外周血miR-497表達在缺血性腦卒中診斷和預后評價中的應用

趙云肖，曾柳苑

摘要目的：研究外周血miR-497 mRNA表達水平對不同類型缺血性腦卒中的診斷價值及預后預測效能。方法：入選我院收治的650例缺血性腦卒中病人，經臨床診斷后將病人分為短暫性腦缺血發作（TIA）組、可逆性腦缺血損傷（RIND）組、進展性卒中（SIP）組和完全性卒中（CS）組。另選取同期在我院體檢的健康體檢者50名納入對照組。采用熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）法檢測外周血血清中miR-497 mRNA表達水平，比較不同類型缺血性腦卒中病人和對照組miR-497表達水平，并進行9個月隨訪。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析miR-497對不同類型缺血性腦卒中的診斷效能及對病人預后的預測效能。結果：腦卒中病人入院時血清miR-497表達水平低于對照組（P＜0.001），4組間的miR-497水平比較差異有統計學意義（P＜0.001）。腦卒中病人出院時miR-497水平高于入院時（P＜0.05），4組間的miR-497水平比較差異有統計學意義（P＜0.001）。ROC曲線顯示：入院時miR-497水平診斷缺血性腦卒中的ROC曲線下面積（AUC）為0.729，最佳診斷閾值為＜4.902，敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為73.85%、70.00%、96.97%、17.07%。出院時miR-497水平預測缺血性腦卒中病人預后良好的AUC為0.614，最佳診斷閾值為＜2.720，此時預測敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為30.96%、95.33%、93.10%和40.40%。結論：缺血性腦卒中病人血清miR-497水平明顯下降，且miR-497水平降低提示缺血性腦卒中病人病情進展和預后不良。

關鍵詞缺血性腦卒中；miR-497；疾病進展；預后

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.08.030

腦卒中是一種急性腦血管疾病，在中老年人中發病率較高。根據世界衛生組織2012年報告，腦卒中已經成為全球范圍內僅次于冠心病和癌癥的第三大死亡原因。目前認為，腦卒中發病是由于腦血管破裂或阻塞，導致血流不能完成正常的腦循環，腦組織氧化應激和炎性損傷［1］。缺血性腦卒中是腦卒中最常見的類型，占所有病例的60%～70%［2］。臨床上對缺血性腦卒中的診斷和治療較為復雜，主要通過相關血液學標志物結合頭顱影像進行診斷［3］。但一直缺少良好的血清學指標用于缺血性腦卒中的篩查、診斷和預后評價，造成部分病人無法及時預防、干預和治療，造成不可逆的神經損傷，甚至危及生命。研究發現，miR-497在腦梗死等多種腦血管疾病的發生和進展中起到重要作用［4］。Chen等［5］經過大鼠實驗發現，抑制miR-497表達通過增強年輕和老年大鼠的神經元自噬改善缺血性中風后的功能結果。Zhong等［6］則發現miR-497低表達可能導致缺血性腦卒中進展。但目前尚鮮見關于miR-497與缺血性腦卒中病人診斷和預后關系的研究報道。本研究旨在探究miR-497在缺血性腦卒中病人外周血的表達及其與預后的關系，現報道如下。

1資料與方法

1.1臨床資料

選取2020年2月—2021年6月我院收治的650例缺血性腦卒中病人，經臨床診斷后分為短暫性腦缺血發作（transient ischemic attack，TIA）197例、可逆性腦缺血損傷（reversible ischemic neurologic deficit，RIND）190例、進展性卒中（stroke in progression，SIP）181例、完全性卒中（complete stroke，CS）82例。另選取同期在我院體檢的健康體檢者50名納入對照組。5組臨床資料比較差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。詳見表1。本研究經醫院倫理委員會審核通過。

1.2納入與排除標準

納入標準：1）符合《2018美國卒中協會/美國心臟協會急性缺血性卒中病人早期管理指南》［7］中缺血性腦卒中的診斷標準；2）接受早期溶栓治療；3）無腦卒中常規藥物禁忌證；4）接受隨訪；5）未接受相關治療；6）已簽署知情同意書。排除標準：1）伴有惡性腫瘤、心腦血管疾病者；2）合并有免疫系統疾病者；3）合并有急性感染或在入院1個月內接受過抗生素治療者；4）無法配合檢查者；5）入院前3個月有手術史者；6）妊娠期或哺乳期女性；7）預期壽命＜1個月者；8）非初診病人。

