近三倍非整倍體紫錐菊的染色體加倍

摘要" ［目的］建立高效的紫錐菊（Echinacea purpurea L.）非整倍體離體誘導加倍的方法，為紫錐菊育種和遺傳學研究提供創(chuàng)新性種質。［方法］采用離體誘導方法，比較4個紫錐菊近三倍非整倍體株系（C31，2n=31；C32-1，2n=32；C32-2，2n=32；C34，2n=34）在不同前處理持續(xù)時間、不同秋水仙素處理濃度和處理持續(xù)時間條件下的加倍誘導效果的差異。［結果］4個非整倍體株系的染色體加倍效果均隨預處理時間的延長、秋水仙素處理濃度的提高及處理時間的延長而呈先上升后下降的趨勢，并分別在預處理4 d、秋水仙素濃度120 mg/L、處理時間25 d時，獲得最佳的誘變效果。根據根尖染色體計數鑒定的結果，由近三倍非整倍體C31、C32-1、C32-2、C34株系加倍獲得的近六倍非整倍體染色體數目分別為2n=62、2n=64、2n=64、2n=68，其植株形態(tài)與原植物相比，均表現為生長緩慢，植株矮化，葉片增厚、反卷、脆硬，葉表皮毛茸增長、加密，葉柄縮短，生根緩慢，根短而粗，側根少甚至無等特點。［結論］秋水仙素可成功誘導近三倍非整倍體紫錐菊加倍成為近六倍的高倍非整倍體；秋水仙素誘導的非整倍體染色體加倍和整倍體相同，即每條染色體都實現了加倍，不受非整倍體中各號染色體原來數量不盡相同所影響。

關鍵詞" 近三倍非整倍體；近六倍非整倍體；紫錐菊；染色體加倍

中圖分類號" S682.1+1" 文獻標識碼" A" 文章編號 "0517-6611（2024）05-0189-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.05.045

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Chromosome Doubling of Near-triplex Aneuploids in Echinacea purpurea

LI Xing-lian1， JIANG Wei-zhen2， DAI Qian1 et al

（1.College of Life Sciences，South China Agricultural University， Guangzhou，Guangdong 510642;2.College of Traditional Chinese Medicine Resources， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou，Guangdong 510006;3.Southern Medicine Research Institute of Yunfu，Yunfu，Guangdong 527300）

Abstract" ［Objective］To establish effective methods for inducing chromosome-doubling of aneuploids in E. purpurea， and provide innovated germplasm for breeding and genetic study of E. purpurea.［Method］In vitro methods were used for comparing the effects of different pre-culture treatment duration， concentrations of colchicine for the treatment and the treating duration on the induction of chromosome doubling among four lines of near-triplex aneuploids of E. purpurea （C31， 2n=31;C32-1， 2n=32， C32-2，2n=32;C34， 2n=34） .［Result］The chromosome doubling effects of the four aneuploid lines were all showed a trend of first increasing and then decreasing with the increase of pre-culture treatment duration， colchicine concentration and treatment duration， and the conditions of 4 days pre-culture treatment， treatment with 120 mg/L colchicine for 25 days were suitable for induction of chromosome doubling of the four near-triplex aneuploids.According to the results of root tip chromosome counting identification， chromosome numbers counted in the root tip cells of the near-hexaploid aneuploids obtained by doubling strains C31， C32-1， C32-2 and C34 were 2n=62， 2n=64， 2n=64 and 2n=68， respectively， and the morphology of all near-hexaploid compared with its original plant， was characterized by slow growth， dwarfing， leaf blade thickening， revolute， brittle and hard， leaf epidermal hairs growth， shortened petiole， slow rooting， short and thick roots， few or no lateral roots， etc.［Conclusion］Near-triplex aneuploids could be induced to double the chromosome numbers and became near-hexaploid aneuploid by the treatment of colchicine in vitro， and the results were just like that of euploids. That is to say， all the chromosomes were doubled with no affects from the differences in the chromosome numbers in the original aneuploids.

