激光共聚焦顯微術在中藥與天然藥誘導腫瘤細胞凋亡研究中的應用

李鉆芳 陳文列 陳榮

激光掃描共聚焦顯微術(laser scanning confocal microscopy，LSCM)是先進的細胞和分子生物研究技術，是在熒光顯微鏡的基礎上配置激光光源，掃描裝置，共聚焦裝置和檢測系統加以數據化的圖像處理技術而形成的新型顯微鏡技術，因其獨特的激光掃描裝置，具有不損傷細胞、共焦成像分辨率高、能層析掃描、實現多重熒光共定位以及能觀察樣品的三維圖像等優點，已被廣泛應用于形態學、細胞生物學、分子生物學、發育生物學、神經科學、藥理學、遺傳學和環境科學以及抗腫瘤藥物研究等領域。

1 LSCM在腫瘤細胞凋亡檢測中的優勢

促進腫瘤細胞凋亡是許多中藥殺傷腫瘤細胞的重要途徑，中藥誘導細胞凋亡成為中醫藥抗腫瘤機制的研究熱點之一。細胞凋亡時伴隨染色質的降解及凋亡相關信號的傳遞，中藥可對細胞凋亡過程的不同環節進行調節，進而促進細胞凋亡，維持機體內平衡，延緩或阻止組織病理過程的惡化。

細胞凋亡的常用檢測有形態學的光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，生物化學的DNA凝膠電泳法，流式細胞術等方法，但各自都有一定的局限性，如電鏡觀察制樣程序費時、不易定量，流式細胞術檢測的是群體細胞或某一類細胞的各凋亡指標，無法對單個細胞進行定位分析，無法確定凋亡位點。而激光掃描共聚焦顯微術，通過結合各種特異性熒光探針，不僅能實現核酸、蛋白質、抗體、受體等大分子的定位、定性、定時及定量檢測，還能從分子水平檢測到單細胞在活性狀態下的各指標信號，在觀察細胞形態、檢測凋亡進程及測定活細胞凋亡過程中鈣離子、線粒體膜電位、活性氧自由基變化等方面得到廣泛應用。

2 LSCM在中藥與天然藥誘導腫瘤細胞凋亡研究中的應用

2.1 觀察細胞核變化與凋亡小體

經特異性的DNA、RNA熒光探針(如吖啶橙AO、碘化丙啶PI)或DNA熒光探針(如Hoechst33258、Hoechst33342、DAPI)等標記后的細胞，用LSCM能獲得其細胞核清晰的圖像，能直觀地顯示細胞受損后DNA和RNA的變化，在凋亡細胞的LSCM圖像上可見細胞核染色質濃縮、DNA凝結而成的凋亡小體等；而AO或PI還可顯出細胞輪廓、凋亡細胞出芽等。不同于電鏡下觀察，LSCM能夠在保持細胞活性及完整性的前提下，對細胞進行觀察和測量，其圖像質量好、分辨率高，可以實現多重熒光信號共同觀察，甚至可以獲得細胞三維重建圖像。此外，通過結合顯示凋亡早期細胞膜變化的靈敏指標Annexin V，可準確定位與定量觀察細胞膜與細胞核的凋亡位點。

王學習[1]、季宇彬[2,3]、高世勇[4]、周炳剛[5]等分別應用LSCM結合AO熒光探針單標法或AO/EB雙染法，研究扶正抑瘤顆粒含藥血清、龍葵堿、甘草黃酮、苦參堿對荷瘤小鼠H22肝癌細胞及S180腫瘤細胞或肝癌細胞HepG2、人乳腺癌MCF-7/ADR細胞的DNA 、RNA含量或細胞核的變化，以及三維DNA熒光強度分布[5]，結果表明這些中藥、天然藥及其提取物可破壞腫瘤細胞核酸，降低DNA/RNA比值，抑制核酸復制與合成而抑制細胞的生長，甚至出現凋亡小體等典型的凋亡形態學特征。

