基于NF-κB信號通路探討補腎活血法治療腰椎間盤退行性變的作用機制*

向婷,余彧,楊利學

1.陜西中醫藥大學第一臨床醫學院,陜西 咸陽 712000; 2.陜西中醫藥大學附屬醫院脊柱科,陜西 咸陽 712000

腰椎間盤退行性變(intervertebral disc degeneration,IDD)是脊柱疾病退化的常見病理基礎和過程[1]。與腰椎間盤突出癥、椎管狹窄、腰痛病及根性痛等脊柱退行性疾病有重大關聯。這些疾病將導致患者腰痛、根性痛甚至是致殘,同時也帶來巨大的社會和經濟負擔。其中IDD是導致腰椎間盤突出的主要原因之一,其發生的病理機制大多是細胞外基質(extra cellular matrix,ECM)穩態失衡,表現為基質合成代謝小于分解代謝。其主要病理學表現為髓核細胞凋亡、炎癥反應、纖維環斷裂及細胞外基質合成減少[2]。近年來,研究發現在IDD發病機制中,核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信號通路扮演著重要的角色。各種刺激下NF-κB信號通路被激活,炎性細胞因子和細胞凋亡基因上調,終板軟骨細胞、椎間盤髓核(nucleus pulposus,NP)細胞出現大量凋亡,最終導致IDD[3]。大量炎性因子在退變性椎間盤內高表達,如白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)。目前,臨床上手術治療和保守治療為IDD患者主要治療方式[4]。研究發現益氣補腎活血方干預退變性髓核細胞,不僅能夠下調炎性因子的表達,而且能夠減緩細胞外基質降解速度,從而延緩髓核細胞凋亡[5]。故筆者重點闡述補腎活血法基于NF-κB信號通路干預IDD的機制及療效。

中醫并無IDD相對應的名稱,可將其歸屬于“腰腿痛”“腰痹”“痹證”范疇。“腰為腎之府”“腎藏精,主骨,生髓”。《黃帝內經》記載:“腰者,腎之府,轉搖不能,腎將憊矣。”可見腰痛病位在腰,基本病機在于腎氣虧虛。《醫學入門》記載:“閃挫跌撲墜墮,以致血癖腰痛,日輕夜重。”《丹溪心法》云:“腰痛主濕熱、腎虛、癖血、挫閃、有痰積。”后世醫家認為腰痛病因在于瘀血、痰積等。因此,腰痹病機有二:一為“痹者閉也”,氣血運行受阻、筋脈閉阻,出現氣滯血阻,導致腰痛、腿痛等癥狀;二是由于營衛不通、臟腑不和,繼而損傷經絡,筋脈不通。因此,本病的病機總結為“氣滯血瘀,筋脈閉阻”。現代醫學將IDD發病原因歸結為腎氣虧虛為本的內在因素與急性外傷、長期勞損及風寒濕邪侵襲等外在因素。因此,腰痛基本病機以腎虛為本,不榮則痛;血瘀為標,經脈閉阻,不通則痛;本虛標實、腎虛血瘀是IDD的病理本質。治療上應以補腎壯骨為主,重視活血化瘀,舒筋通絡,二者相輔相成。現代研究顯示補腎活血法通過調控炎性因子、氧化應激反應,抑制 NF-κB信號通路激活,減慢髓核細胞凋亡、細胞外基質降解速度,進而延緩IDD進程,達到緩解疼痛的效果[6]。