Key words" Near-triplex aneuploid;Near-hexaploid aneuploid;Echinacea purpurea;Chromosome doubling

基金項目" 云浮市科技局產學研科技攻關項目（2021A090201）。

作者簡介" 黎幸連（1988—），女，廣東江門人，碩士研究生，研究方向：紫錐菊種質資源創(chuàng)制。*通信作者，研究員，博士生導師，從事紫錐菊種質資源創(chuàng)制及新品種選育研究。

收稿日期" 2023-04-15

紫錐菊（Echinacea purpurea L.）為原產于美洲的一種菊科（Asteraceae）松果菊屬（Echinacea）多年生草本植物［1］，因其在抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫強化、抗菌消炎等方面具有良好的藥用功效而穩(wěn)居世界銷量最大的植物源藥材前3位［2-5］。紫錐菊屬于蟲媒異花授粉植物，且自交不親和，因其后代雜合性高，不同基因型的紫錐菊表型各異，有效成分含量參差不齊，導致其藥材、制劑質量不穩(wěn)定，經濟效益低［6-8］。在自然界中，多倍體不僅是物種形成與進化的主要途徑之一［9-11］，同時也是育種工作中提高作物品質和產量的重要手段之一。大量的研究發(fā)現，在多倍體形成的初期，往往因減數分裂異常配對或不均等分離而產生一定比例的非整倍體個體［12-15］。例如，在擬南芥（Arabidopsis" thaliana）中，其三倍體、異源四倍體和同源四倍體的自交后代中，均可觀察到大量的可育非整倍體個體［12，16-18］。在新合成的異源四倍體油菜早期世代中同樣發(fā)現了大量的包括染色體結構變異和數目變異的非整倍體個體［13］；在異源六倍體小麥形成初期，隨著植物物種倍性的增加，非整倍體出現的頻率也隨之提高［19］。這些研究結果表明植物多倍化不僅是產生非整倍體的基礎之一，同時倍性的增加也增強了其基因組對非整倍體的耐受性，提高獲得非整倍體的概率，增加獲得非整倍體的類型。

非整倍體是指生物有機體的染色體組由于增加或減少一條或若干條染色體，或者片段染色體的獲得或丟失，而形成的染色體組不平衡的個體或群體。研究表明，這種一條或若干條染色體劑量的改變易對生物個體產生顯著的表型變異［12，20-21］。有研究發(fā)現，曼陀羅的每一種類型的初級三體所呈現的果實形態(tài)均略有不同［22］；擬南芥1號、3號、4號、5號染色體劑量的改變對其莖的直徑、空腋率以及蓮座葉產生顯著影響［12］；普通煙草每一種單體與正常雙體相比，其花冠和植株大小、發(fā)育速度、葉形以及葉綠素濃度等都產生了顯著的表型變異［23］；在紫錐菊中，染色體數目接近于三倍體的非整倍體個體（2n=31、32、34）與正常三倍體相比，其花期、花莖硬度、葉綠素含量、植株干重以及有效成分含量等均產生了顯著變化［24］。Li等［25］研究發(fā)現，在紫錐菊二倍體與三倍體雜交后代中，染色體數目介于二倍體與三倍體之間的部分非整倍體的有效成分含量顯著高于其親本植株，其中非整倍體A2（2n=24）的菊苣酸含量是其親本二倍體和三倍體的近3倍。這些結果表明通過人工調控植物若干染色體的劑量水平，可實現優(yōu)異農藝性狀的品種改良，為植物育種工作提供了新思路。

截至目前，通過人工誘導的方法先后獲得了紫錐菊單倍體［26］、四倍體［27］、六倍體［28-29］、八倍體［30］，并通過二倍體與三倍體雜交獲得大量染色體數介于二倍體與三倍體之間的可育的、形態(tài)發(fā)育正常的非整倍體個體，其中部分非整倍體的有效成分含量顯著高于其親本植株［25］。然而，有關非整倍體紫錐菊的加倍誘導以及獲得有活力的高倍性非整倍體等相關方面的研究目前鮮見報道。因此，該研究以同源四倍體紫錐菊與二倍體雜交獲得的染色體數目接近于三倍體的非整倍體為材料，采用離體誘導的方法，探討秋水仙素不同處理濃度、處理時間以及預處理時間對非整倍體紫錐菊加倍效果的影響，為獲得各種類型核型組成的高倍性非整倍體紫錐菊及其品種改良提供理論依據。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

該試驗以二倍體和四倍體紫錐菊雜交鑒定獲得的近三倍非整倍體個體的無菌苗為誘導材料，其原始二倍體種子購自美國馬薩諸塞州諾頓一家名為Plantation Products的園藝公司。

