木蘭科植物組織培養(yǎng)技術研究進展

摘要" 對木蘭科植物的組織培養(yǎng)技術研究現(xiàn)狀進行了概述，包括外植體的選擇、培養(yǎng)基的選擇、繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)及體細胞胚的誘導5個方面，并分析了木蘭科植物組培過程中遇到的難題及未來努力的方向，為木蘭科植物利用組培快繁技術來獲取優(yōu)質種苗提供參考。

關鍵詞" 木蘭科；組織培養(yǎng)；瀕危植物

中圖分類號" Q943.1" 文獻標識碼" A" 文章編號" 0517-6611（2024）05-0011-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.05.003

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Research Progress of Tissue Culture of Magnoliaceae Plants

WANG Shan1，F(xiàn)U Fu-xing1，BAO Hua-peng2 et al

（1.Jiangsu Engineering and Technology Center for Modern Horticulture，Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry，Zhenjiang，Jiangsu 212400；2.Jiangsu Hemu Agricultural Expo Park，Zhenjiang，Jiangsu 212400）

Abstract" The research status of tissue culture technology of Magnoliaceae plants was summarized，including the selection of explants，selection of medium，subculture proliferation culture，rooting culture and induction of somatic embryos.The problems encountered in the process of tissue culture of Magnoliaceae plants and the direction of future efforts were analyzed，providing reference for Magnoliaceae plants to use tissue culture and rapid propagation technology to obtain high-quality seedlings.

Key words" Magnoliaceae;Tissue culture;Endangered plant

基金項目" 江蘇農林職業(yè)技術學院2021年大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（202113103003y）；江蘇省高等學校自然科學研究面上項目（20KJB220002）。

作者簡介" 王 姍（1985—），女，安徽宿州人，講師，博士，從事林木種苗應用研究。

收稿日期nbsp; 2023-03-20；修回日期" 2023-04-24

木蘭科（Magnoliaceae）共18屬，約335種。我國現(xiàn)有木蘭科植物中的14屬，大約165種。木蘭科的分布地區(qū)集中在亞洲地區(qū)的東南部地區(qū)、南部地區(qū)及北美的東南部地區(qū)，而亞洲的北部地區(qū)較少，南美、中美的北部及中部分布均較少，在我國主要分布于東南部至西南部地區(qū)，中部地區(qū)少量分布［1］。木蘭科植物大部分種觀賞價值都比較高，有些種具有較高的藥用價值。木蘭科植物外形優(yōu)美，四季可觀賞，部分種香味濃郁，園林應用價值高，應當加大開發(fā)利用價值。木蘭科植物是現(xiàn)存被子植物中較原始的類群，在研究被子植物起源和系統(tǒng)發(fā)育進化中具有重要的科學價值［2］。

木蘭科植物具有很高的觀賞價值和藥用價值，但由于人為破壞以及木蘭科植物自身繁殖障礙的存在，導致這種原始被子植物逐漸衰落，種群逐漸減少［3］。最新研究表明，木蘭科是當前被子植物中受威脅程度最高的一科，受威脅物種比例高達67.3%。其中僅生存于江蘇句容寶華山的寶華玉蘭已經被列為極度威脅物種（CR）［4］。國內目前已有許多有關木蘭科植物播種繁殖、扦插繁殖和嫁接繁殖的報道［5-7］，而對其組織培養(yǎng)的研究則起步較晚。

在當前的生物技術研究領域，植物組織培養(yǎng)技術是目前較為完善且應用范圍最廣的一個領域，為蔬果花及農作物等植物的快速繁殖、新品種培育、植物脫毒、細胞培養(yǎng)、轉基因、次生代謝產物的生產以及種質資源離體保存等方面做出了突出的貢獻［8］。植物組織培養(yǎng)就是基于細胞全能型理論，利用植物離體器官、組織、細胞或原生質體，在無菌條件下，給予合適的人工培養(yǎng)條件，誘導產生愈傷組織、不定根及不定芽，最后形成完整植株的生物技術［9］。目前，組培技術不僅應用于大量草本植物，還應用到很多木本植物中。植物組織培養(yǎng)技術在苗木無性繁殖過程中發(fā)揮了極其重要的作用，也一步步地在科學研究以及生產應用上開辟了越來越多的新型領域，并對現(xiàn)代農業(yè)以及現(xiàn)代生物醫(yī)學等領域均產生了全面而深刻的影響。