1 IDD病因

正常椎間盤由髓核組織和包繞其周圍的纖維環以及上下軟骨終板所構成,髓核組織以Ⅱ型膠原纖維(collagen type Ⅱ,colⅡ)和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)為主要成分[7],正常生理狀態下髓核細胞處于代謝平衡狀態。IDD以髓核細胞減少及細胞外基質的降解為主要特征。近年來,越來越多的研究發現IDD病理機制主要體現在髓核細胞凋亡、基質穩態失衡以及終板軟骨細胞鈣化和死亡等方面[8]。IDD是一個復雜的綜合過程。引發上述變化的原因與炎性因子介導的炎癥反應、氧化應激反應等有關。炎性因子介導的炎癥反應不僅可以激活信號通路使髓核細胞凋亡,還能上調基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的表達,下調colⅡ和Aggrecan表達,加速椎間盤的退變。氧化應激反應促使大量活性氧自由基簇積,直接損傷髓核細胞和軟骨終板細胞,擴大局部炎性反應,修飾MMPs導致細胞外基質代謝失常,最終導致IDD。

2 NF-κB信號通路

NF-κB是一個轉錄因子家族,在脊椎動物和果蠅中,NF-κB 家族由NF-κB蛋白和Rel蛋白兩個亞家族組成異二聚體。在外界環境非刺激下,主要以p65和p50二聚體非活性形式與IKB 結合隔離于細胞質內[9]。NF-κB二聚體的活化是在衰老、炎性因子、缺氧及氧化應激等的刺激下形成的,這一過程被稱為IKK介導的磷酸化誘導的IkB抑制劑降解的結果[10]。NF-κB進入細胞核并發生轉錄,最具代表性的是使相關促炎細胞因子基因表達。這個調控轉錄過程常被分為經典和非經典途徑。TNF-α和IL-1信號傳導的響應是NF-κB信號通路經典途徑。TNF-α是典型的促炎細胞因子,其信號傳導在慢性炎癥疾病發病機制中發揮舉足輕重的作用,比如類風濕性關節炎、炎癥性腸病、哮喘和慢性阻塞性肺疾病[11]。IL-1β也是參與調節機體免疫應答和炎癥反應的促炎性細胞因子,能夠誘導慢性炎性疾病和急性組織損傷,包括炎癥性腸病、類風濕性關節炎、各種自身免疫和自身炎癥疾病等,椎間盤軟骨終板細胞內炎性因子表達與IL-1β表達上調有直接關系,進而加速IDD進程[12]。

3 NF-κB信號通路與IDD的關系

NF-κB通路是某些肌肉骨骼疾病中炎癥和分解代謝的主要調節通路[13]。在IDD發病過程中,可觀察到NF-κB的高表達,各種刺激下激活NF-κB,調節椎間盤內多種細胞因子、趨化因子、黏附分子、炎性介質和基質降解酶的表達,從而誘發IDD[14]。近年來,許多研究證實該信號通路在IDD發病過程中的重要性,NF-κB信號通路的激活與炎性因子和氧化應激水平的升高有關。眾所周知,IL-1β、TNF-α等炎性因子大量表達是IDD發生的關鍵,也是NF-κB信號通路激活的重要炎性因子。目前,通過誘導NF-κB信號通路加速IDD進展的機制有:(1)炎性因子激活;(2)氧化應激;(3)高糖、衰老、缺氧等。

3.1 NF-κB誘導下炎性因子對IDD的影響

3.1.1 IL-1β對IDD的影響眾所周知,IL-1β是促炎性細胞因子IL-1家族中最重要的成員之一,僅存在于人體內,參與先天性炎癥和免疫反應。通過刺激細胞因子、趨化因子和基質金屬蛋白酶等多種促炎介質的產生而具有較強的促炎活性[15]。退行性椎間盤組織和細胞中IL-1β高度表達[16],并已被證明IL-1β參與炎癥反應、基質破壞、血管生成和神經支配、細胞凋亡、氧化應激和細胞衰老等IDD過程中的多種病理過程[17]。研究發現,IL-1β抑制NF-κB活化直接促進椎間盤內環境失穩而加速IDD[18]。因此,直接抑制IL-1β可以延緩IDD。李瑤等[19]使用NF-κB通路抑制劑 BAY11-7082 處理退變髓核細胞與正常人髓核細胞比較,發現在退變的髓核細胞中,隨著IL-1β濃度的升高,ADAMTS-4和IL-1β的表達顯著上調,而Aggrecan和colⅡ的表達顯著降低。抑制劑BAY11-7082可以逆轉這種情況。張宇等[20]通過IL-1β誘導小鼠椎間盤軟骨終板細胞炎性退變,發現誘導組細胞colⅡ、Aggrecan 表達下降,col X、MMP-1、MMP-3、MMP-13、TIMP-1 表達增加,證實IL-1β誘導終板退變。