1.3治療方案

入院后所有病人均按照《2018美國卒中協會/美國心臟協會急性缺血性卒中病人早期管理指南》進行治療，予以頭頸部血管造影、明確靜脈溶栓或機械取栓方案，并后續予以抗血栓或抗凝治療［7-8］。

1.4miR-497測定

病人在入院時和出院時采集5 mL空腹靜脈血，對照組在體檢時采集5 mL空腹靜脈血。室溫中靜置30 min后，于4 ℃、1 500 r/min離心15 min，收集上層清液儲存于－80 ℃冰箱待測。采用miRNA提取分離試劑盒（北京天根）提取血清中總RNA。以總RNA為模板，采用PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）反轉錄試劑盒（TaKaRa）合成互補DNA（complementary DNA，cDNA）。利用RealMaster Probe Kit試劑盒（北京天根）進行實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測miR-497表達水平。其中正向引物序列為：3′-GGGGTTAACCAATTGG-5′，反向引物序列為：3′-TTTAAGCGGCCTATA-5′。所有反應設置3個復孔和無模板的陰性對照，并以β-actin mRNA為內參，計算標準化2－ΔΔCt值。

1.5隨訪與預后判斷

病人出院后進行9個月隨訪，每個月通過門診、電話等方式進行隨訪，內容包括病人的精神狀態、用藥情況、恢復情況等。在末次隨訪時根據改良Rankin量表（mRS）評分評估病人預后情況：mRS評分＞2分，表明病人預后不良；mRS評分≤2分，表明病人預后良好。

1.6統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統計學處理和分析。符合正態分布的定量資料采用均數±標準差（x±s）表示，兩組間采用獨立樣本t檢驗進行比較，多組間采用One-way ANOVA和最小顯著差異性（LSD）post-hoc檢驗進行比較；定性資料采用例數和百分比（%）表示，比較采取χ2檢驗。采用受試者工作特征曲線（receiver operation characteristics，ROC）分析miR-497對預后的預測意義，計算ROC曲線下面積（area under curve，AUC）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1血清miR-497在腦卒中病人中的表達水平

入院時，腦卒中病人血清miR-497相對表達水平為4.09±1.23，顯著低于對照組的5.64±1.79（t＝－7.759，P＜0.001）；TIA組、RIND組、SIP組、CS組腦卒中病人的miR-497水平比較差異有統計學意義（F＝252.366，P＜0.001），其中TIA組最高，CS組最低。出院時，各組腦卒中病人的miR-497水平較入院時升高（t＝3.482，P＜0.001），4組間miR-497水平比較差異有統計學意義（F＝226.082，P＜0.001），其中TIA組最高，CS組最低。詳見表2。

2.2血清miR-497對腦卒中病人的診斷價值

采用ROC曲線對所有病人入院時miR-497表達進行分析，AUC為0.729，對于腦卒中的最佳診斷閾值為＜4.902，詳見圖1。此時敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為73.85%、70.00%、96.97%、17.07%。對于4種不同類型腦卒中，miR-497的診斷閾值及相應敏感度、特異度、AUC見表3。

2.3不同預后結局腦卒中病人miR-497水平比較

根據mRS評分結果，650例病人中有214例預后不良，436例預后良好，其中TIA組、RIND組、SIP組和CS組分別有43例、57例、72例和42例預后不良。各類型腦卒中預后良好組病人miR-497表達水平高于預后不良組（P＜0.05）。詳見圖2。

2.4出院時miR-497水平對預后的預測價值

對所有650例病人進行為期9個月的隨訪，成功隨訪到584例病人，隨訪成功率為89.85%。對病人的預后進行mRS評分，并采用出院時miR-497水平預測病人的預后情況。結果顯示，出院時miR-497表達水平預測腦卒中預后良好的ROC曲線的AUC為0.614，最佳診斷閾值為2.720，此時預測敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為30.96%、95.33%、93.10%和40.40%。詳見圖3。

