腧穴“解郁方”對慢性不可預測輕度應激抑郁大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸及BDNF/TrkB/CREB通路的影響

王文瑞，韓文華，董愛愛，王維峰

摘要目的：觀察腧穴“解郁方”對慢性不可預測輕度應激（CUMS）抑郁大鼠下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸和腦源性神經營養因子（BDNF）/酪氨酸激酶B受體（TrkB）/環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（CREB）信號通路的影響。方法：40只無特定病原體（SPF）級Sprague Danley（SD）雄性大鼠隨機分為空白組（10只）、模型組（10只）、西藥組（10只）、針刺組（10只），除空白組外，其余3組連續28 d 構建CUMS抑郁大鼠模型，造模成功后，西藥組連續14 d灌胃鹽酸帕羅西汀混懸液，每日1次；針刺組針刺百會、太沖、神門，每日1次，每次20 min，連續針刺14 d。蘇木素-伊紅（HE）染色觀察大鼠海馬病理變化，酶聯免疫吸附法（ELISA）測定血清促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）、促腎上腺皮質激素（ACTH）、皮質醇（CORT）水平；免疫組化（IHC）檢測海馬BDNF、TrkB表達情況，蛋白質免疫印跡法（Western Blot）及實時熒光定量-聚合酶鏈式反應（PCR）測定海馬BDNF、TrkB、CREB蛋白及mRNA的表達。結果：與空白組比較，模型組血清CRH、ACTH和CORT含量上升（P＜0.01），海馬病理損傷嚴重，海馬BDNF、TrkB平均光密度降低（P＜0.01），BDNF、TrkB、CREB蛋白及mRNA明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，針刺組血清CRH、ACTH、CORT含量下降（P＜0.05），海馬病理損害明顯減輕，BDNF、TrkB平均光密度明顯增加（P＜0.05），BDNF、CREB、TrkB蛋白及mRNA表達水平上升（P＜0.05）。結論：腧穴“解郁方”可能通過調節HPA軸和調控BDNF/TrkB/CREB信號通路，改善CUMS誘導的大鼠抑郁樣行為。

關鍵詞抑郁癥；慢性不可預測輕度應激；腧穴“解郁方”；下丘腦-垂體-腎上腺軸；腦源性神經營養因子/酪氨酸激酶B受體/環磷酸腺苷反應元件結合蛋白信號通路；海馬；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.08.011

Effects of Acupuncture "Jieyu Formula" on Hypothalamic-pituitary-adrenal Axis and BDNF/TrkB/CREB Pathway in Rats with Chronic and Unpredictable Mild Stress-induced Depression

WANG Wenrui， HAN Wenhua， DONG Aiai， WANG Weifeng

The Second Clinical College of Shanxi Medical University， Jinzhong 030619， Shanxi， China

Corresponding AuthorWANG Weifeng， E-mail： dzywwf@163.com

AbstractObjective：To observe the effects of "Jiyu Formula" on the hypothalamic-pituitary-adrenal（HPA） axis and? brain-derived neurotrophic factor（BDNF）/tyrosine kinase B receptor（TrkB）/cyclic adenosine phosphate reaction element binding protein（CREB） signaling pathway on chronic and unpredictable mild stress（CUMS） depressed rats.Methods：Forty specific pathogen free（SPF） grade SD male rats were randomly divided into blank group（10 rats），model group（10 rats），western medicine group（10 rats），and acupuncture group（10 rats）.Except for the blank group，the other three groups were continuously used to construct a depression rat model by CUMS for 28 days.After successful modeling，the western medicine group was gavaged Paxil hydrochloride suspension once a day for 14 days.In the acupuncture group，Baihui，Taichong and Shenmen were acupunctured once a day for 20 minutes each time for 14 days.The pathological changes of hippocampus were detected by hematoxylin-eosin（HE） staining，and the levels of serum adrenocorticotropin releasing hormone（CRH），adrenocorticotropin（ACTH） and cortisol（CORT） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The expressions of BDNF and TrkB in hippocampus were detected by immunohistochemistry（IHC），and the expressions of BDNF，TrkB and CREB protein and mRNA in hippocampus were detected by Western Blot and real-time fluorescence quantification and polymerase chain reaction（PCR）.Results：Compared with blank group，the contents of serum CRH，ACTH and CORT in the model group significantly increased（P＜0.01），the hippocampal pathological injury was serious，the average optical density of BDNF and TrkB in hippocampus significantly decreased（P＜0.01）.The protein and mRNA levels of BDNF，TrkB，and CREB were significantly decreased（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with model group，the contents of serum CRH，ACTH and CORT in the acupuncture group significantly decreased（P＜0.05），the hippocampal pathological injury was significantly alleviated，the average optical density of BDNF and TrkB significantly increased（P＜0.05） The protein and mRNA levels of BDNF，TrkB，and CREB were significantly increased（P＜0.05）.Conclusion：Acupuncture "Jieyu Formula" could improve depression-like behavior induced by CUMS in rats by regulating HPA axis and BDNF/TrkB/CREB signaling pathway.

