PCSK9抑制劑依洛尤單抗對(duì)冠心病大鼠血脂、血管內(nèi)皮功能損傷及炎性因子的影響

喬福斌，甄勝達(dá)，張娜，李仕嫻，喬鑫，張成軍

摘要目的：探究前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型（PCSK9）抑制劑依洛尤單抗對(duì)冠心病（CHD）大鼠血脂、血管內(nèi)皮功能損傷及炎性因子的影響。方法：通過(guò)高脂飲食構(gòu)建CHD大鼠模型，建模成功的45只大鼠隨機(jī)分為CHD組、依洛尤單抗20組和依洛尤單抗40組，每組15只；15只正常大鼠作為對(duì)照組。依洛尤單抗20組和依洛尤單抗40組分別皮下注射依洛尤單抗20 mg/kg與40 mg/kg。2周后檢測(cè)各組心肌組織、血脂指標(biāo)、血管內(nèi)皮功能指標(biāo)和炎性因子水平。結(jié)果：與對(duì)照組大鼠比較，CHD組大鼠心肌組織損傷、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、白細(xì)胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β、內(nèi)皮素（ET）-1水平顯著升高，一氧化氮水平顯著降低（P＜0.05）。依洛尤單抗20組和依洛尤單抗40組一氧化氮顯著高于CHD組，其余指標(biāo)均低于CHD組（P＜0.05）。依洛尤單抗40組的一氧化氮水平高于依洛尤單抗20組，其余指標(biāo)均低于依洛尤單抗20組（P＜0.05）。結(jié)論：依洛尤單抗可抑制血脂和膽固醇水平，保護(hù)CHD大鼠心肌組織，并抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。

關(guān)鍵詞冠心病；前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型，PCSK9；依洛尤單抗；血脂；內(nèi)皮功能；炎癥反應(yīng)

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.08.013

高膽固醇血癥被認(rèn)為是冠心病（coronary heart disease，CHD）的重要危險(xiǎn)因素，他汀類藥物雖然可以調(diào)控血脂并降低CHD病人死亡率，但是有50%～80%的病人在治療后仍未達(dá)到正常的膽固醇值［1-2］。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）的突變與高膽固醇血癥的發(fā)生有關(guān)，PCSK9基因多態(tài)性與普通人群中血清總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平相關(guān)，且與冠心病密切相關(guān)［3］。依洛尤單抗是一種針對(duì)PCSK9的全人源單克隆IgG2抗體，有臨床研究顯示，依洛尤單抗使LDL-C水平病人降低了64%～81%［4］。依洛尤單抗能夠抑制CHD膽固醇指標(biāo)促進(jìn)血脂指標(biāo)的改善［5］。但是使用依洛尤單抗單獨(dú)治療CHD的療效仍需要充足證據(jù)支持。本研究分析依洛尤單抗對(duì)CHD大鼠血脂、血管內(nèi)皮功能損傷及炎性因子的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)SD大鼠，雄性，6周齡，210～230 g，北京科興中維生物技術(shù)有限公司，SYXK（京）2020-0054。CM5型自動(dòng)生化分析儀（微納芯科技，天津）；Model 680型酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（碧云天，中國(guó)）；TRIzol（Sigma公司，美國(guó)）；RNAspin Mini（GE Healthcare，美國(guó)）；Bestar qPCR RT和BestarTMqPCR試劑盒（DBI Bioscience公司，德國(guó)）；抗體、一抗和山羊抗免疫球蛋白G（IgG）二抗（1∶1 000稀釋，＃ab6721）（Abcam公司，美國(guó)）；硝酸纖維素膜（EMD Millipore，美國(guó)）；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國(guó)）。