3討論

缺血性腦卒中是一種發病率較高的心血管疾病，嚴重威脅人類生命健康和生活質量，目前對于缺血性腦卒中的診斷主要依賴于體格檢查和影像學，且缺乏對其復發診斷的檢測方法［9］。探討缺血性腦卒中發病的分子機制目前仍是臨床研究的難點和熱點［10］。miRNAs是一種20～24個核苷酸長度的非編碼RNA，在各種生物通路中發揮重要作用，在對環境變化和應激的細胞響應中具有特定重要性，可以在血液、體液、組織和細胞等多種生物標本內檢測［11-12］，可以用于疾病大規模臨床篩查，能夠提高缺血性腦卒中的早期診斷效率［13-14］。miRNA能夠通過RNA誘導沉默復合體降解或阻止靶信使RNA翻譯，從而參與調節靶蛋白的合成。在神經病學領域，miRNs被認為是大腦發育過程和病理事件的潛在調控因子。在缺血缺氧應激后，細胞和分子事件引發了不同miRNAs的表達失調，導致神經元損傷的長期進展和擴大。由于其具有調節靶蛋白合成的能力，miRNA成為調控腦缺血事件后神經元損傷的一種可能的治療策略。

miR-497屬于miR-15/107基因家族，該家族中miR-195在其他研究中也被發現在神經系統疾病中存在異常表達。Sinoy等［15］研究發現缺血性腦卒中小鼠模型miR-497表達水平上調，并可能通過影響神經元死亡促進疾病進展。 Yin等［16］研究也認為miR-497過表達會導致小鼠神經元丟失，加速腦卒中病情進展，并影響預后。然而有研究表明miR-497在局灶性腦缺血中表達降低［17］。其他關于腦卒中以及腦缺氧缺血性損傷和miRNAs的研究報道中，均傾向于miR-497和miR-369可能通過影響細胞對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的反應在腦神經元壞死性凋亡過程中發揮作用。

本研究發現相對于健康人群，缺血性腦卒中病人外周血miR-497水平降低，也證實了miR-497異常低表達與腦卒中發病和進展相關。已有研究發現miR-497能夠降低白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）和TNF-α等促炎因子表達水平［18］，對于缺血性腦卒中病人，miR-497水平降低可造成上述促炎因子表達增加，進而造成腦卒中病情進展。而關于腦膜瘤與miR-497的研究發現，腦膜瘤病人血清miR-497水平顯著低于正常人，高級別病人miR-497水平更低［19］。

此外，本研究還發現，4種不同類型腦卒中病人入院時外周血miR-497表達水平存在顯著差異，其中CS病人水平最低，TIA病人水平最高，這說明miR-497水平降低可能與缺血性腦卒中進展和嚴重程度相關。通過ROC曲線分析入院時miR-497在腦卒中診斷中的效能，結果顯示ROC曲線下面積為0.729，最佳診斷閾值為4.902時，此時預測腦卒中發生的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為73.85%、70.00%、96.97%、17.07%。對不同類型缺血性腦卒中診斷價值方面，病情越嚴重的類型，入院時miR-497表達水平的診斷性能越高，AUC、靈敏度和特異度越高。

進一步的隨訪發現，預后良好病人出院時的miR-497表達水平更高，出院時miR-497表達水平預測腦卒中預后良好的AUC為0.614，最佳診斷閾值為2.720，此時預測靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為30.96%、95.33%、93.10%和40.40%。這也進一步表明了miR-497對缺血性腦卒中的診斷和預后的預測具有一定的價值。

綜上所述，缺血性腦卒中病人血清miR-497水平明顯下降，且miR-497水平降低提示了缺血性腦卒中病人病情嚴重進展和預后不良。本研究仍存在一些不足。首先，本研究雖然樣本量較大，但僅為單中心研究，樣本代表性不足；其次，本研究證明了miR-497與缺血性腦卒中有一定的關系，但并未對miR-497在不同性別、不同年齡的健康者與腦卒中病人間的表達進行對比，同時并未明確血清中miR-497在腦脊液中表達的相關性，最后，本研究所涉及的隨訪周期較短，miR-497水平對腦卒中病人長期預后的影響評估不足。

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（收稿日期：2022-09-06）

（本文編輯王雅潔）