牛大力亞慢性毒性研究

摘要：目的" 通過開展牛大力的亞慢性毒性試驗，為其安全性評價提供試驗依據。方法" 80只SPF級SD種大鼠（雌雄各半）分成4個組，分別為低、中、高3個劑量組[0.86、2.58、7.73 g/（kg·bw）]和陰性對照組，經口灌胃分別給予相應劑量的牛大力，陰性對照組給予純凈水，連續灌胃90 d。實驗結束，大鼠經腹腔麻醉后采血檢測血液指標，采集臟器稱重及計算臟/體比，并進行病理學檢查。結果" 各劑量組動物生長發育良好，體重、攝食量、食物利用率、血常規、凝血、血生化指標、臟器重，以及臟/體比指標與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），組織病理學觀察未見與受試樣品有關的病理改變。結論" 在本試驗條件下，確定受試樣品牛大力對雌、雄性大鼠的未觀察到有害作用劑量（NOAEL）均為75.00 g/（kg·bw），未見亞慢性毒性。

關鍵詞：牛大力；亞慢性毒性；安全性評價；有害作用劑量

中圖分類號：R29" " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.07.011

文章編號：1006-1959（2024）07-0062-07

Study on Subchronic Toxicity of Millettia Speciosa

TANG Li1，HU Shuai-er1，CHEN Mei-fen1，ZHANG Zi-hong1，LI Wen-li1，LI Dong-li2

（1.Institute of Toxicology，Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention，Guangzhou 511430，Guangdong，China;

2.School of Biotechnology and Health Sciences，Wuyi University，Jiangmen 529000，Guangdong，China）

Abstract：Objective" To provide experimental basis for safety evaluation of Millettia speciosa by conducting subchronic toxicity test.Methods" A total of 80 SPF SD rats （sex in half） were divided into low， medium and high dose groups [0.86、2.58、7.73 g/（kg·bw）] and a negative control group. Rats in the dose groups were orally administered the corresponding doses of millettia speciosa， while rats in the negative control group were given purified water. The oral gavage lasted for 90 days consecutively. At the end of the experiment， blood samples were collected from rats anesthetized by intraperitoneal injection for blood indexes analyses. Major organs were harvested and weighed to calculate organ-to-body weight ratios. Histopathological examinations were also performed on organ tissues.Results" The growth and development of the animals in each dose group were good. There was no significant difference in body weight， food intake， food utilization rate， blood routine， blood clotting， blood biochemical index， organ weight， and viscera/body ratio index between each dose group and the negative control group （Pgt;0.05）. No pathological changes related to the test samples were observed by histopathological observation.Conclusion" Under the conditions of this experiment， the no observed adverse effect level （NOAEL） of the test sample Millettia speciosa on female and male rats is determined to be 75.00 g/（kg·bw）， and no subchronic toxicity is observed.

Key words：Millettia speciosa;Subchronic toxicity;Safety assessment;No observed adverse effect level

基金項目：廣東省中醫藥局科研項目（編號：20221060）

作者簡介：湯莉（1983.10-），女，廣東廣州人，碩士，主管技師，主要從事食品毒理及動物病理研究

牛大力是豆科蝶形花亞科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤（Millettia speciosa Champ.）的干燥根，又名山蓮藕、豬腳笠、九龍串珠、扒山虎、大力薯等，味甘、性平，有補虛潤肺，強筋活絡之功效[1]。牛大力在國內外均有分布，國內以廣東、廣西、海南、福建、湖南、貴州為主，是多年生草本或半灌木，高10～30 cm，根狀莖短縮或稍粗，直徑2～5 mm，是一種藥食同源植物，根部可入藥，是廣東、廣西地區常用的補骨健筋類藥材，多用于燉湯，配制藥膳，藥酒等[2]。近年來，隨著對牛大力的深入研究，從中分離鑒定出其所含的多種生物活性成分，包括生物堿、黃酮類、苯丙素類、揮發油、甾醇類以及微量元素如鐵、錳、鋅、銅、鈣、鎂[3，4]。其中，生物堿成分具抗菌作用，黃酮類具抗炎鎮痛效果，苯丙素類和揮發油具抗氧化和抑菌活性，甾醇類，具抗腫瘤功效，尤其牛大力苷和牛大力甙兩個成分表現出強大的抗腫瘤潛能，可開發為抗腫瘤藥物[5]。既往研究顯示，牛大力具有廣譜藥理活性，比如抗菌、抗炎鎮痛[6]、抗氧化[7，8]、抗腫瘤、抗疲勞[9]、增強免疫力[10，11]、護肝[12]、降尿酸、降血糖等，可用于治療腰肌勞損、風濕性關節炎、肺結核、慢性支氣管炎、慢性肝炎、遺精、白帶等癥。其中，高麗槐素為特征性成分，也是檢驗牛大力質量的一個重要標準，并具有抗腫瘤和抗菌藥效[13]。牛大力具有較高的藥用價值與營養價值，在中草藥中被廣泛應用，明確其毒性特征是保障患者的用藥安全的關鍵。但關于牛大力的毒理學研究還非常有限，有關牛大力的毒性實驗報道較少。本研究依照食品安全國家標準要求，進行大鼠90 d經口毒性試驗，以確定亞慢性經口最大無作用劑量（NOAEL）參數和毒性靶器官，旨在為牛大力在食用安全性評價和開發利用提供科學依據。