韓健等[6]、焦鵬等[7]用LSCM結合Annexin V/FITC或Annexin V/PI雙染法，觀察臨床抗癌中藥冬凌草甲素、白花丹參根制劑對人胃癌細胞BGC-823的抑制增殖或誘導凋亡的作用。楊洋等[8]觀察PI熒光標記細胞核變化，研究槲皮素聯合順鉑對宮頸癌HeLa細胞增殖及凋亡影響，結果見細胞核收縮、凝集、碎裂等凋亡現象。周欣陽等[9]應用FITC熒光素標記天花粉蛋白(TCS)，在LSCM下直接觀察TCS進入黑色素瘤B16細胞動態過程，發現TCS能抑制黑色素瘤細胞活性、抑制分裂增殖，且誘導細胞凋亡，出現凋亡小體。

柯文娟等[10]利用LSCM結合Hoechst33258染色，研究甘草次酸對髓系白血病細胞系K562 的抗癌機制，觀察到甘草次酸能誘導細胞凋亡、產生凋亡小體而抑制其增殖。張春陽等[11]、周欣陽[9]應用LSCM包括雙光子激發激光掃描顯微術結合Hoechst33258染色，觀察到TCS作用人絨癌細胞(JAR)、H22肝癌細胞后，核染色質濃縮，出現凋亡小體等。

2.2 觀測細胞內Ca2+濃度

細胞質中游離的Ca2+作為第二信使在凋亡信號傳遞過程中起關鍵作用，細胞核內Ca2+濃度的持續升高是導致細胞凋亡的主要原因。在LCSM出現之前，對Ca2+的研究大都是通過死細胞進行的，無法對細胞內的Ca2+信號進行動態觀測，而Ca2+的動態變化是反映細胞生理過程及生理變化的重要信息。結合特異性Ca2+熒光探針Fluo-3/AM、Rhod-1、Indo-1、Fura-2等，LSCM不僅能夠精確測定其濃度，還可以在亞細胞水平上對細胞內外Ca2+的活動進行精確的時間和空間上分布，提供其動態變化的圖像，實時觀測藥物作用下細胞內外Ca2+濃度的變化，從而判斷藥物的抗癌活性、治療效果等。

季宇彬等[12]、鄒翔等[13]、朱麗麗等[14]、孫紀元等[15]、高世勇等[4]、張長城等[16]應用LSCM結合Fluo-3/AM探針分別觀察中西藥復方抗癌制劑海嘧啶、西蘭花中的抗癌活性成分葡萄糖異硫氰酸鹽GS、重樓皂苷、苦馬豆素、龍葵堿、青蒿琥酯等對人胃腺癌SGC-7901細胞、人前列腺癌PC-3細胞增殖的抑制作用，及經各中藥、天然藥處理的細胞內Ca2+濃度的動態變化，表明上述中藥、天然藥均能升高Ca2+濃度，影響細胞周期，其凋亡作用機制與細胞內鈣超載有關，而海嘧啶則可通過開放細胞膜鈣通道和引起細胞內鈣釋放兩條途徑誘導腫瘤細胞凋亡。

2.3 觀測線粒體膜電位變化

細胞線粒體膜電位(MMP)是細胞能量產生的先決條件，其變化是細胞凋亡的一個早期特征，是細胞凋亡不可逆轉的標志。在細胞凋亡過程中，細胞膜雙分子層中的磷脂不平衡分布會被破壞，發生磷脂外酰絲氨酸由內層向外層的翻轉，暴露在外面的磷脂酰絲氨酸可以被周圍的吞噬細胞識別、吞噬，從而使凋亡的細胞得以被清除[17]。在各種藥物刺激下，通過LSCM測量線粒體特異性探針JC-1、Rhodamine123、Annexin V、TMRE等的熒光強度變化，就能反應MMP的變化及線粒體功能狀態，不僅可以定量分析，還可對其進行實時動態掃描，獲得藥物刺激下MMP瞬時動態變化，及時反應藥物對細胞凋亡的影響。

代志軍等[18]、王學習等[19]、高世勇等[4]用LSCM結合Rhodamine123或TMRE熒光探針研究中藥半枝蓮提取物(ESB) 含藥血清、糙葉敗醬提取物、龍葵堿分別作用于肝癌HepG2 、H22細胞及S180細胞后MMP的變化，結果均顯示各中藥或天然藥均可不同程度降低MMP，誘導腫瘤細胞凋亡。

