湛江地區(qū)羅非魚病原菌分離鑒定及毒力基因檢測

摘要" ［目的］了解湛江市某水產(chǎn)養(yǎng)殖場患病羅非魚病原菌攜帶毒力基因情況。［方法］從10尾患病羅非魚心臟、腸道、脾、肝臟等器官分離細菌，提取分離純化細菌的總DNA，PCR擴增16S rDNA基因后經(jīng)過基因測序鑒定細菌，并利用PCR技術(shù)檢測分離菌株的毒力基因。［結(jié)果］從羅非魚內(nèi)臟中分離的細菌為華納葡萄球菌、大腸桿菌和糞腸球菌，在毒力基因檢測中發(fā)現(xiàn)華納葡萄球菌攜帶毒力基因gap，大腸桿菌攜帶毒力基因pap、afa，糞腸球菌攜帶毒力基因efaA、cylM、cylB。［結(jié)論］該研究結(jié)果可為湛江地區(qū)羅非魚細菌性疾病防控提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞" 羅非魚；病原菌；純化；分離與鑒定；毒力基因

中圖分類號" S941" 文獻標識碼" A "文章編號" 0517-6611（2024）05-0096-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.05.023

開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Isolation， Identification and Virulence Gene Detection of Pathogenic Bacteria from Tilapia in Zhanjiang Area

LUO Shuai-shuai， DING Yue-xia， LIAO Cui-yi et al

（Department of Veterinary Medicine， Binhai Agricultural College， Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong 524088）

Abstract" ［Objective］ In order to understand the virulence genes carried by the pathogenic bacteria of diseased tilapia in an aquaculture farm in Zhanjiang City. ［Method］ The experiment isolated bacteria from 10 diseased tilapia organs such as heart， intestine， spleen， liver， etc.， and the total DNA of bacteria was extracted and purified. After PCR amplification of 16S rDNA gene， the bacteria were identified by gene sequencing， and the virulence genes of the isolated strains were detected by PCR technology. ［Result］ The results showed that the bacteria isolated from tilapia viscera were Staphylococcus warneri， Escherichia coli and Enterococcus faecalis. In the virulence gene detection， it was found that Staphylococcus warneri carried the virulence gene gap;Escherichia coli carried the virulence genes pap and afa;Enterococcus faecalis carried the virulence genes efaA， cylM， and cylB. ［Conclusion］ The research results can provide theoretical basis for the prevention and control of bacterial diseases of tilapia in Zhanjiang area.

Key words" Tilapia;Pathogenic bacteria;Purification;Isolation and identification;Virulence genes

基金項目" 廣東省教育廳2021年度普通高校重點領(lǐng)域?qū)ｍ棧?021ZDZX-4003）；湛江市科技局2021年度省科技專項資金（“大專項+任務(wù)清單”）競爭性分配項目（2021A05231）；茂名實驗室科研啟動項目（2021TDQD002）。

作者簡介" 羅帥帥（1998—" ），男，陜西榆林人，碩士研究生，研究方向：獸醫(yī)藥理學與毒理學。

*通信作者，教授，博士，碩士生導師，從事獸醫(yī)藥理學與毒理學研究。

收稿日期" 2023-04-10

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是獲得動物蛋白的重要來源之一，水生動物中含有多種必需氨基酸和高度不飽和脂肪酸［1］。羅非魚具有生長快、繁殖力強、食性雜、病害少、抗病力強、適應(yīng)性強、肉質(zhì)厚、骨刺少等特點，而且含有豐富的不飽和脂肪酸，是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中的一個重要品種［2］。水產(chǎn)養(yǎng)殖對產(chǎn)量的過高追求往往導致養(yǎng)殖密度過高，超出了水體的承載能力，從而導致養(yǎng)殖環(huán)境惡化，羅非魚的病害發(fā)生率明顯增加［3］。細菌性疾病是制約羅非魚養(yǎng)殖的重要因素之一［4］。大腸桿菌、華納葡萄球菌和糞腸球菌是水產(chǎn)動物的常見條件致病菌［5-8］。大腸桿菌可導致虹鱒魚發(fā)病，病魚表現(xiàn)出的癥狀為體色發(fā)黑，鰓絲蒼白或粉紅，肛門及有的鰭條充血，內(nèi)臟腸、肝、脾等充血和出血［9-10］。葡萄球菌感染致病造成病魚魚眼突出的比例達75%，與鏈球菌病癥狀極其相似［11］。細菌的致病性機理研究主要通過對細菌的毒力基因進行識別，并對其在寄生過程中的特異性表達進行篩選，從而了解其與病原菌的毒性關(guān)系［12］。該試驗旨在分離鑒定羅非魚病原菌以及探究其毒力基因，為湛江地區(qū)羅非魚細菌性疾病防控提供理論依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 試驗動物。

湛江市某水產(chǎn)養(yǎng)殖場10尾患病羅非魚。

1.1.2" 試劑。

腦心浸液肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱生物有限公司；Taq酶、溶菌酶購自Takara公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2" 方法

1.2.1" 病原菌分離。

取病魚的心臟、腸道、脾、肝臟等器官，剪成小塊，置于無菌腦心浸液營養(yǎng)肉湯中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，在37 ℃下培養(yǎng)24 h。根據(jù)所形成的菌群形態(tài)特點篩選出不同的菌株，進行分離純化。