1材料與方法

1.1受試樣品" 牛大力，樣品批號為202009EP，塑料袋裝，黑褐色膏體，由五邑大學提供。牛大力（提取物濃縮液）制備工藝：采集牛大力植物的新鮮根，加入10倍量50%乙醇煮沸回流提取2 h，過濾得濾液和濾渣，濾渣用相同方法再提取一次，得到的濾渣用10倍量的水回流提取2 h，合并3次的濾液，濃縮至浸膏。牛大力干品人體推薦每日服用量為15 g，以成人體重60 kg計，每日服用量為0.25 g/（kg·bw），按五邑大學提供的牛大力（提取濃縮液）得率10.3%折算，則牛大力（提取濃縮液）的人體推薦每日服用量為0.025 75 g/（kg·bw）。

1.2 實驗動物" SPF級SD種健康大白鼠80只，體重：70～80 g由南方醫科大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK（粵）2016-0041，質量合格證編號：NO.44002100026556，所有動物均采用的顆粒飼料為SPF級維持鼠料，由廣東省醫學實驗動物中心提供。飼養于廣東省疾病預防控制中心屏障環境動物實驗室，實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2018-0011，室溫20～26 ℃，濕度40%～70%。

1.3儀器與試劑

1.3.1主要儀器" 日立7600-020自動生化分析儀、東亞sysmex XT-2000i全自動血球計數儀、STA COMPACT MAX血凝儀、迪瑞H800尿液分析儀。ZEISS Axioskop 40顯微鏡、MICROM HM355s切片機、Intelsint RVG-1脫水機、MICROM AP280包埋機、SAKURA染片機。

1.3.2主要試劑" 血液學檢測、血凝檢測試劑均由原儀器生產商供應，血液學生化學指標檢測試劑由九強生物科技公司提供，鈉、鉀、氯檢測試劑由日立公司提供。

1.4亞慢性毒性試驗" 設3個劑量組，劑量分別為0.86、2.58、7.73 g/（kg·bw）相當于人體推薦每日服用量的33.3、100、300倍。80只SD大鼠按照體重隨機分成4個組，分別為低、中、高3個劑量組，以及陰性對照組。每組20只，雌雄各半，分籠飼養，經口灌胃給予受試物，按1.0 ml/100 g bw灌胃，陰性對照組按同等容量灌胃給予純凈水，每天灌胃1次，連續90 d。試驗結束后，計算大鼠的體重總增重、總攝食量和總食物利用率，并對其進行血液學和血清生化檢查，大體解剖后進行臟器稱重，計算臟器指數，最后對高劑量組和陰性對照組動物進行組織病理學檢查，發現病變后再對較低劑量組相應器官及組織進行檢查。檢測臟器包括腦、垂體、甲狀腺、胸腺、肺、心臟、肝、脾、腎、腎上腺、胃、十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸、胰、腸系膜淋巴結、卵巢、子宮、睪丸、附睪、前列腺、膀胱。

1.5統計學方法" 采用SPSS 13.0統計軟件進行分析。計量資料使用（x±s）表示，采用t檢驗或方差分析，進行一個或多個實驗組與陰性對照組之間均數比較。分類資料采用Fisher精確分布檢驗、？字2檢驗、秩和檢驗；等級資料采用Ridit分析、秩和檢驗等，P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1動物一般臨床狀況" 各試驗組大鼠一般生理體征、行為表現、外觀、皮毛、黏膜、分泌物、大小便等均未見異常，試驗期間動物無死亡。

2.2試驗期間大鼠體重、飼料攝食量和食物利用率的變化" 各劑量組大鼠體質量總增重、總攝食量和總食物利用率指標與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.3血常規、凝血指標" 雌性高劑量組凝血酶原時間與陰性對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），但在本實驗室檢測正常值范圍內，無生物學意義。其余各劑量組各血液學指標與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

2.4血液生化指標" 雌性高劑量組谷氨酰轉肽酶與陰性對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其余各劑量組各項生化指標與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

2.5臟器重量、臟/體比值" 各劑量組臟器指標與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），表明該受試樣品90 d經口毒性試驗臟器重量、臟/體比值指標正常，見表4、表5。