2.4 觀測活性氧自由基含量

活性氧自由基(ROS)是誘導細胞凋亡和影響細胞衰老的主要因素之一，正常情況下，它的產生和消除處于平衡狀態，過量的ROS 會引起細胞內核酸、蛋白質等生物大分子損傷，引起蛋白質氧化，DNA鏈斷裂，細胞膜起泡、脂質氧化等細胞凋亡特征，從而引發炎癥、癌癥等疾病。結合特異性熒光探針如DCFH-DA，利用熒光強度與活性氧濃度的線性關系，通過LSCM就能靈敏高效地檢測到細胞內ROS含量的變化。

王學習等[1,19]利用LSCM結合D-399探針觀察扶正抑瘤顆粒含藥血清、糙葉敗醬提取物作用于S180細胞后ROS的變化，結果顯示提取物持續作用細胞48小時后，高劑量組細胞ROS增加，可能使DNA鏈斷裂，導致細胞凋亡。

2.5 觀測細胞凋亡相關基因表達

細胞凋亡的調控涉及許多基因，包括一些與細胞增殖有關的原癌基因和抑癌基因。其中研究較多的有Bcl-2基因家族、Caspase家族等。采用LSCM結合熒光抗體技術觀察相關基因表達，不僅可定位細胞內各相關基因表達位點，還可同時定量每個細胞的熒光強度，間接反映目標蛋白含量，以檢測藥物對各基因表達的影響。

季宇彬等[20,21]采用LSCM結合FITC染色，進行肝癌HepG2細胞內Caspase-3及Bcl-2的定位，并顯示龍葵堿能顯著升高細胞內Caspase-3含量，降低Bcl-2含量，誘導細胞凋亡。

鄧剛等[22]用LSCM結合免疫熒光細胞化學，研究姜黃素對前列腺癌PC3細胞Notch1蛋白表達和亞細胞定位，顯示Notch1定位于胞膜、胞質，且胞核表達增加，呈濃度依賴性，表明姜黃素誘導凋亡可能與Notch1 表達和核易位激活有關。

李祺福等[23,24]用LSCM結合免疫熒光抗體，分別觀察到人參皂甙Rg1、肉桂酸、丹參酮組合(RCT)誘導人成骨肉瘤MG-63細胞分化過程中，Nucleophosmin(NPM)及prohibitin在MG-63細胞中，與c-fos、c-myc、RB、p53等基因產物具有共定位關系，并在RCT處理后細胞核內其共定位區域發生了變化。

2.6 觀測細胞通訊

某些細胞癌變時，縫隙連接會減少甚至消失，喪失細胞間通訊能力，阻礙細胞間傳遞控制正常生長的有關信息，這提示腫瘤細胞的快速分裂、增殖和轉移, 與縫隙連接的消失有關。通過測量細胞縫隙連接分子的轉移，可以研究腫瘤啟動因子和生長因子對縫隙連接介導的胞間通訊的抑制作用。LSCM可采用熒光光漂白恢復(FRAP)技術檢測細胞縫隙連接，通過觀察已發生熒光漂白細胞其熒光恢復過程的變化量，來判斷細胞縫隙連接的通訊功能。

王學習等[25]應用LSCM結合CFDA-AM熒光探針，按FRAP分析程序，測定荷瘤小鼠H22細胞間通訊狀況，結果顯示不同劑量組扶正抑瘤顆粒含藥血清作用于H22細胞，細胞間熒光恢復速率即細胞間通訊狀況均有不同程度的提高。

2.7 其它

LSCM不僅能夠對所測對象進行實時顯微成像，還能檢測樣品的自發熒光光譜或新熒光探針的發射光譜，以及在標記過程中造成的熒光探針光譜轉移等。利用此光譜掃描功能，可以進一步確定抗腫瘤藥物在腫瘤細胞內的分布情況及作用機制。

陳同生等[26,27]采用LSCM成像及熒光共振能量轉移( FRET)技術，通過檢測細胞形態及活細胞中SCAT3 質粒的熒光光譜，分別研究中藥蟾酥、消癌平誘導人肺腺癌(ASTC-a-1)細胞凋亡過程中Caspase-3的活化特性，結果表明蟾酥能誘導癌細胞凋亡，出現凋亡小體，且Caspase-3參與調控蟾酥誘導的細胞凋亡過程，消癌平有效抑制細胞的增殖活性，并于作用72小時時誘導細胞內Caspase-3的活化。