Keywordsdepression; chronic unpredictable mild stress; acupoint "Jieyu Formula"; hypothalamic-pituitary-adrenal axis; brain-derived neurotrophic factor/tyrosine kinase B receptor/cyclic adenosine phosphate reaction element binding protein signaling pathway; hippocampus; experimental study

抑郁癥（depression）是一組精神障礙疾病，主要表現為情緒不振、缺乏快感、思維遲鈍、認知功能減退、睡眠障礙等臨床癥狀［1］。根據相關報道，抑郁癥已經被確認成為一種迅速增加的流行病，預計將成為2030年全球疾病負擔的主要疾病之一［2］。目前，臨床上廣泛應用于抑郁癥治療的藥物有選擇性單胺遞質再攝取抑制劑，如鹽酸帕羅西汀，雖然可以緩解部分抑郁癥癥狀，但這類藥物主要在單胺系統中發揮作用，作用部位比較單一，其受長期服用、副作用大、病人難以堅持等問題的制約［3］，只有40%～50%的抑郁癥狀可以緩解［4］。

針灸逐漸成為治療抑郁癥的一種重要替代療法，這在世界范圍內已得到普遍認可［5］。臨床研究及動物實驗均顯示，針刺治療抑郁癥效果頗佳［6-7］?，F代研究表明，針刺可通過多層次、多靶點、多系統對抑郁癥及其兼癥起到很好的調節作用［8］。針刺治療抑郁癥臨床療效明顯，尚需進行規范處方下的多重機制研究。本課題組前期經過篩選之后發現針刺治療抑郁癥的有效腧穴組方為百會、神門、太沖（簡稱腧穴“解郁方”［9］）。有研究發現腧穴“解郁方”能使血清炎性因子和激素水平降低［10］。本研究以下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸和腦源性神經營養因子（BDNF）/酪氨酸激酶B受體（TrkB）/環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（CREB）信號通路為基礎，探討腧穴“解郁方”抗抑郁的可能作用機制，為腧穴“解郁方”治療抑郁癥提供依據。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

鹽酸帕羅西?。ㄕ憬夥逅帢I有限公司生產，國藥準字H20040533，批號：220403）；針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司生產，規格0.35 mm×25 mm，批號：216010）；蔗糖（天津天力化學試劑有限公司，批號：20230402）；伊萊瑞特生產的大鼠促腎上腺皮質激酶釋放激素（CRH）試劑盒（批號：KL03TF0J9073）；促腎上腺皮質激素（ACTH）試劑盒（批號：KL02D6206258，伊萊瑞特）；聯科生物生產的皮質醇（CORT）酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（批號：A810030323）；RNA提取液（貨號：G3013，武漢賽維爾生物科技有限公司生產）；BDNF、TrkB、CREB、β-actin均為一抗、辣根過氧化物酶（HRP）-山羊抗兔（由Servicebio提供）。

自制曠場試驗箱（100 cm×100 cm）；大鼠籠及固定板（由山西中醫藥大學提供）；臺式高速冷凍微量離心機（D3024R，DragonLab）；垂直電泳儀（SVE-2，Servicebio）；熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（CFX Connect，Bio-rad）；武漢賽維爾生物科技有限公司生產的渦旋混勻儀（貨號SMV-3500）；電子天平［型號ME203E/02，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；酶標檢測儀（型號Epoch，BioTeK生產）。

