需濃度的戊二醛藥液（見表2），試驗藥液現配現用。

1.4.3""" 試驗預處理

試驗開始后前8h內作連續觀察，以后不定時觀察中毒反應，并統計各試驗組羅非魚的死亡情況，及時撈出中毒死亡的羅非魚。

試驗魚死亡的判斷：以鰓蓋是否停止活動和對輕微刺激有無反應作為判斷依據，試驗魚在中毒后鰓蓋停止活動，用玻璃棒或小鑷子輕輕刺激尾柄部位30 s 內無反應即可確定為個體死亡。

1.5""" 樣品采集與制備

急性毒性試驗結束后，從每組水箱中隨意抽取魚種進行解剖，取其肝臟、肌肉組織，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，用濾紙吸干水分，稱重，然后放入10 mL的小燒杯內。用移液管量取預冷的蒸餾水，蒸餾水的體積總量分別是肝臟塊、肌肉塊重量的49、9倍，先用移液管取總量2/3的蒸餾水于玻璃勻漿管中。然后將剪碎的組織移入玻璃勻漿管中，再用剩余的1/3冷蒸餾水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管中進行勻漿（此操作盡量在冰水浴中進行）。在手工勻漿過程中，左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉動研磨數十次（6～8 mm），充分研碎，使組織勻漿化。然后取出，用編號的試管裝取，放在4℃冰箱保存。將制備好的2%和10%勻漿用低溫低速離心機2000 r/min左右離心10～15 min，將離心好的勻漿留上清棄下面沉淀，置于另一組離心管中備用。

1.6""" 指標測定

1.6.1""" 超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內一種重要的抗氧化酶，具有清除生物體內超氧陰離子自由基的作用，可有效地抗御氧自由基對有機體的傷害[4]。超氧化物歧化酶的定義：每mg組織蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位（U/mg prot）。超氧化物歧化酶的測定采用南京建成生物工程研究所試劑盒，具體操作參照試劑盒說明書。其計算公式如下：

1.6.2""" 溶菌酶

溶菌酶（LZM）的測定采用南京建成生物工程研究所試劑盒，具體操作參照試劑盒說明書。其計算公式如下：

1.7""" 數據統計與分析

采用Microsoft E×cel 2019軟件統計試驗羅非魚肝臟與肌肉中SOD和LZM含量的基礎數據，數據結果用“平均值±標準誤差”表示，并運用Microsoft E×cel 2019統計軟件對其進行主成分分析。主成分是戊二醛濃度與肌肉、肝臟中SOD和LZM含量的線性組合。即在本次試驗中將0、1、2、3、4、5、6和7，這8組戊二醛濃度與SOD、LZM含量以及含量總和進行對比分析，并針對戊二醛濃度對SOD和LZM含量變化進行綜合評價。

2""" 結果與分析

2.1""" 不同濃度的戊二醛對羅非魚肝臟和肌肉組織SOD活性的影響

由表3可以看出，當戊二醛的濃度達到17.78 mg/L時，羅非魚肝臟中SOD的活性最高，為155.54 U/mg prot。當戊二醛的濃度是15.10 mg/L時，羅非魚肌肉組織中SOD的活性最高，為136.36 U/mg prot。由圖1可以看出，當戊二醛的濃度在0～17.78 mg/L時，肝臟中SOD的活性呈上升趨勢，說明在一定濃度內，戊二醛溶液可以促進魚體肝臟產生SOD， 提升魚體免疫力，而當戊二醛的濃度超過17.78 mg/ L，肝臟內的SOD活性逐步降低，說明過高的戊二醛濃度，對魚體的免疫功能存在不利的影響。由圖1可以看出，當戊二醛濃度為0～15.10 mg/L時，羅非魚肌肉組織中SOD活性為上升趨勢，而濃度在15.10～ 34.29 mg/L時，SOD活性為下降趨勢，因此SOD活性最高值是戊二醛濃度為15.10 mg/L時。以上研究結果說明肝臟和肌肉組織對戊二醛的敏感度有所不同。

2.2""" 不同濃度的戊二醛對羅非魚肝臟和肌肉組織LZM活性的影響

由表4可以看出，當戊二醛的濃度達到17.78 mg/L時，羅非魚肝臟中LZM活性最高，達到29.13 U/mgprot；當戊二醛濃度達到24.73 mg/L時，羅非魚肌肉組織中LZM活性最高，達到35.83 U/mg prot。從圖2可以看出，當戊二醛濃度在12.82～17.78 mg/ L時，魚體肝臟中LZM活性逐步升高；當濃度在17.78～34.29 mg/L時，魚體肝臟中LZM活性逐漸下降；而當戊二醛的濃度在12.82 mg/L和24.73～ 34.29 mg/L時，羅非魚肝臟中的LZM活性都低于未用藥的組別。從圖2可以看出，戊二醛濃度在0～ 24.73 mg/L時，羅非魚肌肉組織中的LZM活性逐漸升高，而濃度在24.73～34.29 mg/L時，羅非魚肌肉組織中的LZM活性逐漸下降。