3.1.2 TNF-α對IDD的影響TNF-α是一種最有效的促炎細胞因子,大部分由單核細胞和巨噬細胞等免疫細胞分泌合成[21],也可由椎間盤細胞自身產生,通過其受體TNFR1和TNFR2發出信號。TNF-α在IDD退變過程中是重要的調節因子[22]。正常椎間盤存在少量TNF-α,可以修復和重塑正常椎間盤組織[23],但TNF-α在退行性椎間盤組織中高度表達,可加速IDD的進展。目前研究證明ECM破壞、炎癥反應、細胞凋亡、自噬和細胞增殖在促進IDD的發展中起關鍵作用[24]。NF-κB是由TNF-α激活的關鍵途徑,并調節許多下游炎癥基因的表達。Xie等[25]用TNF-α(100 μg·L-1)處理大鼠NP細胞48 h,證實炎性細胞因子TNF-α促進NP細胞凋亡,并發現TGF-β1可能有助于通過調節Fas/FasL途徑,減弱TNF-β介導的NP細胞凋亡。TNF-α抑制劑(依那西普)可減少機械性痛覺異常并下調神經炎癥因子[26]。但是,硬膜外注射依那西普僅是減緩神經性疼痛,對延緩IDD還存在很大爭議,仍需要大量研究及隨訪驗證。

3.2 氧化應激對IDD的影響正常椎間盤是一個缺氧、低營養且呈酸性的微環境。細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生和清除在正常情況下處于動態平衡。當以酸性pH、低營養、高滲透壓和炎癥為特征的退變性椎間盤[27],終板軟骨的鈣化供給營養物質不足以供給椎間盤內,大量微血管新生,而盤內代謝產物的清除下降[28]。機體ROS的產生與清除動態平衡失調,氧化應激反應產生。大量細胞實驗及動物實驗也證實ROS和氧化應激與多個骨骼肌肉疾病相關,退變性椎間盤內亦會產生大量ROS。因此,退變性椎間盤微環境致使盤內組織中簇集大量ROS。ROS在激活NF-κB信號通路中扮演重要的角色。目前認為ROS引起的氧化應激是造成細胞凋亡的觸發因素也是重要原因,而當前主要的解釋是ROS通過活化并誘導 NF-κB 信號表達,導致細胞凋亡。在椎間盤中,氧化應激的產物羧甲基賴氨酸可能會與晚期糖基化終產物受體結合,從而激活細胞中的NF-κB信號通路[29]。梁鶴等[30]收集正常及退變的人椎間盤組織,經生化、凝膠遷移實驗及WB實驗檢測,結果發現氧化應激下髓核細胞通過誘導或激活NF-κB信號通路導致細胞凋亡,進而誘發IDD。楊聯軍等[31]采用不同濃度的過氧化氫干預氧化應激的髓核細胞模型,發現隨著濃度的升高,細胞凋亡越高,ROS產生也越多,線粒體膜電位下降。李洪濤等[32]通過體外實驗觀察過氧化氫對大鼠髓核細胞氧化應激損傷的影響,發現過氧化氫發生氧化應激反應機制時激活髓核細胞內 p38 和 JNK 的活性,從而導致髓核細胞凋亡。