1.2" 試驗方法

1.2.1" 無菌材料的繁殖。

將鑒定獲得的近三倍非整倍體無菌苗C31、C32-1、C32-2、C34在無菌條件下切取葉柄，接種于繁殖培養(yǎng)基上（MS +0.3 mg/L BA+0.01 mg/L NAA+0.1 g/L 肌醇+30 g/L 蔗糖+4.5 g/L 瓊脂，pH=5.8），于溫度為（25±1）℃、光照強度為 1 000 lx、光照時間為 12 h 的條件下培養(yǎng)45 d，獲得大量的無菌苗作為多倍體誘導材料。

1.2.2" 誘導方法。

將在無菌條件下切取的近三倍非整倍體植株的葉柄接種于不含秋水仙素的再生培養(yǎng)基上（MS +0.4 mg/L BA+0.01 mg/L NAA+0.1 g/L 肌醇+30 g/L 蔗糖+5.0 g/L 瓊脂，pH=5.8）預處理0～8 d（每2 d為一個時間梯度）后，將外植體轉接至添加120 mg/L秋水仙素的再生培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)25 d；將預處理4 d后的葉柄外植體轉接至添加不同濃度秋水仙素（0、40、80、120、160、200 mg/L）的再生培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)25 d；將預處理4 d的葉柄外植體轉接至添加120 mg/L秋水仙素再生培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)0～35 d（每5 d為一個時間梯度）。培養(yǎng)溫度為 （25±1）℃，光照強度為 1 000 lx，光照時間為12 h。

1.2.3" 誘導不定芽再生。

外植體經秋水仙素處理后轉接至無添加秋水仙素的普通再生培養(yǎng)基上，于溫度為 （25±1）℃、光照強度為 1 000 lx、光照時間為12 h的條件下誘導不定芽再生。

1.2.4" 不定芽生根和倍性鑒定。

將上述誘導獲得的不定芽轉接至生根培養(yǎng)基上（MS+0.01 mg/L NAA+0.1 g/L 肌醇+30 g/L 蔗糖+4.5 g/L 瓊脂，pH=5.8），于溫度為 （25±1）℃、光照強度為1 000 lx、光照時間為 12 h 的條件下誘導產生不定根，待根生長至1～2 cm 時，切取根尖進行染色體制片，于顯微鏡下觀察、拍照、染色體計數，篩選出加倍成功的近六倍非整倍體個體。

2" 結果與分析

2.1" 紫錐菊的二倍體與同源四倍體雜交后代群體的倍性鑒定

該試驗共無菌萌發(fā)了由紫錐菊二倍體和同源四倍體雜交獲得的D11和T71株系82粒種子，其中D11株系54粒，T71株系28粒。如表1所示，紫錐菊二倍體與同源四倍體雜交獲得的后代群體萌發(fā)率均較低，其中D11株系為35.19%，T71株系則僅為7.14%，明顯低于D11株系，表明紫錐菊二倍體與同源四倍體雜交后代中D11株系對染色體數目變異的耐受程度明顯高于T71株系。倍性鑒定結果顯示，D11株系共鑒定獲得3個非整倍體，其染色體組成為2n=32和2n=34（表1，圖1B、C和D）；T71株系僅鑒定獲得1個非整倍體，其染色體組成為2n=31（表1，圖1A）。這些結果表明紫錐菊對染色體數目的變異具有較高的耐受性。

2.2" 不同預處理時間對非整倍體紫錐菊染色體加倍的影響

從圖2可以看出，4個非整倍體株系在120 mg/L的秋水仙素處理條件下，其誘導獲得的總植株數隨預處理時間的延長總體呈逐漸上升趨勢，但其加倍植株數則呈先上升后下降的趨勢，并且4個株系均在預處理4 d時獲得的加倍效率最高，表明在秋水仙素處理前進行適當的離體培養(yǎng)可顯著提高非整倍體紫錐菊的加倍效率。各株系間比較發(fā)現，C32-1株系的外植體再生效果顯著高于其他3個株系，當預處理時間延至8 d時，其總植株數可達36株，但其加倍植株數則僅為4株，加倍效率為11%，明顯低于C31、C32-2、C34株系，其加倍效率分別為25%、54%、31%，表明不同核型組成的非整倍體對離體培養(yǎng)條件的適應性存在較大差異，其中C32-2株系適應性最強，其次分別為C34gt;C31gt;C32-1。