2.6病理學檢查結果" 大鼠陰性對照組與高劑量組動物臟器病理切片檢查發現有少數動物出現肝、肺和胰腺輕微病理改變，見圖1。

2.6.1肺和支氣管" 雌、雄性陰性對照組和雌、雄高劑量組各有1例動物見部分支氣管周圍炎細胞浸潤或局部肺間質炎細胞浸潤。

2.6.2肝臟" 雄性陰性對照組和高劑量組各1例動物可見肝小葉周邊部部分肝細胞呈輕度空泡變性。

2.6.3胰腺" 雄性陰性對照組和高劑量組各1例動物胰腺外分泌部見少量脂肪細胞浸潤。

2.6.4其他" 其余陰性對照組與高劑量組大鼠的腦、垂體、甲狀腺、胸腺、肺、心臟、肝、脾、腎、腎上腺、胃、十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸、胰、腸系膜淋巴結、卵巢、子宮、睪丸、附睪、前列腺、膀胱組織病理學觀察結果大致相同，未見與受試物有關的病理改變。

3討論

牛大力是廣東和廣西的本地藥材，已被列入《廣東省中藥材標準》和《廣西省中藥材標準》，這說明它具有較高的質量控制水平和臨床應用價值。在我國，牛大力作為傳統藥用植物已有一千多年歷史，隨著現代醫藥科學技術水平的發展，開展牛大力等傳統藥用植物的安全性評價研究，是合理利用中藥資源的重要環節。

亞慢性經口毒性試驗結果顯示，大鼠一般臨床觀察未見異常，試驗期間無動物死亡，牛大力對大鼠體重、攝食量、食物利用率、血常規、血清生化指標、臟器重及臟/體比無明顯影響。雌性高劑量組凝血酶原時間與陰性對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），但在本實驗室檢測正常值范圍內，無生物學意義。病理學檢查未見受試物引起的特殊病理學改變。牛大力提取物濃縮液對雌雄性大鼠無亞慢性毒性，未觀察到損害作用的劑量為7.73 g/（kg·bw），折算成牛大力干品劑量為75.00 g/（kg·bw），牛大力干品人體推薦每日服用量為15 g/d，未觀察到損害作用的劑量相當于人體推薦每日服用量的300倍。本研究團隊前期已完成牛大力提取物濃縮液急性經口毒性試驗、遺傳毒性試驗，急性經口毒性試驗結果表明牛大力提取物濃縮液20.0 g/（kg·bw）劑量組未觀察到小鼠出現中毒反應和死亡，獲得雌雄性小鼠LD50＞20.0 g/（kg·bw），相當于受試物人體推薦每日服用量的777倍。遺傳毒性試驗中小鼠紅細胞微核試驗、體外哺乳類細胞染色體畸變試驗、細菌回復突變試驗，結果均為陰性[14]。本研究采用的牛大力濃縮液是先后用50%乙醇和水對牛大力新鮮根進行多次熱回流提取，合并濾液濃縮制得的浸膏。該提取方法操作簡便高效，適合獲取牛大力多種活性成分，并為牛大力的毒性、功能研究和藥效評價提供有效的試驗材料。

目前對牛大力的安全性評價研究較為有限。楊增艷等[15]對小鼠最大耐受量的測定，其研究結果顯示牛大力水提物的小鼠最大耐受量大于1000 g/（kg·bw），相當于人體推薦每日服用量的110倍；牛大力醇提物的小鼠最大耐受量大于1700 g/（kg·bw），相當于人體推薦每日服用量的186倍。在實驗中，受試動物未出現任何中毒癥狀，也沒有發生死亡病例，表明牛大力具有較高的安全性且沒有明顯毒副作用。陳曉白等[16]應用單細胞凝膠電泳技術，進一步在細胞水平上證實了牛大力在推薦量范圍內對小鼠肺、腎、肝、睪丸細胞的DNA均未見明顯損傷。

本研究結果顯示，雌性高劑量組谷氨酰轉肽酶（GGT）與陰性對照組比較下降，差異有統計學意義（P＜0.05），雌性高劑量組ALT、AST與陰性對照組比較下降，差異無統計學意義（P＞0.05），但這三種肝臟酶指標變化趨勢一致，且本研究肝臟病理學檢查未見明顯不良反應，間接說明牛大力具有護肝作用。GGT、ALT和AST的降低可能提示牛大力有輕度負調控肝臟代謝酶的作用，適度的負調控可能降低肝臟負荷，從而起到保護肝臟的功效，這與周添濃等[17]、曹志方等[18]關于牛大力對小鼠急性肝損傷的保護作用研究結果一致。牛大力具有一定護肝功效可能與牛大力中多糖和黃酮類成分對肝細胞功能和結構有保護作用有關[19，20]，本研究可為牛大力的護肝功效的進一步開發利用提供參考。

綜上所述，在本試驗條件下，確定受試樣品牛大力對雌、雄性大鼠的未觀察到有害作用的劑量均為75.00 g/（kg·bw），未見亞慢性毒性。后續還需繼續從多方面開展研究以完善其毒理學和藥效學數據庫，為牛大力的臨床應用提供科學參考。

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收稿日期：2023-08-24；修回日期：2023-09-20

編輯/肖婷婷