4 補腎活血法對NF-κB誘導下IDD的影響

髓核細胞數量減少和細胞外基質代謝失衡,炎性反應,細胞因子氧化應激反應是IDD的主要表現,其主要病理機制是各種刺激下激活NF-κB信號通路加速IDD。研究顯示,補腎活血類中藥延緩IDD的可能作用機制是減少由NF-κB信號通路活化后出現的炎性反應和氧化應激反應,從而保護髓核細胞及細胞外基質[33]。NF-κB信號通路的激活可能會加速IDD。因此,補腎活血類方能使 NF-κB 信號通路失活,通過降低炎性因子的過量表達,減緩IDD進程。

4.1 補腎活血法對髓核細胞及細胞外基質的影響椎間盤是由髓核細胞和細胞外基質組成的一個復雜整體。髓核細胞位于椎間盤內中心,是整體的主角。外界環境刺激下分泌基質成分和蛋白酶的效率不一,調節基質代謝的平衡。細胞外基質主要由Ⅱ型膠原纖維和蛋白聚糖組成,功能是使髓核維持水分,從而承受椎間盤內大量負荷。髓核細胞為盤內提供營養物質,基質維持胞內環境的相對穩定。IDD發病首先出現在髓核細胞,表現為細胞凋亡,無法發揮提供營養的作用。基質金屬蛋白酶在IDD中起核心作用,主要通過分解膠原蛋白和聚集蛋白聚糖,MMPs與ECM分解和IDD進展密切相關。炎性細胞因子如IL-1β在退行性IVD中高表達,可增加MMPs的表達和相關的ECM降解。劉志超等[34]通過身痛逐瘀湯干預髓核細胞實驗研究發現,髓核細胞形態及超微結構、生長狀況、增殖活性優于對照組。因此,減緩IDD的作用機制可能是有效上調PI3K/AKT信號通路的表達,延緩髓核細胞的凋亡。葉辛等[35]采用補陽還五湯干預髓核細胞退變大鼠,發現補陽還五湯能夠減輕細胞炎癥反應,延緩細胞基質結構降解等抑制NLRP3/caspase-1信號通路激活,從而防治髓核細胞退變。王健等[36]采用補腎活血中藥干預IDD大鼠,測定椎間盤組織PG和NO的含量,結果發現補腎活血法延緩IDD的機制可能是減緩細胞外基質中的Aggrecan降解、減輕炎癥程度和改善局部微循環、防止自由基過量產生。

總之,IDD以細胞外基質降解失衡和髓核細胞凋亡為特點。補腎活血類方劑減緩IDD是通過降低炎性因子表達,減少基質金屬蛋白酶的刺激,維持細胞外基質微環境平衡,髓核細胞正常供給等途徑實現的。

4.2 補腎活血法對炎性因子的影響大量實驗證實侵入退行性椎間盤中的單核細胞和巨噬細胞在退變過程中會釋放大量炎性因子,如TNF-α和 IL-1β,亦是IDD啟動和發展的炎性因子。研究也證實炎性因子與年齡的增長和IDD的嚴重程度呈正相關。因此,延緩IDD的有效方式可能是抑制椎間盤內炎性因子的過度表達。佟德民等[37]通過纖維環針刺法建立腰椎退變大鼠模型,應用身痛逐瘀湯干預,發現中藥組能降低椎間盤髓核內炎性因子 TNF-α 和IL-1β的表達,發揮抗炎止痛的效果。陳和軍等[38]建立兔腰椎間盤突出模型,活血祛痛湯+中藥貼敷組給藥4周后可以降低椎間盤組織中 IL-1α、IL-1β的含量,發揮抑制炎性反應、調節機體的免疫功能、改善局部微循環、降低血液微凝狀態的功能,進而減緩IDD退變。仇湘中等[39]制備大鼠IDD模型成功后,檢測出模型大鼠盤內TNF-α及NF-κB均較正常椎間盤增高,經補肝健腰方干預后,TNF-α及NF-κB表達較模型組、干預前都顯著降低,證實補肝健腰方通過減少TNF-α及 NF-κB 過度表達,發揮延緩IDD的作用。方鵬飛等[40]研究發現,杜仲腰痛丸能夠平衡抗炎因子IL-10和促炎因子 IL-1、TNF-α等水平的表達,抑制NF-κB信號通路的活化,從而抑制腰椎間盤突出癥患者異常的炎癥免疫反應。