2.3" 不同秋水仙素濃度處理對非整倍體紫錐菊染色體加倍的影響

從圖3可以看出，隨著秋水仙素濃度的不斷提高，4個株系誘導獲得的總植株數均呈不斷下降趨勢，但其加倍植

株數則均呈先上升后下降的趨勢。當秋水仙素濃度為120 mg/L時，4個株系獲得的加倍植株數最多，而當濃度高于120 mg/L時，不僅顯著抑制了外植體的再生效果，同時降低了非整倍體的誘導加倍效果，表明非整倍體紫錐菊離體誘導加倍的最適秋水仙素濃度為120 mg/L。各株系間比較發(fā)現，在120 mg/L秋水仙素處理條件下，C31株系誘導獲得的加倍植株數最多，為23棵，但其加倍效率明顯低于C32-2株系，僅為51%，而C32-2株系則高達73%，其他2個株系C32-1和C34分別為41%和48%。這些結果表明不同核型組成的非整倍體外植體對秋水仙素的敏感程度存在較大差異，其中C32-2株系最為敏感，最易獲得加倍植株，其次依次為C31、C34和C32-1株系。

2.4" 秋水仙素不同處理時間對非整倍體紫錐菊染色體加倍的影響

從圖4可以看出，當秋水仙素濃度為120 mg/L時，

隨著處理時間的延長，4個株系外植體再生效率均呈不斷下

降趨勢，但其加倍植株數則均呈先上升后下降的趨勢，其中

C31、C32-1和C34株系在秋水仙素處理25 d時，獲得誘變株的概率最高，而C32-2株系則在處理20 d時即可獲得最高的加倍效果，表明在秋水仙素濃度為120 mg/L條件下，適當延長處理時間可獲得紫錐菊更高的加倍效率，但不同核型株系對秋水仙素處理時間的要求存在一定差異。各株系間比較發(fā)現，C31株系誘導獲得加倍植株所需的時間至少超過10 d，明顯高于其他3個株系，其中C32-1株系在5 d時即可誘導獲得加倍植株，而C32-2和C34株系則均為5～10 d，表明在秋水仙素濃度為120 mg/L條件下，C32-1株系對秋水仙素的響應速度最快，其次依次為C32-2、C34和C31株系。

2.5" 近六倍紫錐菊非整倍體的倍性鑒定

從圖5可以看出，各加倍株系與其對應的近三倍非整倍體的組培苗在外部形態(tài)特征上表現出明顯差異。與近三倍非整倍體相比，其加倍后的變異株的組培苗表現為生長緩慢，植株矮化，葉片厚度增加、反卷、脆硬，葉表皮毛增長、加密，葉柄較短，生根緩慢，根短而粗，側根少甚至沒有等特點。根尖染色體計數鑒定結果顯示，近三倍非整倍體C31、C32-1、C32-2和C34株系的根尖細胞染色體數分別為2n=31（圖5A）、2n=32（圖5B）、2n=32（圖5C）和2n=34（圖5D），其對應的加倍后獲得的植株經根尖細胞染色體鑒定為近六倍非整倍體，分別為2n=62（圖5a）、2n=64（圖5b）、2n=64（圖5c）和2n=68（圖5d）。

3" 討論與結論

植物在形成多倍體初期，因基因組的呈倍性增加而導致在減數分裂過程中出現染色體配對紊亂、不均等分離等現象，從而產生一定比例的非整倍體個體［12-15］，例如異源四倍體黃瓜［31］、異源六倍體小麥［19］、異源六倍體擬南芥［32］、異源四倍體煙草［33］等均發(fā)現不同比例的染色體數目變異和結構變異的非整倍體。這些研究結果表明異源多倍體在合成初期具有染色體不穩(wěn)定性，導致基因組結構的改變，從而影響其表型特征。除了異源多倍體之外，在同源多倍體后代中也發(fā)現了大量的非整倍體個體的存在，例如，在紫錐菊、百合、黃瓜中，其同源三倍體與二倍體雜交后代中均可獲得大量的非整倍體個體［25，31，34］。該研究發(fā)現，在同源四倍體紫錐菊與二倍體紫錐菊雜交后代中，獲得了少量的染色體數目接近于三倍體的表型正常、可育的非整倍體個體，分別為2n=31、32和34，并通過秋水仙素離體誘導的方法，首次成功獲得了具有活力的高倍性非整倍體個體，并且每一條染色體不受其原來劑量的影響，均實現了加倍，其加倍后的植株表型與原植物相比，表現為多倍化的典型特征，例如植物生長緩慢、矮化、葉片加厚、根變短而粗等特征。這些結果表明紫錐菊對非整倍體具有高強度的耐受性，并且非整倍體的活力不受其倍性增加的影響。該結果為紫錐菊乃至其他物種的非整倍體研究提供新的思路，為非整倍體促進植物遺傳改良及育種應用提供了相關的參考依據及技術方法。