近年來，國內已就云南擬單性木蘭、樂東擬單性木蘭、深山含笑等木蘭科植物開展了組織培養(yǎng)技術研究，選用的外植體包括枝條、嫩芽、實生苗、種胚等［10-11］，針對木蘭科植物易污染褐化、增殖率不高、生根較為困難等難題開展了大量研究，并取得了較多的研究成果［12-15］。該研究對木蘭科植物組織培養(yǎng)技術研究現(xiàn)狀進行了系統(tǒng)總結，分別從無菌苗的誘導、繼代增殖培養(yǎng)、生根壯苗培養(yǎng)及體細胞胚培養(yǎng)等幾個方面，為獲取木蘭科植物優(yōu)質種苗提供了參考價值。

1" 外植體的選擇

在組織培養(yǎng)過程中，再生芽的誘導非常關鍵，如何選擇合適的外植體，什么季節(jié)選擇外植體，對成功誘導出再生芽是非常重要的。從理論上來說，植物體的任何一部分組織或器官都可以在人工誘導條件下再生出植株，然而在實際操作中，不光同科不同屬、不同種的植物，還有同種植物不同取材部位、不同的取材時間等都會對初代培養(yǎng)的誘導過程產生一定的影響，更會直接決定初代誘導的成功率。因此，如何選擇最適合的外植體是任何一種植物組培快繁體系建立的尤為重要的一步。

目前應用于木蘭科植物組織培養(yǎng)的外植體主要有種胚、頂芽、莖段、葉片、雌蕊、花被片、花托及葉芽，不同種適合的外植體也不相同［16-18］。譚澤芳等［19］以廣玉蘭的葉、花、雄蕊等為外植體，誘導愈傷組織，進一步誘導分化出胚狀體， 2 周后誘導率可以達到70%，由愈傷組織誘導出胚狀體比率較高，但從胚狀體進一步分化為苗的效率較低，難度較大。王琪等［20］ 研究發(fā)現(xiàn)，以荷花山玉蘭的葉芽或花托為外植體，最容易產生愈傷組織，生長調節(jié)劑2，4-D 對荷花山玉蘭的愈傷組織的誘導有明顯的促進作用。徐石等［21］發(fā)現(xiàn)，天女木蘭的側芽褐化率最低，而頂芽的褐化率較多，外植體的取材部位與其褐化的程度是息息相關的。研究認為，天女木蘭側芽褐化率較低，頂芽次之，帶芽莖段褐化率最高。

外植體的選擇雖然很重要，但也要根據具體的種選擇合適的外植體采集時期，采集時間不合適，會導致嚴重的褐化現(xiàn)象。唐軍榮等［22］研究表明，6月取材的紅花山玉蘭（M.delavayi）外植體污染率較12月低。高紅兵等［23］研究表明，采條季節(jié)與外植體褐化息息相關，采集外植體褐化最嚴重為夏季，尤其以 7、8 月份嚴重。周麗艷等［12］以白玉蘭的嫩芽為外植體，發(fā)現(xiàn)春季和冬季取材時，外植體褐化率較低，而夏季取材時褐化率明顯升高。木蘭科絕大部分植物都是早春萌芽，此時的溫度相對較低，植物剛剛從冬季的休眠期逐漸恢復，植物體內的代謝活動也相對較弱，且此時植物體內的內生菌也較少，這時采集外植體進行初代培養(yǎng)更容易獲得成功。

2" 培養(yǎng)基的選擇

外植體的選擇固然重要，植物生長所依賴的培養(yǎng)基會直接影響培養(yǎng)效果，一個是基本培養(yǎng)基的類型，另一個是培養(yǎng)基中所添加的生長調節(jié)劑的類型和濃度。在木蘭科植物的組織培養(yǎng)中多以MS和B5為基本培養(yǎng)基，同時添加不同種類和濃度的生長調節(jié)劑等。陸秀君等［16］在對天女木蘭的幼胚離體培養(yǎng)中，從無菌體系建立到增殖繼代培養(yǎng)均獲得了較為成熟的技術，篩選出較為適合的培養(yǎng)基是B5培養(yǎng)基，其次是WPM培養(yǎng)基，研究發(fā)現(xiàn)，天女木蘭的幼胚在離體生長過程中需要大量和微量元素，以Ca2+和K+為主。杜鳳國等［15］在天女木蘭組培快繁體系的建立中發(fā)現(xiàn)，最適宜的繼代增殖培養(yǎng)基為MS+ZT 0.4 mg/L+ 2，4-D 2.5 mg/L，最適宜的分化培養(yǎng)基為MS+GA3 0.5 mg/L+6-BA 0.6 mg/L。孫銘鴻等［17］在對天女木蘭的研究中發(fā)現(xiàn)，以其實生苗帶芽莖段為外植體，以White為基本培養(yǎng)基，褐化嚴重，側芽萌發(fā)晚，以B5為培養(yǎng)基的生長狀況較好。研究認為，適宜的基本培養(yǎng)基對提高其再生芽的生長效果有著顯著的影響。王歡等［13］在對天女木蘭組培培養(yǎng)基的篩選過程中發(fā)現(xiàn)，在MS培養(yǎng)基中褐化現(xiàn)象嚴重，而在B5培養(yǎng)基中抑制外植體褐化效果最佳。

