三角鯉線粒體基因組全序列測定及分析

摘要" ［目的］三角鯉（Cyprinus multitaeniata）是我國具有重要經濟價值的魚類之一，了解三角鯉線粒體基因的結構和特點，為三角鯉的種群遺傳多樣性研究提供基礎資料。［方法］采用26對引物擴增三角鯉的線粒體全基因，通過生物軟件識別和分析各基因和非編碼序列的位置和特點，并通過與GeneBank數據庫已發表鯉科魚類序列進行比較和構建系統發育樹進行分析。［結果］三角鯉線粒體全基因總長度為16 573 bp，堿基含量A為32.2%、T為24.9%、C為27.3%、G為15.6%；包括37個編碼基因（編碼蛋白基因13個、tRNA基因22個和rRNA基因2個）和2個非編碼序列區（OL區和控制區）。13個蛋白編碼基因中，COX1的起始密碼子為GTG，其他均為ATG；終止密碼子包括TAG（ATP8）、TA（COX3、ATP6）、T（ND2、COX2、ND3、ND4、Cty b）和TAA（ND1、COX1、ND4L、ND5、ND6）3種。22個tRNA基因中，除了tRNASer（AGC）外其余都能折疊成典型的三葉草結構；三角鯉控制區序列可以識別出3個典型保守區域；系統發育分析表明，三角鯉與大眼鯉（C. megalophthalmus）親緣關系較近。［結論］三角鯉線粒體基因組成、長度和排列順序與典型的脊椎動物相同，在親緣關系上與大眼鯉最近；線粒體基因組序列適用于三角鯉的系統發育分析。

關鍵詞" 三角鯉；線粒體基因組；全序列分析；系統發育

中圖分類號" S917.4" 文獻標識碼" A" 文章編號" 0517-6611（2024）05-0108-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.05.026

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Sequencing and Analysis of Complete Mitogenome of Cyprinus multitaeniata

LI Qiang， LI Wen-jun， HAN Chong et al

（College of Life Science， Guangzhou University， Guangzhou， Guangdong 510006）

Abstract "［Objective］Cyprinus multitaeniata is one of the important economic fish in China. Understanding the structure and characteristics of complete mitogenome of Cyprinus multitaeniata， to provide a scientific basis for the protection and utilization of its germplasm resources. ［Method］In this study， 26 pairs of primers were used to amplify the complete mitochondrial gene of C. multitaeniata. The position and characteristics of each gene and non-coding sequences were identified and analyzed by softwares. The sequence of C. multitaeniata was compared with the published sequences of Cyprinidae in GeneBank database and the phylogenetic tree was constructed. ［Result］The total length of mitogenome of C. multitaeniata was 16 573 bp， and the base contents of A， T， C， and G were 32.2%， 24.9%， 27.3%， and 15.6%， respectively. There were 37 coding genes （22 tRNA genes， 13 coding protein genes， and 2 rRNA genes） and 2 noncoding sequence regions （OL and control regions） in the complete mitogenome C. multitaeniata. The start codon of 13 protein coding genes was ATG except for COX1 which was GTG. Stop codons included TAG （ATP8）， TA （COX3， ATP6）， T （ND2， COX2， ND3， ND4， Cty b） and TAA （ND1， COX1， ND4L， ND5， ND6）. All the 22 tRNA genes except tRNASer （AGC） folded into the typical clover structure. Three typically conserved regions could be identified in the control region of C. multitaeniata. Phylogenetic analysis showed that the C. multitaeniata was closely related to the C. megalophthalmus. ［Conclusion］The composition， length， and sequence of mitochondrial genes of C. multitaeniata were similar to those of typical vertebrates， and it is the closest to C. megalophthalmus in genetic relationship. The mitochondrial genome sequence is suitable for phylogenetic analysis of the C. multitaeniata.

Key words" Cyprinus multitaeniata;Mitochondrial genome;Complete sequence analysis;Phylogeny

基金項目" 廣州市科技計劃項目（201804010486）；廣東省教育科學規劃課題（2021GXJK097）。

作者簡介" 李強（1983—），男，廣東韶關人，實驗師，博士，從事淡水魚類生態與親緣地理研究。

*通信作者，講師，博士，從事生物技術研究。

收稿日期" 2023-05-13；修回日期" 2023-06-25

三角鯉（Cyprinus multitaeniata Pellegrin et Chevey，1936），俗稱江鯽、黃板鯉、黃鯽，隸屬于鯉形目（Cypriniformes），鯉科（Cyprinidae），鯉屬（Cyprinus），為重要的經濟魚類。其主要分布于西江水系和元江水系。目前，關于三角鯉的研究主要集中于飼料營養［1-2］、人工繁育［3-5］等方面，但對于三角鯉線粒體基因分析的研究鮮見報道。