綜上所述,補腎活血法延緩IDD的作用機制可能是通過調控促炎因子和抗炎因子的平衡,進而抑制NF-κB信號通路的活化,達到減緩IDD進程的目的。

4.3 補腎活血法對終板軟骨細胞的影響早期研究發現椎間盤是人體最大的無血管組織[41]。椎間盤的營養供給來源于軟骨終板和纖維表面血管彌散滲透。作為椎間盤的組成部分,當軟骨終板鈣化或退變時,就意味椎間盤內喪失營養供給來源,從而加速IDD的進展。呂存賢等[42]通過補陽還五湯干預兔IDD模型,發現補陽還五湯對血管內皮生長因子受體的表達有促進生長作用,也能有效增加內皮細胞的增殖及血管的新生,從而恢復軟骨終板區的血液再灌注,進而逆轉軟骨終板退變。李玲慧等[43]實驗研究發現IDD與血管內皮生長因子的異常表達有關,中、高劑量補腎活血方可以下調血管內皮生長因子的過度表達,進而延緩IDD。劉汝專等[44]應用血府逐瘀湯干預IDD模型大鼠,結果發現血府逐瘀湯可降低軟骨終板內IL-1β高度表達,保護椎間盤終板軟骨細胞,延緩椎間盤軟骨終板細胞的凋亡速度,發揮保護椎間盤的作用。蘇培強等[45]采用不同濃度的 IL-1β干預兔軟骨終板細胞,結果發現軟骨終板細胞的凋亡與IL-1β抑制細胞增殖及基質合成有一定的關系。

因此,中藥湯劑可以促進軟骨終板血管再生,恢復血運再灌注,有效提供椎間盤內營養供給,進而減緩軟骨終板鈣化進程。

5 總結與展望

IDD是一個復雜的過程,腰痛發病率隨著年齡的增長而上升,但是目前卻有年輕化趨勢。NF-κB信號通路在退行變疾病中有大量的理論研究,炎癥是其治療靶點,通過大量病理及臨床試驗對 NF-κB 信號通路的研究,反映了IDD的發病機制及補腎活血法干預NF-κB信號通路的作用機制,但目前的實驗研究仍存在一些局限:(1)大量實驗研究采用手術方式破壞椎間盤內結構造模,退變速度快于正常速度;(2)實驗研究干預方式單純抑制TNF-α、IL-1β某一個炎性因子,而IDD是綜合因素作用下的結果,退行性腰椎間盤處于慢性炎癥狀態,許多促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β和 IL-6 共同參與了這一過程,這些炎性因子引起的炎性反應最終結果是引起盤內分解和合成代謝失衡,導致椎間盤退化、突出和神經根疼痛。假設僅抑制一種促炎因子很難完全阻止IDD的進展;(3)實驗研究大多選用大鼠和兔的髓核細胞,雖然是研究IDD發病機制的公認模型,但與人的髓核細胞對某些刺激反應存在差異;(4)正常椎間盤內含有少量炎性因子,對髓核細胞有修復、再生、重建的功效,抑制劑阻斷某一細胞因子的再生,影響髓核再生功能療效持續時間短;(5)運用網絡技術-網絡藥理學等解釋中藥的成分靶點干預某個疾病的靶點,但中藥成分的復雜性很難明確闡釋其影響NF-κB信號通路的具體機制,補腎活血法影響氧化應激反應方面的研究還有待深入。為此,在今后IDD的研究中,需要將中藥信號通路和疾病IDD聯系起來,深入探究中藥干預IDD信號通路的有效成分、作用靶點、療效機制,也為實現中醫藥精準治療IDD做好充分的準備。