3" 繼代增殖培養(yǎng)

對于木蘭科植物而言，不同種的木蘭科植物增殖分化難易程度也不相同。在繼代增殖過程中受到的影響因素很多，再生芽的數量和質量、增殖系數都將直接影響繼代增殖培養(yǎng)的成功率和總體效果。孟雪［24］對白玉蘭增殖培養(yǎng)的研究表明，6-BA的濃度大于0.2 mg/L時，芽褐化嚴重，隨著激素濃度的增高，褐化出現(xiàn)的時間也提前。李艷等［25］研究發(fā)現(xiàn)，不同種在相同培養(yǎng)基培養(yǎng)表現(xiàn)差異大，在相同培養(yǎng)基條件下，白玉蘭與紫玉蘭的增殖率只有49%和40%，而二喬玉蘭增殖率則能高達80%。周麗華等［26］研究發(fā)現(xiàn)，當6-BA濃度達到2 mg/L時，紫玉蘭的繼代增殖苗的芽的節(jié)間會比對照縮短。王奇等［27］在對紅花山玉蘭進行組培快繁體系建立時發(fā)現(xiàn)，紅花山玉蘭再生芽的最適宜繼代培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.50 mg/L+NAA 0.01 mg/L，再生芽接入 21 d后，分化出4個大于0.5 cm的不定芽。徐棉芬［28］研究發(fā)現(xiàn)，最適合二喬玉蘭的繼代增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 1.0 mg/L，增殖系數可達6，增殖芽苗生長狀況好，生長健壯，葉片顏色嫩綠，芽苗質量較高。褚建民等［29］則認為，白玉蘭的最適宜的增殖培養(yǎng)激素為6-BA和NAA。

4" 生根培養(yǎng)

木蘭科的大部分植物在組培過程中生根都較為困難，通過篩選不同類型的培養(yǎng)基、不同的激素種類以及濃度，添加不同的添加物等方式可提高其生根率。陳金慧等［30］研究表明，較低的礦質元素含量和蔗糖濃度對鵝掌楸生根非常有利，以 1/2 MS 為基本培養(yǎng)基，添加濃度為0.1 mg/L的IBA，有利于鵝掌楸的組培苗生根。周麗華等［26］在對紫玉蘭組培快繁技術研究時發(fā)現(xiàn)，紫玉蘭在生根培養(yǎng)階段，在培養(yǎng)基中添加NAA 0.2 mg/L和IBA 2.0 mg/L，紫玉蘭的生根率能夠達到90%以上；除此之外，培養(yǎng)條件對紫玉蘭的生根率也產生了明顯的影響，通過增加光照強度，能夠明顯提高紫玉蘭的生根率。李紀元等［31］認為，雜交鵝掌楸的最適合生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 1.5 mg/L 。陳穎等［32］誘導北美鵝掌楸組培芽苗生根時，則認為最適合培養(yǎng)基為1/2 MS+ IBA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，生根率最高達 66.7%。孟雪［24］研究表明，誘導白玉蘭生根的培養(yǎng)基為 1/2 MS+IBA 0.2 mg/L或1/4 MS+IBA 0.5 mg/L ，生根率可以超過80%。李艷等［25］研究發(fā)現(xiàn)，適合誘導白玉蘭、二喬玉蘭和紫玉蘭3種植物生根的培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 1.0 mg/L ，3種玉蘭的生根率分別為 68%、81%、43%。

