HPLC法測定十三味逐瘀合劑中游離大黃酚含量

【摘要】 目的 建立十三味逐瘀合劑中大黃酚高效液相含量測定的方法。方法 采用高效液相色譜法（HPLC法）對十三味逐瘀合劑中游離大黃酚含量進行測定，從提取溶劑、取樣量、提取時間等影響因素中選出最優條件，建立完整的含量測定方法。結果 用thermos C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；以甲醇-0.1%磷酸（75∶25，V/V）為流動相，采用等度洗脫法，254 nm波長的色譜條件；以甲醇為浸膏提取溶劑，超聲30 min的提取方法；大黃酚質量濃度在1.63～16.32 μg/mL（R2=0.9995）范圍內具有良好的線性關系；平均回收率為104.17%；測得十三味逐瘀合劑中游離大黃酚平均含量為15.32 μg/mL。結論 本實驗所建立的方法操作簡單，專屬性強，重現性好，可用于十三味逐瘀合劑中游離大黃酚的含量測定。

【關鍵詞】 十三味逐瘀合劑；含量；大黃酚；高效液相色譜法

中圖分類號：R927.2 文獻標志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.01.010

Determination of free chrysophanol content in Shisanwei Zhuyu Mixture by HPLC

DENG Fengyun1a ， WANG Jianfang1a， WU Xianxing1b， WEI Xian2， LUO Shiji1c， JIANG Pan1a

【Abstract】 Objective To establish a method for the determination of high performance liquid phase content of chrysophanol in Shisanwei Zhuyu Mixture. Methods High performance liquid chromatography （HPLC） method was used to quantify the concentration of free chrysophanol in Shisanwei Zhuyu Mixture. The optimal conditions were selected from influencing factors such as extraction solvent， sampling volume， and extraction time to establish complete content determination method. Results Chromatography was performed on a thermos C18 column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） using a mobile phase of methanol-0.1% phosphoric acid （75∶25， V/V） with isocratic elution and a wavelength of 254 nm. The extraction method was performed using methanol as the solvent and ultrasound for 30 minutes. The mass concentration of chrysophanol exhibited good linearity in the range of 1.63-16.32 μg/mL （R=0.9995）. Average recovery rate was 104.17%， and the average content of free chrysophanol in Shisanwei Zhuyu Mixture was measured to be 15.32 μg/mL. Conclusion The method established in this experiment is simple， specific and reproducible， and can be used for the determination of free chrysophanol in Shisanwei Zhuyu Mixture.

【Keywords】 Shisanwei Zhuyu Mixture; content; chrysophanol; high performance liquid chromatography （HPLC）

十三味逐瘀合劑是在百色市中醫醫院名老中醫協定處方的基礎上開發而來，處方由酒制大黃、柴胡、川芎、桃仁、紅花、天花粉、當歸、甘草、延胡索、土鱉蟲、茯苓、澤瀉、桔梗十三味中藥組成，具有蕩滌凝瘀敗血、活血化瘀［1］、消腫止痛［2］等作用，臨床主要用于治療肋骨骨折并胸腔積液。處方中，大黃、柴胡為君藥，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經、疏肝行氣等功效［3-4］，兩藥合用，一升一降，以攻散脅下之瘀滯［5］；而桃仁、紅花為臣藥，具有活血化瘀、消腫止痛的功效［6］；川芎和土鱉蟲可活血祛瘀［7-8］，當歸補血活血，天花粉既能入血分助諸藥而消淤散結，又可清熱潤燥，延胡索行氣止痛［9］，茯苓、澤瀉、桔梗均可利水消腫、通調水道［10］，以上共為佐藥；甘草可緩急止痛［11］，調和諸藥，是為使藥。處方中君臣佐使的相輔相成，使十三味逐瘀合劑功效極佳。我國藥典中記載大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.、唐古特大黃 Rheum tanguticum Maxim. ex Bal？.或藥用大黃 Rheum officinale Bail1.的干燥根和根莖［12］。大黃的化學成分主要包含蒽醌衍生物、番瀉葉苷 Ａ、Ｂ、Ｃ等，此外還含有鞣質類、有機酸類、揮發油類及植物甾醇等［13-14］。而蒽醌類是其主要的藥理活性成分，分別以游離型和結合型存在，游離型有大黃素、大黃酚、大黃酸等［15］。高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）具有精密度高、重復性好、分辨度高等優點［16］；故本課題運用高效液相色譜法進行游離大黃酚的含量測定，對十三味逐瘀合劑的質量標準的研究進行初步探索。

1 實驗試劑與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，型號Agilent 1260）；十萬分之一電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，型號XS205DU］；數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號KQ-500DB）；數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司，型號HH-2）；20L超純水儀（成都優越科技有限公司，型號CD-UPH-II-20 L）。