3 展望

隨著激光掃描共聚焦顯微鏡技術的普及，有關中藥抗腫瘤作用機制的研究日漸增多，檢測手段也日益先進。在觀察細胞凋亡時細胞形態變化、測定細胞內鈣離子濃度、活性氧自由基、細胞膜電位等信號的變化以及DNA/RNA、基因蛋白表達、細胞周期等研究中，激光掃描共聚焦顯微技術顯示出很強的優越性。它不僅可以動態觀察藥物在細胞中的分布及其干預細胞的變化情況，還可以通過觀察不同時間段藥物與靶點的結合情況，了解其在細胞內代謝過程，以判斷服藥的最佳時間，以進一步提高藥效。

根據現代藥理學研究，抗腫瘤中藥主要有兩大類，一類是細胞毒藥物，一類是具有免疫增強作用、生物反應調節劑樣作用的藥物。中藥抗腫瘤具有多靶點、多效應、不良反應小、不易產生耐藥性、安全有效等優點[28]。研究表明，中藥是通過多個環節起到抑制惡性腫瘤的作用[29]，目前LSCM技術在抗腫瘤藥物作用機制研究中，大部分僅局限于誘導細胞凋亡研究，對中藥活性物質在體內變化及作用特點、細胞毒作用、增強機體免疫功能、分子水平上抗腫瘤血管生成、抑制多藥耐藥、抑制腫瘤細胞侵襲轉移等機制研究中還比較少。中藥現代化過程中，隨著各學科間的發展和相互滲透，激光掃描共聚焦顯微技術有著廣闊的應用前景，特別是在中藥抗腫瘤作用機理的基礎研究以及抗腫瘤新藥藥效研究上，將發揮越來越重要的作用。

[1] 王學習，趙健雄，陳茹, 等. 荷瘤小鼠扶正抑瘤顆粒含藥血清對H22細胞的凋亡、自由基含量和線粒體膜電位的影響[J].中國中西醫結合雜志, 2007,27(4):343-346.

[2] 季宇彬, 王宏亮, 高世勇. 龍葵堿對荷瘤小鼠腫瘤細胞DNA和RNA的影響[J]. 中草藥, 2005,36(8):1200-1202.

[3] 季宇彬, 姜薇, 尚明, 等. 甘草黃酮對S180和H22荷瘤小鼠腫瘤細胞DNA和RNA的影響[J]. 中草藥, 2005,36(10):1518-1520.

[4] Gao SY,Wang QJ, Ji YB.Effect of solanine on the membrane potential of mitochondria in HepG2 cells and [Ca2+]i in the cells[J]. World J Gastroenterol,2006,12(21): 3359-3367.

[5] 周炳剛, 孫靖中, 蘇剛，等. 苦參堿誘導人乳腺癌細胞MCF-7/ADR的凋亡研究. 中華實驗外科雜志, 2003, 20(6):515-516.

[6] Han J, Ye M, Qiao X et al. Induction of apoptosis and G2/M cell cycle arrest by oridonin in human gastric cancer BGC-823 cells[J].J Chinese Pharmaceutical Sciences. 2007,16(4):307-314.

[7] 焦鵬,常起,楊明峰，等. 白花丹參根制劑對胃癌細胞增殖和凋亡的影響[J]. 世界華人消化雜志, 2007,15(8):820-823.

[8] 楊洋, 張蔚, 黃麗瓊, 等. 槲皮素聯合順鉑對宮頸癌HeLa細胞增殖及凋亡的影響[J]. 武漢大學學報(醫學版), 2009, 30(3):334-336.

[9] 周欣陽, 張天一, 顧君一. 異硫氰酸熒光素標記動態觀察天花粉蛋白對黑色素瘤B16細胞的損傷[J]. 中國組織工程研究與臨床康復, 2007,11(29):5792-5796.

[10] 柯文娟, 劉新月, 陳燕, 等. 甘草次酸對K562細胞增殖抑制作用及其機制研究[J]. 中草藥, 2008, 39(5): 714-717.