5" 體細胞胚的誘導

組培過程中外植體以胚胎發(fā)生方式形成再生植株的過程稱為體細胞胚胎發(fā)生。這種離體快繁的途徑對生根困難的樹種來說是有利的，該方式最大優(yōu)點是結構完整、繁殖速度快、無須發(fā)根。王碧琴等［33］研究發(fā)現(xiàn)，在對白玉蘭花藥愈傷及胚狀體誘導的過程中，當培養(yǎng)基為MS+6-BA 1 mg/L+ NAA 3 mg/L時，愈傷組織的誘導率最高，達35.2%，愈傷組織質量也很高。當培養(yǎng)基中的6-BA濃度不變時，隨NAA濃度的升高，愈傷組織誘導率和胚狀體誘導率逐漸升高。譚澤芳等［19］在對廣玉蘭的研究中發(fā)現(xiàn)，用廣玉蘭的花被、花托、雄蕊、葉及葉芽為試材，由愈傷組織誘導胚狀體，2周后胚狀體誘導率達70%，不過從胚狀體進一步分化成完整植株的過程難度較大。趙松峰［34］以紫玉蘭的花瓣作為外植體，接種在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L 的培養(yǎng)基上，愈傷誘導率為31.1%；隨著NAA濃度升高，愈傷誘導率則下降；隨著6-BA濃度的增大，愈傷組織誘導率則是先增大后減小。懷慧明等［35］研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基為MS+6-BA 12.0 mg/L+KT 5.0 mg/L+NAA 1.2 mg/L+IBA 2.0 mg/L，以帶芽莖段為外植體，紅花玉蘭的愈傷組織誘導率最高。王志毅［36］研究發(fā)現(xiàn)，用厚樸作為外植體進行體細胞胚胎的誘導，誘導培養(yǎng)基為MS+2，4-D 1.00 mg/L+TDZ 0.01 mg/L +谷氨酞胺1.00 mg/L時，愈傷組織誘導率為6%，合子萌發(fā)率為8%；將體細胞胚胎轉移到1/2 MS+GA3" mg/L的培養(yǎng)基上，有25%的體細胞胚胎可以轉化成完整植株。Merkle等［37］用金字塔玉蘭的未成熟的種子進行體細胞胚的誘導，在添加1 g/L 酪蛋白水解物的半固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加2，4-D 0.040 mg/L和6-BA 0.005 mg/L。培養(yǎng)7～10周后，轉接到無激素培養(yǎng)基中，可成功獲得體細胞胚。Mata-Rosas等［38］在對墨西哥大葉木蘭體細胞胚研究的過程中發(fā)現(xiàn)，用合子胚通過體細胞胚胎及器官發(fā)生的途徑，在培養(yǎng)基WPM+ 2，4-D 0.01 mg/L或2，4-D 0.02 mg/L中，體細胞胚胎誘導率達到65%。目前國內有研究表明，廣玉蘭可通過體細胞胚誘導途徑獲得再生植株，廣玉蘭從愈傷組織誘導胚狀體較容易，但是從胚狀體進一步分化成幼苗時分化率不高。

通過胚狀體途徑而產生的不定芽增殖數量比較多，和器官發(fā)生途徑相比，穩(wěn)定性好、增殖率高。由于胚狀體同時具有胚芽和胚根，因此可以用來制作人工種子。在下一步研究中，應加強以胚狀體途徑建立的再生體系研究，以滿足木蘭科植物的種苗工廠化繁育以及大面積推廣應用的需求。

6" 結語與展望

木蘭科植物組織培養(yǎng)技術雖然起步較晚，但近年來國內外關于木蘭科組織培養(yǎng)的研究報道越來越多。目前木蘭科植物組織培養(yǎng)過程中仍面臨一些困難，如組培過程中的易污染、易褐化、增殖率低、誘導愈傷、不定芽分化困難、生根困難及體細胞胚胎發(fā)生難等問題。污染是木蘭科植物在開展組織培養(yǎng)研究過程中首先遇到且經常遇到的一大問題，把污染率降至可以接受的范圍，成為木蘭科植物組培快繁體系繼續(xù)建立的保障。木蘭科植物在組織培養(yǎng)過程中很容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，褐化的發(fā)生除了跟植物本身品種有關，同時也會受到外植體取材時間、消毒方式、培養(yǎng)基種類、生長調節(jié)劑種類及濃度以及培養(yǎng)條件等很多因素的影響。不同的植物所含有的酚類物質不相同，導致褐變產生的原因也不相同，很難找到一種通用的方法來解決木蘭科植物的褐化現(xiàn)象。

木蘭科植物目前成苗方式還是以芽生芽，而且木蘭科植物不定芽的產生有一定的難度。目前報道的主要以頂芽或腋芽作為培養(yǎng)材料培養(yǎng)。通過該方法獲取的再生苗遺傳穩(wěn)定性好，不易產生基因型變化，但就目前的研究報道看，普遍的增殖率較很低，增殖速度受影響很大。雖然木蘭科植物以芽生芽的不定芽發(fā)生方式誘導存在一定難度，但木蘭科植物可備選的外植體類型很多且來源豐富，如根、莖、葉片、葉柄、胚軸等均可以進行切段培養(yǎng)以誘導產生不定芽。針對木蘭科植物增殖率低的問題還可以考慮采用分段培養(yǎng)，分段培養(yǎng)是指先在原始增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后，轉接到另一種激素配比不同的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。通過調整生長調節(jié)劑種類濃度及不同生長調節(jié)劑的配比，或是通過改變增殖方式等多種途徑來提高木蘭科植物的增殖率，將成為今后木蘭科植物組培快繁相關研究工作的重點。

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