秋水仙素與組織培養(yǎng)相結合是目前植物多倍體誘導最為常用的一種誘變方法之一，其誘變處理的預培養(yǎng)時間、秋水仙素的濃度和處理時間以及處理方法、材料選擇等決定了最終的誘變效果。秋水仙素因對植物細胞具有很強的毒害性，當其處理濃度過高、時間過長或采用的處理方法不當時均會造成外植體黃化甚至壞死的現象［28，35-37］，相反，當處理的濃度過低或時間過短，則易形成嵌合體或加倍不成功［27，38］，最終影響加倍效果。以往的研究結果顯示，二倍體及四倍體紫錐菊以葉柄為外植體均在秋水仙素濃度為120 mg/L、處理時間為28 d的條件下誘導獲得誘變株的效率最高［27，30］。與這些結果相類似，在該研究中，4個近三倍非整倍體均在秋水仙素濃度為120 mg/L條件下獲得誘變株的概率最高，其中C31、C32-1和C34株系在處理25 d時獲得最高的誘導效率，而C32-2株系最適的處理時間僅為20 d。這些結果表明在離體培養(yǎng)條件下，紫錐菊誘導加倍的最適秋水仙素使用濃度和處理時間不受材料的倍性及染色體組成的影響，其最適濃度和處理時間均分別為120 mg/L和25 d左右。

由于秋水仙素僅對處于分裂期的細胞起作用，因此，在處理前進行適當時間的預培養(yǎng)是提高外植體整體加倍效果的關鍵因素。以往的研究表明，在秋水仙素處理前進行預培養(yǎng)一段時間，一方面，可以誘導外植體脫分化形成分生組織并加速細胞分裂，使外植體細胞處于同一分裂時期［39-40］；另一方面，預處理不僅顯著提高了外植體的存活率和不定芽誘導效率，同時還降低了產生嵌合體或混倍體的概率，提高外植體的誘導加倍效果［35，41］。例如，郭燁等［40］通過細胞學觀察發(fā)現，茶壺棗在預培養(yǎng)8～9 d的條件下，秋水仙素誘導獲得的加倍效果最佳；陳榮等［41］研究發(fā)現觀音蓮的最適預培養(yǎng)時間為6 d;Nilanthi等［27］在進行紫錐菊四倍體誘導時預培養(yǎng)的時間為7 d；該研究發(fā)現，4個近三倍非整倍體紫錐菊株系均在預培養(yǎng)4 d的條件下獲得最高的加倍效果，表明近三倍非整倍體紫錐菊的最適預培養(yǎng)時間為4 d。對于不同倍性間是否存在差異還需做進一步驗證。

在多倍體誘導過程中，選擇合適的倍性鑒定方法是快速、準確地篩選出誘變株，提高工作效率的關鍵環(huán)節(jié)。常見的倍性鑒定方法主要包括形態(tài)學觀察、氣孔特征（保衛(wèi)細胞大小、保衛(wèi)細胞內葉綠體數等）比較、根尖染色體計數以及流式細胞術等［40，42-43］。該研究采用形態(tài)學觀察結合根尖染色體計數的方法對變異株進行倍性鑒定，結果顯示，近三倍非整倍體紫錐菊加倍后，其植株表型特征發(fā)生了顯著的變化，加倍后的培苗表現為生長緩慢，植株矮化，葉片增厚、反卷和脆硬，葉片表皮毛增長、加密，葉柄較短，生根緩慢，根短而粗，側根少甚至沒有等特點，并且根尖染色體計數鑒定的結果與表型鑒定相一致。然而，對于這4個株系的非整倍體的核型特征以及它們加倍后的植株的核型是否發(fā)生了改變則需要使用更精確的鑒定方法，如FISH、GISH、染色體C-分帶、分子標記等，做進一步的核型分析以確定其具體的核型組成。

參考文獻

［1］ 肖培根.國際流行的免疫調節(jié)劑——紫錐菊及其制劑［J］.中草藥，1996，27（1）：46-48.

［2］ BARNES J，ANDERSON L A，PHILLIPSON J D.Herbal medicines［M］.London：Pharmaceutical Press，2007.