1.2動(dòng)物分組與建模

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫為（24±2）℃，濕度（50±3）%，喂養(yǎng)高脂飼料連續(xù)8周，每日30 g。8周后通過(guò)檢測(cè)TC和LDL-C的水平驗(yàn)證建模結(jié)果。將建模成功的45只大鼠隨機(jī)分為CHD組、依洛尤單抗20組（依洛尤單抗皮下注射20 mg/kg，連續(xù)2周［6］）和依洛尤單抗40組（依洛尤單抗皮下注射40 mg/kg，連續(xù)2周），每組15只；15只正常大鼠作為對(duì)照組。

1.3檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1HE染色

大鼠安樂(lè)死，心肌組織在室溫下用4%多聚甲醛固定6 h。用乙醇脫水（從低濃度到高濃度）后將組織包埋在石蠟中。然后將石蠟包埋的組織切成5 μm切片，將切片固定于載玻片上。將載玻片在室溫下放入蘇木精中染色10 min。用自來(lái)水洗滌1～2 min后，將玻片置于10%冰醋酸中10 s，然后置于1%氨水中，直到切片變藍(lán)。隨后用自來(lái)水清洗1～2 min后，將玻片放入曙紅中10 s。在乙醇（濃度分別為70%、90%、95%和100%）中脫水后，將玻片置于二甲苯中2 min，重復(fù)此步驟1次。最后，用中性膠密封玻片，在倒置顯微鏡下觀察載玻片。

1.3.2血脂指標(biāo)

收集大鼠尾靜脈血5 mL，通過(guò)生化分析儀檢測(cè)TC、三酰甘油（TG）和LDL-C水平。

1.3.3內(nèi)皮功能指標(biāo)與血清炎性因子

收集大鼠5 mL尾靜脈血靜置（室溫20 min）、離心（4 ℃ 20 min，2 000 r/min）后使用移液槍小心吸取血清，加入抗體孵育2 h后加入顯色劑，10 min后終止反應(yīng)。試劑盒來(lái)自碧云天公司。在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，根據(jù)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算白細(xì)胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β、內(nèi)皮素（ET）-1和一氧化氮濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1依洛尤單抗對(duì)CHD大鼠心肌組織的影響

對(duì)照組大鼠細(xì)胞核飽滿，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，細(xì)胞有序排列。CHD組大鼠心肌細(xì)胞染色不均勻，排列紊亂。依洛尤單抗20組和依洛尤單抗40組染色較CHD組均勻，且依洛尤單抗40組心肌細(xì)胞排列基本有序。詳見(jiàn)圖1。

2.2依洛尤單抗對(duì)CHD大鼠血脂的影響

CHD組TC、TG和LDL-C水平高于對(duì)照組（P＜0.05），依洛尤單抗20組和依洛尤單抗40組TC、TG和LDL-C水平低于CHD組（P＜0.05），依洛尤單抗40組低于依洛尤單抗20組（P＜0.05），且TC和LDL-C的水平基本恢復(fù)至對(duì)照組水平。詳見(jiàn)表1。

2.3依洛尤單抗對(duì)CHD大鼠內(nèi)皮功能指標(biāo)的影響

CHD組ET-1高于對(duì)照組，一氧化氮低于對(duì)照組（P＜0.05）；依洛尤單抗20組和依洛尤單抗40組ET-1低于CHD組，一氧化氮高于CHD組（P＜0.05），依洛尤單抗40組ET-1低于依洛尤單抗20組，且與對(duì)照組水平差異不明顯，一氧化氮高于依洛尤單抗20組（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

2.4依洛尤單抗對(duì)CHD大鼠炎性因子的影響

CHD組TNF-α、IL-1β和IL-6高于對(duì)照組（P＜0.05）；依洛尤單抗20組和依洛尤單抗40組低于CHD組（P＜0.05），依洛尤單抗40組的TNF-α、IL-1β和IL-6水平低于依洛尤單抗20組（P＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