1.2 試劑

試劑均為色譜純，甲醇（成都市科隆化學品有限公司2021102601）；磷酸（成都金山化學試劑有限公司20210522）；超純水。對照品：大黃酚對照品（純度：HPLC≥98％；批號DST210425-032；廠家：成都樂美天醫藥科技有限公司）。供試品：十三味逐瘀合劑（批號：20220317，20220318，20220319）為本實驗室根據處方自行制備。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為thermos C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），以甲醇-0.1%磷酸（75∶25，V/V）為流動相，等度洗脫，流速為1.0 mL/min；檢測波長254 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL［5］。

2.2 溶液的配制

2.2.1 十三味逐瘀合劑的制備方法

將柴胡、川芎、桃仁、紅花、天花粉、當歸、甘草、延胡索、土鱉蟲、茯苓、澤瀉、桔梗等藥材按處方配比共100 g，加藥材重量的8倍水煎煮20 min，加入大黃后再煎煮10 min，過濾，藥渣再加入8倍水煎煮30 min。將兩次煎煮所得煎煮液混合即得。

2.2.2 對照品溶液的制備

稱取大黃酚對照品8.16 mg，精密稱定，置于50.00 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度線，稱重，超聲30 min，再用甲醇滴加至刻度線，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，制成每1 mL含大黃酚163.2 μg的對照品溶液，備用。使用時用甲醇稀釋成不同濃度的標準溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

浸膏得率：將十三味逐瘀合劑（批號：20220317，20220318，20220319）各10 mL，置蒸發皿中，水浴蒸干后置烘箱中，105 ℃干燥至恒重，計算三批樣品平均得率為23.57%。量取十三味逐瘀合劑20 mL置蒸發皿中，水浴蒸干后得浸膏。將浸膏研細，稱取浸膏0.8 g，精密稱定，置于10.00 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度線，稱重，超聲30 min，再用甲醇滴加至刻度線，制成每1 mL約含浸膏0.08 g的供試品溶液，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，備用。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備

按處方比例稱取缺大黃的其他藥材，按“2.2.1”項下制備方法制備大黃陰性樣品，按照“2.2.3”項下制備方法制備陰性樣品溶液，備用。

2.2.5 空白溶劑的制備

取甲醇適量，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，備用。

2.3 系統適應性實驗

精密量取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液、色譜甲醇各10 μL，按照“2.1”項下的色譜條件測定峰面積，記錄色譜圖。由圖譜數據可知，在該色譜條件下，大黃酚的特征吸收峰與其他吸收峰均能較好分離，大黃酚在14 min附近出現特征吸收峰，無干擾；陰性樣品無干擾峰；溶劑無干擾峰。結果見圖1-圖4。

2.4 單因素實驗

2.4.1 提取溶劑

主要考察不同的提取溶劑對浸膏中大黃酚提取程度的差異，本實驗采用三種提取溶劑進行考察，方法如下：取十三味逐瘀合劑浸膏0.8 g三份，精密稱定，分別置于3個10.00 mL容量瓶中，分別加入甲醇、甲醇-水（80∶20，V/V）、甲醇-水（60∶40，V/V）至刻度線，稱重，超聲30 min，再用相同溶劑滴加至刻度線，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，按照“2.1”項下的色譜條件測定峰面積，每組進樣兩次，并記錄峰面積。由實驗結果可知，三種溶劑中甲醇提取大黃酚的提取率最高，故選擇甲醇作為提取溶劑。實驗結果見表1。

2.4.2 取樣量

主要考察不同的取樣量對實驗結果的影響，本實驗采用三種濃度進行考察，方法如下：

稱取十三味逐瘀合劑浸膏0.4 g，0.8 g，1.2 g，精密稱定，分別置于3個10.00 mL容量瓶中，分別加入甲醇至刻度線，稱重，超聲30 min，再用甲醇滴加至刻度線，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，按照“2.1”項下的色譜條件測定峰面積，每組進樣兩次，記錄峰面積。實驗結果見表2，各取樣量HPLC圖見圖5-圖7。由實驗結果及HPLC圖可知，取樣量為0.8 g提取較為完全，峰形較佳且分離度較好，故選用0.8 g樣品作為取樣量。

2.4.3 提取時間

主要考察不同的提取時間對有效成分提取程度的差異，本實驗采用三種不同的提取時間進行考察，方法如下：取十三味逐瘀合劑浸膏0.8 g三份，精密稱定，分別置于三個10.00 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度線，稱重，分別超聲10 min、20 min、30 min，再用甲醇滴加至刻度線，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，按“2.1”項下的色譜條件測定大黃酚峰面積，每組進樣兩次。由實驗結果可知，超聲時間對大黃酚提取成分程度沒有明顯差異，為提取完全，故選擇超聲30 min作為提取方式。由單因素實驗結果可知，對浸膏提取時，提取溶劑為甲醇，取樣量為0.8 g，提取時間為30 min時，對大黃酚的提取較為完全，故采用此方法進行溶液的制備。實驗結果見表3。