2.3""" 不同濃度的戊二醛對羅非魚肝臟和肌肉組織中LZM總量、SOD總量的影響

由表5可以看出，與對照組相比，當戊二醛濃度為17.78mg/L時，羅非魚肝臟和肌肉組織中的LZM 活性達到一個最高值，總和為59.08 U/mgprot，濃度為12.82～17.78 mg/L時，LZM活性是屬于上升階段，之后就處于下降狀態。當戊二醛濃度為15.10 mg/L時，羅非魚肝臟和肌肉組織中的SOD活性達到最高值，總和為287.18 U/mg prot，濃度為0～15.10 U/mgprot時，肝臟和肌肉組織中SOD活性也是逐漸升高，濃度在15.10～34.29 mg/L時，SOD活性則不斷下降。以上研究結果表明濃度較低的戊二醛對提高羅非魚非特異性免疫起到一定的促進作用，而濃度過高，則會抑制魚體免疫力。

3""" 討論

3.1""" 戊二醛對羅非魚肝臟和肌肉組織超氧化物歧化酶活性的影響

從圖1可以看出，當戊二醛在一定濃度時，可以適當地提高肝臟、肌肉組織內的SOD活性，從而一定程度上提升羅非魚體內的免疫效果；但是對不同的機體組織產生的影響不同，因而肝臟和肌肉組織中的SOD活性的最高值受不同濃度的戊二醛影響。然而，當戊二醛的濃度過大時，勢必會影響SOD的活性，降低魚體內部的免疫機能。

3.2""nbsp; 戊二醛對羅非魚肝臟和肌肉組織溶菌酶活性的影響

從圖2可以看出，當戊二醛的濃度在較低水平時，羅非魚肌肉組織中的LZM活性隨著戊二醛濃度增加而快速上升，速度遠比肝臟中的LZM活性要快，說明羅非魚的肌肉組織在接觸到戊二醛的外來侵襲時，會更快的做出反應，更快地加強機體免疫系統；而無論是肌肉組織還是肝臟，隨著戊二醛的濃度不斷增大，溶菌酶LZM的活性會呈現曲線變化，最終不斷地下降，甚至最終導致羅非魚死亡。

3.3""" 不同濃度的戊二醛對羅非魚非特異性免疫功能的影響

戊二醛首先可以對魚體表的細菌進行消毒，戊二醛的殺菌原理主要是依靠醛基，它主要作用于菌體蛋白上的巰基、羥基竣基和氨基，可使之烷基化，引起菌體蛋白質凝固造成細菌死亡；也可以刺激機體，產生各種免疫因子，增強機體免疫力。但是使用不當容易和皮下脂肪組織產生作用，引起皮下脂肪組織先凝固壞死，繼之液化，引起組織水腫。

與對照組相比，用不同濃度戊二醛處理的組別，發現魚體表粘液明顯增多，說明羅非魚在戊二醛溶液中，會感到外物的侵襲，從而產生應激反應，增強機體免疫力，以抵御外界的壓迫。隨著戊二醛的濃度的變化，羅非魚肝臟、肌肉組織中的SOD和LZM的活性都在發生著變化；而SOD和LZM則是魚體非特異性免疫的重要組成部分。在戊二醛濃度相對較低時，SOD和LZM活性得到一定程度的增強，促進了魚體免疫力；但是戊二醛濃度過高時，SOD和LZM活性則會下降，達到很低數值，從而抑制了魚體免疫力。

戊二醛可以殺滅細菌繁殖體、真菌和芽胞。隨著養殖環境的不斷惡化和養殖密度的增加，養殖魚類的病害逐年增多，死魚量也不斷增加，使得養殖戶的用藥量也逐年加大，而掌握正確用藥的方法至關重要。選藥物不僅要考慮療效好、副作用小，還要考慮對水體環境的保護，即應選擇毒性小、殘留期短、對水體污染小或無污染的藥物。盡量使用消毒劑，少用抗生素類藥物。

參考文獻

[1]楊亞琨，劉永杰，董雨豪.多重聚合酶鏈式反應技術檢測羅非魚5種常見食源性致病菌[J].食品安全質量檢測學報，2023，14（2） ：168-174.

[2]胡俊康.羅非魚養殖現狀與健康管理——訪中國水產科學研究院珠江水產研究所王廣軍研究員[J].廣東飼料，2021，30（3） ：8-10.

[3]高富紅.戊二醛消毒劑研究進展[J].安徽農業科學，2016，44（ 30 ）：121-122 + 126.

[4]張立穎，趙萌，王躍智.水生生物超氧化物岐化酶的研究進展[J].江西農業大學學報，2012，34 （4） ：800-804.