3討論

他汀類藥物是調(diào)節(jié)血脂治療CHD的最主要藥物，但有研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物劑量每增加1倍，LDL-C濃度只會(huì)額外降低 6%［7］。又由于較高的LDL-C水平是CHD發(fā)生和進(jìn)展的重要因素［8］，因此，在控制血脂的同時(shí)有效控制膽固醇對(duì)治療CHD具有關(guān)鍵作用。PCSK9蛋白是由位于染色體1p32.3基因編碼的692個(gè)氨基酸組成，PCSK9 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中對(duì)其N端前段進(jìn)行分子內(nèi)自催化裂解并成熟［9］。PCSK9主要在肝臟中表達(dá)，在神經(jīng)元組織、腎間充質(zhì)細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞中也有表達(dá)，PCSK9通過(guò)破壞低密度脂蛋白受體的再循環(huán)來(lái)調(diào)節(jié)低密度脂蛋白的清除和膽固醇代謝，研究顯示PCSK9分子與低密度脂蛋白受體的表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)序列A結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而誘導(dǎo)低密度脂蛋白受體內(nèi)化到肝細(xì)胞中，并隨后被溶酶體降解［10］。PCSK9也可充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)分子伴侶，并抑制低密度脂蛋白受體過(guò)早形式和向細(xì)胞表面膜的轉(zhuǎn)運(yùn)［11］。作為PCSK9抑制劑，依洛尤單抗是一種新型的治療心血管粥樣硬化和高膽固醇血癥的藥物，一項(xiàng)單中心的臨床研究結(jié)果顯示，依洛尤單抗可控制血脂指標(biāo)［12］。本研究通過(guò)高脂飲食構(gòu)建了CHD大鼠模型，并通過(guò)依洛尤單抗干預(yù)，結(jié)果顯示依洛尤單抗可劑量依賴性抑制TC、TG和LDL-C，其中高劑量組的TC和LDL-C水平可基本恢復(fù)至正常水平，這提示依洛尤單抗在控制血脂特別是膽固醇中有著優(yōu)秀的作用。冠狀動(dòng)脈負(fù)責(zé)心肌供血，本研究也檢測(cè)了心肌組織的變化，結(jié)果顯示依洛尤單抗可劑量依賴性保護(hù)心肌組織，依洛尤單抗可以降低血脂和膽固醇水平，從而緩解CHD心肌損傷。

TC、LDL-C等升高會(huì)直接引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而引起炎性反應(yīng)，促進(jìn)TNF-α以及IL-1等炎性因子釋放［13］。炎性因子不但會(huì)促進(jìn)動(dòng)脈斑塊的形成，還會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞的存活和正常功能，影響冠狀動(dòng)脈功能［14］。一氧化氮和ET-1分別具有舒張和收縮血管的功能，是反映血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的指標(biāo)［15］。研究顯示ET-1的降低和一氧化氮的升高是CHD病人預(yù)后良好的重要指標(biāo)［16］。為進(jìn)一步研究依洛尤單抗對(duì)CHD的影響，本研究檢測(cè)了炎性因子和血管內(nèi)皮損傷因子。結(jié)果顯示，CHD模型大鼠外周血中的炎性因子和ET-1顯著升高，而一氧化氮降低，使用依洛尤單抗可抑制炎性因子和ET-1的水平，并促進(jìn)一氧化氮的升高。此外，依洛尤單抗40組的ET-1水平降低至正常水平。有體外研究顯示，依洛尤單抗可保護(hù)人類內(nèi)皮細(xì)胞免受過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷［17］；也有研究顯示依洛尤單抗可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞體外血管生成［18］。本研究結(jié)果顯示，依洛尤單抗可以抑制炎性反應(yīng)，并保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。但是依洛尤單抗保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能與其控制血脂和膽固醇的機(jī)制是否有關(guān)，是否還有其他調(diào)控途徑，仍需要進(jìn)一步在分子學(xué)上研究明確。

綜上所述，依洛尤單抗可抑制血脂和膽固醇指標(biāo)保護(hù)CHD大鼠心肌組織，并抑制炎癥反應(yīng)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。

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（收稿日期：2022-02-11）

（本文編輯王雅潔）