1.2動物

在山西中醫藥大學科研樓實驗室飼養的實驗動物，使用北京斯貝福有限公司提供的無特定病原體（SPF）級Spragu Dowley（SD）雄性大鼠40只，體質量130～150 g，許可證號為SCXK（京）2019-0010，標準鼠籠，飼養環境溫度維持在22～25 ℃，相對濕度控制在45%～50%，光照周期為12 h/12 h，日溫差≤4 ℃，大鼠在飼養期間自由活動、飲水、攝食。動物實驗經山西中醫藥大學倫理委員會批準，倫理批號：2021DW175。實驗過程中符合國家和學校有關實驗動物的管理和使用規定。

1.3方法

1.3.1模型制備

采用慢性不可預知溫應激法（CUMS）制備大鼠抑郁模型［11］，使用刺激方法包括：24 h禁水，24 h禁食，5 min熱刺激，5 min 4 ℃冷水游泳，5 min夾尾，24 h傾斜籠具45°，24 h潮濕墊料，每天隨機給出1種應激，保證不會連續出現相同的刺激。造模28 d后進行糖水偏好實驗（sucrose preference test，SPT）和曠場實驗（open field test，OFT）評價模型是否成功建立。

1.3.2動物分組及干預方法

經過1周的適應性飼養，大鼠按照隨機數字表法分為空白組、模型組、西藥組、針刺組，每組10只?？瞻捉M不施加任何應激方式，每籠5只，正常喂養。模型組給予不可預見的28 d應激刺激，單籠飼養。西藥組孤養，造模成功后給予鹽酸帕羅西汀，給藥劑量為3.3 mg/kg，臨用時溶于蒸餾水配成混懸液，以1 mL/100 g灌胃給藥，每日1次，連續14 d。針刺組孤養，造模成功后，選擇燕平教授團隊前期通過實驗論證治療抑郁癥的最佳穴位組方，即百會、神門、太沖。穴位定位參考《實驗針灸學》［12］，針刺治療從造模第1天開始，留針20 min，每日1次，干預14 d。

1.3.3行為學檢測

1.3.3.1蔗糖偏好實驗

蔗糖偏好實驗是評價抑郁癥一個經典核心癥狀的測試即缺乏快感測試［13］。提前60 h訓練大鼠飲用1%的蔗糖溶液：24 h給每只動物2瓶1%的蔗糖溶液，以適應糖水；24 h給予1瓶糖水，1瓶純凈水；之后，大鼠禁食禁水12 h。24 h給予大鼠事先稱量的1瓶純水和1瓶糖水，計算大鼠在24 h內的糖水偏好度。糖水偏好度（%）＝糖水消耗量（g）／糖水消耗量（g）＋純水消耗量（g）×100%。

1.3.3.2曠場實驗

曠場實驗是一種評價大鼠自主活動的方法，是評估其在新環境中自主活動、探究行為和緊張程度的一種方法，當活動減少時，表明大鼠的探索行為減少、緊張程度增高，同時抑郁狀態也會增加［14］。在安靜環境下，將大鼠放入自制的曠場實驗箱內（共25格），每只單箱開展實驗。實驗結束后，記錄每只大鼠的水平跨越格數及上肢直立的次數。每只大鼠實驗結束后均需清潔實驗箱，以免影響實驗結果。

1.3.4采用ELISA方法檢測血清CRH、ACTH、CORT水平

大鼠采用20%烏拉坦行腹腔注射麻醉，取5 mL腹主動脈血，離心15 min（3 000 r/min），用移液槍將血清移入環氧樹脂（EP）管內，在－80 ℃冰箱內保存待測。采用ELISA法檢測，按ELISA試劑盒說明書對大鼠血清CRH、ACTH、CORT含量進行檢測。

1.3.5用HE染色法觀察大鼠海馬CA3區細胞形態變化

取血后，行斷頭取腦術，將腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，應用HE染色方法，根據HE染色試劑盒說明書制備石蠟切片，中性樹膠密封后，用顯微鏡觀察大鼠海馬區的病理變化。

1.3.6免疫組化法檢測大鼠海馬組織BDNF、TrkB含量

取石蠟切片經脫蠟，根據BDNF、TrkB免疫組化說明書進行操作，經過脫蠟至水、抗原修復、滅活，一抗孵育：滴加BDNF、trkB抗體，37 ℃濕盒孵育2 h，二抗孵育：滴加HRP-山羊抗兔，37 ℃孵育30 min，之后脫水透明封片后，用陽性深淺評價陽性強弱。