[11] 張春陽, 貢宜萱, 馬輝, 等. 雙光子及共聚焦激光掃描顯微術研究天花粉蛋白對人絨癌細胞的作用機制[J]. 生物化學與生物物理進展, 2001,28(5):717-721.

[12] 季宇彬, 高世勇. 海嘧啶體內外抗腫瘤作用研究[J].中國藥學雜志, 2005,40(23):1788-1793.

[13] 鄒翔, 郎朗, 武曉丹, 等. 西蘭花中葡萄糖異硫氰酸鹽誘導人胃腺癌SGC-7901細胞凋亡的初步研究[J]. 中草藥. 2007,38(2):228-231.

[14] 朱麗麗, 李惠芬. 重樓皂苷對SGC-7901細胞增殖抑制及誘導凋亡的實驗研究[J]. 時珍國醫國藥, 2009,20(6):1501-1502.

[15] Sun JY, Wang SW, Zhu MZ. Research of mechanisms of swainsonine-induced apoptosisin human gastric carcinoma cell line SGC-7901[J]. Chin J Clin Pharmacol Ther, 2005,10(9): 978-983

[16] 張長城, 張小鵬. 青蒿琥酯對人前列腺癌PC-3細胞內游離Ca2+的影響[J].中國藥房, 2009,20(6):148-419.

[17] 楊軍軍, 高申孟, 陳慧. 苦參堿誘導多發性骨髓瘤細胞株RPMI8226凋亡的實驗研究[J]. 中國實驗血液學雜志, 2007, 15(3):515-518.

[18] 代志軍, 王西京, 薛茜, 等.半枝蓮含藥血清對肝癌H22細胞凋亡及線粒體膜電位的影響[J]. 中西醫結合學報, 2008, 6 (8):821-826.

[19] 白德成，王學習, 趙健雄, 等. 糙葉敗醬提取物抗腫瘤作用機制研究[J]. 中草藥, 2008,39(4): 572-574.

[20] Ji YB, Gao SY, Ji CF, et al. Induction of apoptosis in HepG2 cells by solanine and Bcl-2 protein[J]. J Ethnopharmacol, 2008,115(2):194-202.

[21] 高世勇, 王秋娟, 季宇彬. 龍葵堿對HepG2細胞內caspase-3及Bcl-2蛋白含量的影響[J]. 中國天然藥物, 2006,4(3):224-229.

[22] 鄧剛, 余建華, 胡志全，等. 姜黃素對雄激素非依賴性前列腺癌細胞Notch1表達和分布的影響[J]. 華中科技大學學報(醫學版),2007,36(6):740-743，847.

[23] 李祺福, 石松林, 劉慶榕, 等. 人參皂甙Rg1組合誘導人成骨肉瘤MG-63細胞分化過程中Nucleophosmin的表達與定位變化[J]. 細胞生物學雜志, 2008, 30(2):265-272.

[24] 石松林,李祺福, 劉慶榕, 等. 人參皂苷Rg1組合誘導人成骨肉瘤MG-63細胞分化過程中Prohibitin的表達與定位變化[J]. 中國生物化學與分子生物學報, 2008, 24(2):180-187.

[25] 王學習，趙健雄，陳茹, 等. 扶正抑瘤顆粒對小鼠移植性腫瘤細胞間通訊的影響[J]. 中成藥, 2008,30(3):343-346.

[26] 陳同生, 王小平, 王治平, 等. 消癌平誘導人肺腺癌(ASTC-a-1)細胞內caspase-3活化的熒光光譜分析[J]. 光譜學與光譜分析, 2008,28(6):1327-1331.

[27] 陳同生, 王小平, 孫磊, 等. Caspase-3參與調控蟾酥誘導人肺腺癌(ASTC-a-1)細胞的凋亡[J]. 生物化學與生物物理進展, 2008,35(1):85-90.

[28] 黃自麗, 黃修燕, 鄭起. 中藥抗腫瘤作用及其作用機制研究進展[J]. 醫學綜述, 2010, 16(3):386-389.

[29] 林洪生, 張英. 中醫藥防治惡性腫瘤回顧與展望[J]. 環球中醫藥, 2009,2(5):321-326.