1.2.2" 病原菌的初步鑒定。

每種細菌挑單菌落，對其進行稀釋、涂片、固定、染色后，在顯微鏡下觀察菌體顏色及形態(tài)。

1.2.3" 16S rDNA基因測序。

將分離的細菌用腦心浸液營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h。參考Omega細菌DNA試劑盒（D3350-01）的說明書提取菌株基因組DNA，采用PCR擴增16 S rDNA。擴增引物為：上游引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），下游引物1492R（5′-CTACGGATCC TGGCTCAG-3′）。PCR反應(yīng)體系為：1.0 μLDNA模板，上下游引物各0.5 μL，Taq酶13.0" μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30次循環(huán)，72 ℃延長10 min，4 ℃貯存。1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測，送生物技術(shù)公司測序。用NCBI的Blast對測得的基因序列進行比較，通過MEGA 10.0程序，利用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)樹，用1 000個自舉法檢測系統(tǒng)樹中各個分支的可信度。

1.2.4" 毒力基因檢測。

毒力基因引物序列、退火溫度和片段大小見表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。用PCR法擴增目標基因，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 分離菌鏡檢結(jié)果

鏡檢結(jié)果顯示，菌株①為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄串狀排列；菌株②為革蘭氏陰性桿菌，呈短桿狀；菌株③為革蘭氏陽性球菌。

2.2" 16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)16S rDNA測序結(jié)果，應(yīng)用MAGAX軟件對3株細菌進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。3株菌分為3個屬，分別是葡萄球菌屬、腸桿菌屬、腸球菌屬。鄰接樹顯示，菌株①與葡萄球菌屬的16S rDNA基因序列同源性達到了96%；菌株②與腸桿菌屬聚到一起的置信度高達98%；菌株③與腸球菌屬聚到一起的置信度為100%。在BLAST上進行序列比對結(jié)果可知菌株①為華納葡萄球菌，菌株②為大腸桿菌，菌株③為糞腸球菌。

2.3" 毒力基因檢測結(jié)果

毒力基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示，毒力基因irp2、CS31A、seo、sea、TSST-1、ermC、aggA及gelE均沒有擴增出條帶，表明3株菌未攜帶以上毒力基因；afa、pap、gap、cylB、cylM和efaA各有一條特異性條帶，所擴增的片段大小與相應(yīng)毒力基因片段大小相同，表明上述細菌的毒力基因檢測呈陽性。fimH基因擴增出片段大小與目的基因片段大小不符，判斷為陰性。3株試驗菌毒力基因攜帶情況為：華納葡萄球菌攜帶gap，大腸桿菌攜帶pap、afa，糞腸球菌攜帶efaA、cylM、cylB。

3" 討論

葡萄球菌是一種革蘭氏陽性菌，主要有金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等［13］。李曉陀等［14］對患病羅非魚的魚苗膽囊和肝部細菌分離鑒定結(jié)果表明，分離菌株主要為革蘭氏陰性菌，鑒定為嗜水氣假單胞菌，少量革蘭氏陽性菌為沃氏葡萄球菌。楊憲時等［15］從羅非魚魚肉中分離的細菌以假單胞菌為主，革蘭氏陽性菌較少，以沃氏葡萄球菌、沃氏小球菌為主。以上報道說明葡萄球菌在水產(chǎn)動物體內(nèi)普遍存在，該試驗從患病羅非魚中分離出了華納葡萄球菌。

大腸桿菌是一種常見的動物腸道細菌，通常不會引起疾病［16］。一些特定的血清型大腸桿菌在一定環(huán)境下會導致腸道和外部的感染［17-18］，Yang M X等［19］報道大腸桿菌會誘導草魚紅細胞鐵死亡。致病性大腸桿菌含有多個毒力因子，毒力基因攜帶情況與其致病性的強弱有密不可分的聯(lián)系［20］。按其毒性效應(yīng)，可分為黏附素、鐵攝取、毒素、脂多糖、侵襲素和血清抗性因子等［21］。黏附素能使細菌在宿主細胞的表面上定植，是大腸桿菌入侵人體的一個重要步驟。黏附素包括革蘭氏陰性菌的菌毛（pap）和無菌毛黏附素（afa）［22］。該試驗對從患病羅非魚的肝臟中分離鑒定出的大腸桿菌進行檢測，檢出pap、afa等毒力基因與Ewers C等［23］檢測出禽源大腸桿菌的毒力基因主要是yijp、fimC、mat等，可見毒力基因的分布可能與物種來源有一定的關(guān)系，大腸桿菌對不同物種的侵襲可能是不同毒力因子導致的。

糞腸球菌是人和動物胃腸道的正常菌群［24］，具有維持正常腸道菌群結(jié)構(gòu)的重要作用，是一種條件致病菌［25］，糞腸球菌的致病能力與其表達出來的毒力因子有關(guān)［26-27］。糞腸球菌攜帶毒力基因efaA、cylM、cylB。efaA是一種脂蛋白，其致病力在糞腸球菌的動物模型中得到了驗證［28］。狄婷婷等［29］報道指出Cyl編碼基因包括：激活基因CyLA、轉(zhuǎn)運基因CyLB、結(jié)構(gòu)基因CyL1和CyLS、修飾基因CyLM、免疫基因CyLI。細胞溶解素既可溶解某些G+細菌，還能對紅細胞和其他真核細胞膜產(chǎn)生破壞，導致胞漿膜上出現(xiàn)小孔、破裂，小分子物質(zhì)外泄，對宿主細胞產(chǎn)生損害，是腸球菌感染的主要致病因子，能引起腸球菌的感染［30］。該試驗從糞腸球菌中檢測出efaA、cylM、cylB 3種毒力因子，表明毒力因子的致病過程是多種毒力因子共同作用于宿主細胞導致的。

該試驗從羅非魚體內(nèi)分離的華納葡萄球菌、大腸桿菌以及糞腸球菌均攜帶毒力，研究結(jié)果可為湛江地區(qū)羅非魚細菌性疾病防控提供理論依據(jù)。

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