［3］ TSAI Y L，CHIU C C，YI-FU C J，et al.Cytotoxic effects of Echinacea purpurea flower extracts and cichoric acid on human colon cancer cells through induction of apoptosis［J］.J Ethnopharmacol，2012，143（3）：914-919.

［4］ CRUZ I，CHEETHAM J J，ARNASON J T，et al.Alkamides from Echinacea disrupt the fungal cell wall-membrane complex［J］.Phytomedicine，2014，21（4）：435-442.

［5］ HOSAMI F，MANAYI A，SALIMI V，et al.The pro-apoptosis effects of Echinacea purpurea and Cannabis sativa extracts in human lung cancer cells through caspase-dependent pathway［J］.BMC Complement Med Ther，2021，21（1）：1-12.

［6］ MCKEOWN K A.A review of the taxonomy of the genus Echinacea［M］//JANICK J.Perspectives on new crops and new uses.Alexandria VA：ASHS Press，1999：482-498.

［7］ WILLS R B H，STUART D L.Alkylamide and cichoric acid levels in Echinacea purpurea grown in Australia［J］.Food Chem，1999，67（4）：385-388.

［8］ LI Q L，CHEN R，CHEN X L，et al.Estimation of the cloning potential in six selected genotypes of purple coneflower（Echinacea purpurea L.）［J］.Biotechnol Biotechnol Equip，2013，27（4）：3911-3917.

［9］ WOLFE K H.Yesterday’s polyploids and the mystery of diploidization［J］.Nat Rev Genet，2001，2（5）：333-341.

［10］ SCHLUETER J A，DIXON P，GRANGER C，et al.Mining EST databases to resolve evolutionary events in major crop species［J］.Genome，2004，47（5）：868-876.

［11］ FAWCETT J A，MAERE S，VAN DE PEER Y.Plants with double genomes might have had a better chance to survive the Cretaceous-Tertiary extinction event［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（14）：5737-5742.

［12］ HENRY I M，DILKES B P，MILLER E S，et al.Phenotypic consequences of aneuploidy in Arabidopsis thaliana［J］.Genetics，2010，186（4）：1231-1245.

［13］ XIONG Z Y，GAETA R T，PIRES J C.Homoeologous shuffling and chromosome compensation maintain genome balance in resynthesized allopolyploid Brassica napus［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（19）：7908-7913.

［14］ SIEGEL J J，AMON A.New insights into the troubles of aneuploidy［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，2012，28（1）：189-214.

［15］ LLOYD A，BOMBLIES K.Meiosis in autopolyploid and allopolyploid Arabidopsis［J］.Curr Opin Plant Biol，2016，30：116-122.

［16］ HUETTEL B，KREIL D P，MATZKE M，et al.Effects of aneuploidy on genome structure，expression，and interphase organization in Arabidopsis thaliana［J］.PLoS Genet，2008，4（10）：1-13.

［17］ WRIGHT K M，PIRES J C，MADLUNG A.Mitotic instability in resynthesized and natural polyploids of the genus Arabidopsis（Brassicaceae）［J］.Am J Bot，2009，96（9）：1656-1664.

［18］ WEI F，ZHANG G S.Meiotically asynapsis-induced aneuploidy in autopolyploid Arabidopsis thaliana［J］.J Plant Res，2010，123（1）：87-95.

［19］ MESTIRI I，CHAGU V，TANGUY A M，et al.Newly synthesized wheat allohexaploids display progenitor-dependent meiotic stability and aneuploidy but structural genomic additivity［J］.New Phytol，2010，186（1）：86-101.

［20］ MAKAREVITCH I，HARRIS C.Aneuploidy causes tissue-specific qualitative changes in global gene expression patterns in maize［J］.Plant Physiol，2010，152（2）：927-938.

［21］ ORR B，GODEK K M，COMPTON D.Aneuploidy［J］.Curr Biol，2015，25（13）：R538-R542.

［22］ BLAKESLEE A F，BELLING J，FARNHAM M E.Chromosomal duplication and Mendelian phenomena in datura mutants［J］.Science，1920，52（1347）：388-390.

［23］ OLMO H P.Genetical studies of monosomic types of Nicotiana tabacum［J］.Genetics，1935，20（3）：286-300.

［24］ 姜偉珍.紫錐菊核型分析和非整倍體栽培評價［D］.廣州：華南農業(yè)大學，2017.