1.3.7大鼠海馬組織BDNF、TrkB、CREB的蛋白表達水平

蛋白質免疫印跡法（Western Blot）測定海馬BDNF、TrkB、CREB的蛋白表達。在海馬組織中加入10倍組織體積的裂解液進行勻漿，收集上清液，用二喹啉甲酸法（BCA）測定總蛋白濃度，沸水浴變性15 min，十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳，進行轉膜后，加上5%的牛奶，按1∶1 000添加配置好的BDNF、TrkB、CREB一抗，隔天用TBST緩沖液快速沖洗膜，滴加稀釋后的二抗（1∶5 000），常溫孵育30 min，TBST洗膜，曝光保存原始圖為TIFF格式，利用Image J軟件分析Western Blot 條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.3.8大鼠海馬組織BDNF、TrkB、CREB的 mRNA表達水平

實時熒光定量PCR測量BDNF、TrkB、CREB的mRNA表達。用Trizol試劑盒提取研磨組織后的總RNA，檢測其濃度及純度，進行逆轉錄總RNA為cDNA。用熒光定量PCR儀擴增，計算目的基因相對表達量采用2－ΔΔCt法，以GAPDH為內參，引物名稱及序列見表1。

1.3.9統計學處理

統計分析采用SPSS 25.0軟件，定量資料符合正態分布且方差齊時，以均數±標準差（x±s）表示，多組比較單因素方差分析，兩組數據分析均采用獨立樣本t檢驗；定性資料采用例數、百分比（%）表示，采取χ2檢驗；用Graphpad prism8.0作圖。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1腧穴“解郁方”對抑郁大鼠行為學的作用

2.1.1各組大鼠蔗糖偏好度比較

與空白組比較，模型組大鼠糖水消耗量顯著降低（P＜0.01），提示CUMS大鼠模型復制成功。針刺組、西藥組與模型組相比，糖水消耗量顯著提高（P＜0.01）；而西藥組和針刺組糖水消耗量差異無統計學意義（P＞0.05），表明腧穴“解郁方”可有效提高大鼠的快感度。詳見圖1。

2.1.2各組大鼠水平運動及垂直運動得分比較

與空白組比較，模型組大鼠水平運動和垂直運動的得分減少（P＜0.01）；與模型組比較，針刺組、西藥組水平運動和垂直運動的得分增加（P＜0.01），西藥組和針刺組水平運動、垂直運動得分比較差異無統計學意義（P＞0.05），可見針刺可有效提高抑郁大鼠的自主活動，緩解其緊張度。詳見圖2。

2.2腧穴“解郁方”對大鼠海馬CA3區病理變化的影響

HE染色結果表明，空白組大鼠海馬CA3區神經元細胞排列整齊，結構完整；模型組海馬CA3區神經元細胞結構不明確，排列松散，存在異常結構；與模型組比較，針刺組海馬CA3區神經元數量較模型組明顯增加，排列較為整齊，表明大鼠海馬神經元的病理損傷可通過腧穴“解郁方”得到改善。詳見圖3。

2.3腧穴“解郁方”對大鼠海馬組織中BDNF、TrkB表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠海馬BDNF、TrkB的平均光密度值減少（P＜0.01）；與模型組相比，針刺組、西藥組BDNF、TrkB的平均光密度值明顯增加（P＜0.05），西藥組和針刺組BDNF、TrkB之間的平均光密度值表達比較差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見圖4、圖5。

2.4腧穴“解郁方”對大鼠血清CRH、ACTH、CORT的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清CRH、ACTH、CORT含量增加（P＜0.01）；與模型組比較，針刺組、西藥組大鼠CRH、ACTH、CORT含量明顯下降（P＜0.05），西藥組與針刺組各項含量比較差異無統計學意義。證明腧穴“解郁方”對HPA軸亢進有調節作用。詳見圖6。

2.5腧穴“解郁方”對抑郁大鼠海馬組織BDNF、TrkB、CREB蛋白的影響

與空白組比較，模型組大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、CREB蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，針刺組、西藥組大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、CREB蛋白表達水平明顯增加（P＜0.05）。結果表明，腧穴“解郁方”可提高大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、CREB蛋白表達，從而改善大鼠的抑郁狀態。詳見圖7、圖8。