2.5 標準曲線制備和線性關系考察

分別配制16.32 μg/mL，8.16 μg/mL，6.53 μg/mL，3.26 μg/mL，1.63 μg/mL的對照品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件測定峰面積，大黃酚進樣濃度為橫坐標，并以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算的回歸方程Y=59.366 X-30.522，R2=0.9995，結果顯示大黃酚在1.63～16.32 μg/mL范圍內具有良好的線性關系。標準曲線見圖8。

2.6 精密度實驗

精密量取大黃酚對照品溶液400 μL，置于10.00 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度線，稱重，超聲30 min，再用甲醇滴加至刻度線，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，按照“2.1”項下的色譜條件測定峰面積，連續測定6次，記錄峰面積，并計算出6次實驗的RSD值為0.24%，小于2%，結果表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性實驗

取同一供試品溶液，室溫下放置0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h后，按照“2.1”項下的色譜條件測定峰面積，每組進樣兩次，記錄峰面積，計算其RSD值為0.23%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.8 重復性實驗

稱取十三味逐瘀合劑（批號：20220317），按“2.2.3”項下制備浸膏。稱取該浸膏0.8 g，共6份，精密稱定，分別置于6個10.00 mL容量瓶中，分別加入甲醇至刻度線，稱重，超聲30 min，再用甲醇滴加至刻度線，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，按照“2.1”項下的色譜條件測定峰面積，每組進樣兩次，記錄峰面積，計算大黃酚的含量，得RSD值為1.80%，小于2%。結果表明該方法重復性良好。實驗結果見表4。

2.9 加樣回收實驗

取6份已知含量的十三味逐瘀合劑（批號：20220317）的浸膏0.4 g，精密稱定，分別置于6個10.00 mL容量瓶中，精密量取含大黃酚26.01 μg的對照品溶液，分別加入以上6份供試品浸膏中，分別加入甲醇至刻度線，稱重，超聲30 min，再用甲醇滴加至刻度線，經0.45 μm微孔濾膜濾過，按照“2.1”項下的色譜條件測定峰面積，計算回收率和RSD。最終得大黃酚的平均加樣回收率為104.17%，RSD值為1.91%，小于2%。結果表明該方法回收率良好。實驗結果見表5。

2.10 樣品含量測定

取3批十三味逐瘀合劑（批號：20220317，20220318，20220319），按“2.2.3”項制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行進樣，計算其含量，結果3批樣品浸膏中大黃酚的平均含量分別為65.03 μg/g，64.38 μg/g，65.48 μg/g，均值為64.96 μg/g，根據浸膏得率換算，每1 mL十三味逐瘀合劑中平均含大黃酚（C15H10O4）為15.32 μg。

3 討 論

本次實驗最終確定了十三味逐瘀合劑中游離大黃酚用HPLC法含量測定的最佳條件：色譜柱為thermos C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），以甲醇-0.1%磷酸（75∶25，V/V）為流動相，等度洗脫，流速為1.0 mL/min；檢測波長254 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL；浸膏取樣量為0.8 g；提取溶劑為甲醇；提取方式為超聲30 min。實驗結果顯示，所建立的含量測定方法能有效地分離出大黃酚成分，且本方法的專屬性、線性關系、精密度、穩定性、重復性、回收率均良好且符合中國藥典的規定，故將此方法用于十三味逐瘀合劑中游離大黃酚的含量測定。

在HPLC測定大黃酚含量過程中，進行流動比例考察時，發現比例為甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20，V/V）時［17］，分離度較差，目標成分大黃酚的吸收峰與雜質峰難以分開，比例為甲醇-0.1%磷酸溶液（75∶25，V/V）時分離度好，無雜質干擾。在系統性實驗中，發現大黃酚對照品HPLC圖稍有拖尾現象，可能是因為色譜柱使用時間較長導致色譜柱性能下降。在取樣量單因素考察中，發現浸膏取樣量在1.2 g時，大黃酚的吸收峰位置往后移，洗脫時間延長，可能與環境溫度及流動相中有機相與水相的比例有關。

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（收稿日期：2023-10-08 修回日期：2023-12-20）

（編輯：王琳葵 梁明佩）

基金項目：百色市科學研究與技術開發計劃項目（百科20213249）

第一作者簡介：鄧鳳云，男，副主任藥師，醫學學士，研究方向：醫院藥學、醫院制劑開發。E-mail：dfy948@163.com

［本文引用格式］鄧鳳云，王建芳，吳顯興，等.HPLC法測定十三味逐瘀合劑中游離大黃酚含量［J］.右江醫學，2024，52（1）：51-56.