［25］ LI Q L，JIANG W Z，REN Y，et al.In vitro cloning potential and phytochemical evaluations of aneuploid individuals produced from reciprocal crosses between diploid and triploid in Echinacea purpurea L.［J］.Acta Soc Bot Pol，2017，86（3）：1-16.

［26］ ZHAO F C，NILANTHI D，YANG Y S，et al.Anther culture and haploid plant regeneration in purple coneflower（Echinacea purpurea L.）［J］.Plant Cell Tissue Organ Cult，2006，86（1）：55-62.

［27］ NILANTHI D，CHEN X L，ZHAO F C，et al.Induction of tetraploids from petiole explants through colchicine treatments in Echinacea purpurea L.［J］.J Biomed Biotechnol，2009，2009：1-8.

［28］ CHEN X L，CHEN R，LI Q L，et al.Cytological comparison of diploid，triploid，tetraploid and hexaploid in purple coneflower（Echinacea purpurea L.）［C］//International conference on biological，medical and chemical engineering（BMCE2013）.Hong Kong：DEStech Publications，Inc，2013：212-220.

［29］ CHEN X L，ZHANG J J，CHEN R，et al.Comparison among diploid，its colchicine-induced tetraploid and their crossed descendent triploid in purple coneflower（Echinacea purpurea L.）［C］//International conference on biological engineering and biomedicine（BEAB2014）.Yichang：DEStech Publications，Inc，2014.

［30］ DAHANAYAKE N，YANG Y S.In vitro induction of octaploid from colchicine-treated tetraploid petiole explants of purple coneflower（Echinacea purpurea L.）［J］.Trop Agric Res Ext，2013，16（1）：25-30.

［31］ DIAO W P，BAO S Y，JIANG B，et al.Primary trisomics obtained from autotriploid by diploid reciprocal crosses in cucumber［J］.Sex Plant Reprod，2009，22（1）：45-51.

［32］ MATSUSHITA S C，TYAGI A P，THORNTON G M，et al.Allopolyploidization" lays" the" foundation" for evolution" of" distinct" populations：Evidence" from" analysis" of" synthetic" Arabidopsis allohexaploids［J］.Genetics，2012，191（2）：535-547.

［33］ LIM K Y，KOVARIK A，MATYASEK R，et al.Sequence of events leading to near-complete genome turnover in allopolyploid Nicotiana within five million years［J］.New Phytol，2007，175（4）：756-763.

［34］ 曹瀟，崔金騰，張克中，等.三倍體OT百合與二倍體東方百合組間雜交育種［J］.分子植物育種，2017，15（8）：3166-3172.

［35］ 陳榮，朱昌叁，龐正轟.西南樺染色體加倍的影響因子初步研究［J］.亞熱帶植物科學，2014，43（4）：286-288.

［36］ CHUENGPANYA R，CHUENBOONNGARM N，THAMMASIRI K，et al.Investigation of colchicine incubation time on the regeneration rate of Globba williamsiana ‘Dok Khao’［J］.Acta Hortic，2017，1167：149-156.

［37］ TASHMATOVA L V，KHROMOVA T M.Effect of colchicine on meristematic tissues of diploid apple varieties in in vitro culture［J］.BIO Web Conf，2022，47：1-8.

［38］ MARANGELLI F，PAVESE V，VAIA G，et al.In vitro polyploid induction of highbush blueberry through de novo shoot organogenesis［J］.Plants，2022，11（18）：1-10.

［39］ CHAUVIN J E，LABEL A，KERMARREC M P.In vitro chromosome-doubling in tulip（Tulipa gesneriana L.）［J］.J Hortic Sci Biotechnol，2005，80（6）：693-698.

［40］ 郭燁，崔艷紅，孔德倉，等.茶壺棗離體多倍體誘導關鍵技術研究［J］.北京林業(yè)大學學報，2019，41（7）：49-56.

［41］ 陳榮，朱昌叁.預培養(yǎng)時間對觀音蓮染色體加倍的影響［J］.北方園藝，2013（1）：105-107.

［42］ RAO S P，KANG X Y，LI J，et al.Induction，identification and characterization of tetraploidy in Lycium ruthenicum［J］.Breed Sci，2019，69（1）：160-168.

［43］ 羅慶，高建有，李潔維，等.利用流式細胞儀對獼猴桃種質染色體倍性的鑒定［J］.生物學雜志，2022，39（6）：66-72.