2.6腧穴“解郁方”對抑郁大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、CREB mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、CREB mRNA表達水平明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，針刺組、西藥組BDNF、TrkB、CREB mRNA表達水平明顯增加（P＜0.05），實驗結果表明，腧穴“解郁方”能夠增加BDNF、TrkB、CREB mRNA的表達，從而起到緩解大鼠抑郁癥狀的作用。詳見圖9。

3討論

CUMS是一種應激反應，被認為是研究抑郁癥病理生理機制的最佳模型［13］，因此，本研究利用CUMS法誘導大鼠抑郁模型，模型組經過CUMS法造模后，糖水偏好度等降低，HE染色結果顯示大鼠海馬細胞出現溶解現象，細胞排列紊亂，證明CUMS法造模會造成大鼠海馬組織的損傷。謝保弟［15］研究顯示，腧穴“解郁方”可能通過對抑郁大鼠海馬神經細胞的保護作用使海馬神經細胞減少相對較少。本研究顯示腧穴“解郁方”可使大鼠海馬區神經元細胞排列趨于規則，破壞溶解現象減少。

抑郁癥是一種常見的精神類疾病，其發病機制錯綜復雜［16］。本研究從HPA軸失衡和BDNF兩個角度闡述抑郁癥的相關機制。在抑郁癥的發病過程中，HPA軸起著重要的作用［17］。研究表明，HPA軸在應激狀態下可被過度激活，導致大量應激激素釋放，如CRH、ACTH、CORT等，導致機體負反饋機制受損和紊亂［18］。高水平的應激激素會進一步損害顳葉和海馬的結構和功能，引起錐體神經元萎縮和再生功能障礙，最終表現為抑郁癥狀［19］。本研究ELISA結果顯示，模型組大鼠血清中CRH、ACTH、CORT含量顯著升高，提示抑郁大鼠發生了HPA軸的失衡。

BDNF屬于神經營養因子家族，是一種在前額葉皮層和海馬有高度表達的中樞神經系統中分布最廣泛的神經營養因子［20］。BDNF能維持情緒和認知功能，對學習和記憶起著至關重要的作用，可以促進軸突生長、樹突細胞成熟，提高突觸可塑性［21］。BDNF啟動一系列下游信號轉導過程，與TrkB受體高親和力結合后，通過促進神經元的生存、發育、生長和分化，起到調節神經系統突觸可塑性和神經再生的作用，達到抗抑郁的作用［22］。巴戟天可通過BDNF/TrkB/CREB信號通路對抑郁大鼠海馬神經元損傷發揮神經保護作用，改善抑郁行為［23］；電針可通過增加海馬組織型纖溶酶原激活物（tPA），激活BDNF/TrkB通路從而起到抗抑郁作用［24］；激活BDNF/TrkB/CREB通路可改善腦卒中后抑郁大鼠的抑郁樣行為［25］。以上研究均說明BDNF/TrkB/CREB通路在抑郁癥中發揮重要作用。

在腧穴“解郁方”中，百會位于頭部，是督脈與足太陽之會，具有開竅醒神，調節陰陽之效；神門穴為手少陰心經原穴，氣血輸注之處，可起到安定心神、調節氣血的作用；太沖為足厥陰肝經之原穴，具有調暢氣機的作用，與情緒調節功能有著密切的聯系。三穴相配，上中下共調，可達到調和陰陽、疏肝解郁、安神定志的功效，進而達到治療抑郁癥的目的。喬瑞瑞［26］研究顯示，腧穴“解郁方”可降低大鼠血清中ACTH、CORT的含量，起到治療抑郁作用；李佳豪等［27］研究顯示，腧穴“解郁方”通過激活與BDNF相關信號通路，改善大鼠抑郁行為。CUMS法誘導的大鼠海馬組織BDNF、TrkB、CREB蛋白含量及mRNA表達水平降低，經腧穴“解郁方”干預后，BDNF、TrkB、CREB蛋白含量及mRNA表達水平上升，可能與調節BDNF/TrkB/CREB信號通路有關。

綜上所述，腧穴“解郁方”可能通過拮抗HPA軸失衡及調節BDNF/TrkB/CREB信號通路，從而改善抑郁大鼠的抑郁樣行為。

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（收稿日期：2023-10-21）

（本文編輯王雅潔）