魚類線粒體基因具有序列結構及排列比較簡單、缺少基因重組、母系遺傳和進化速率快等特點［6］，線粒體基因組組成相對穩定，但基因結構和排列順序具有一定差異，且這些差異能反映不同進化路線，在生物間系統起源、演化、分類及親緣關系等研究中被廣泛應用［7］。筆者擬對三角鯉線粒體基因組特征進行分析，并與其他鯉科魚進行比較，從而進一步在分子的水平上研究親緣關系及其分類地位，旨在為三角鯉遺傳育種及種群資源利用和保護提供相關理論依據。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

試驗用三角鯉樣品，采自西江水系的南寧市區域，樣品用95%乙醇固定后于-20 ℃保存。

1.2" DNA提取與擴增

基因組DNA提取采用試劑盒（生工生物工程股份有限公司，上海）。PCR擴增采用自行設計的26對引物進行（表1）。PCR反應體系包括5 μL 10×Buffer（含Mg2+）、1.5 μL dNTPs（各10 mmol/L）、0.8 μL Taq酶（5 U/μL）、上下游引物各2 μL（10 μmol/L）、3 μL DNA模板，加水至總體積50 μL。反應條件：94 ℃預變性5.0 min，94 ℃變性1.0 min，50～55 ℃復性1.0 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環，延伸10.0 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測合格后，委托上海生工生物工程有限公司進行純化并測序。

1.3" 數據分析

采用DNAstar 5.0和MEGA 6.0軟件對所測得序列進行比對校正和拼接；通過MITOS WebServer BETA軟件識別并確定13種蛋白編碼基因的位點；利用tRNAscan-SE1.21識別出三角鯉的22個tRNA基因和rRNA基因。通過對比其他鯉科魚類的控制區序列，對三角鯉控制區結構進行分析；根據tRNAAsn和tRNACys，識別出OL區的長度與位置，通過RNA Structure軟件模擬OL二級結構。利用MEGA 6.0軟件統計三角鯉線粒體基因組序列組成情況。從GeneBank數據庫下載鯉屬魚類和臨近的鯽屬、倒刺鲃屬共24種魚類的線粒體基因組序列，以泥鰍為外類群，截取重鏈上的12個蛋白編碼基因的核苷酸序列，進行系統進化樹分析。25種魚類線粒體基因組信息見表2。

2" 結果與分析

2.1" 結構與組成

三角鯉線粒體基因組全序列長度為16 573 bp，包括蛋白編碼基因13個、tRNA基因22個、rRNA基因2個、OL區和控制區。其中，23個基因位于重鏈（H鏈），包括14個tRNA基因、12個蛋白編碼基因和2個rRNA基因；其他9個編碼基因（包括tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNAtyr、tRNASer（UCA）、tRNAGlu、tRNAPro、ND6）都分布輕鏈（L鏈）上（表3）。

三角鯉的線粒體基因組堿基含量分別為：A為32.2%、T為24.9%、C為27.3%、G為15.6%，A+T含量（57.1%）明顯高于C+G含量（42.9%），表現為A+T偏好性。這與脊椎動物偏好于A和T堿基是一致的。

2.2" 編碼基因

三角鯉線粒體基因組中，除ND6基因的分布在L鏈，其余12個蛋白編碼基因均位于H鏈。除COX1的起始密碼子為GTG外，其他12個蛋白編碼基因起始密碼子均為ATG；除了ATP8終止密碼子為TAG，COX3、ATP6的終止密碼子為TA，ND2、COX2、ND3、ND4、Cty b的終止密碼子為T，其余蛋白編碼基因終止密碼子為TAA（表3）。

在22個tRNA中，長度為67～77 bp。其中21個都能折疊成典型的三葉草結構，tRNAser（AGC）由于缺少二氫尿嘧啶臂（D臂）未能形成三葉草結構［8］，這與其他鯉科魚類情況類似。12S rRNA的基因長度為954 bp，16S rRNA的基因長度為1 679 bp。

2.3" 非編碼序列

在tRNAAsn與tRNACys之間有一段非編碼序列，長度為33 bp，被稱為L鏈復制起始區，又稱為OL區。利用RNA Structure 5.2 模擬繪制出OL區的二級結構，OL區能形成穩定的莖環結構，包括由8對堿基組成的莖區，其序列為TTCCCGCC/AAGGGCGG，還有14 bp構成的環區。OL莖區中具有8對堿基，有6對為G-C堿基，這種二級結構的特征與其他硬骨魚類相似。

在tRNAPro和tRNAPhe基因之間，有一段長為927 bp序列，該序列富含AT堿基，稱為控制區（D-loop）。通過與鯉屬魚類的同源序列相比較，識別出三角鯉控制區的3個保守區域：終止序列區（TAS）、中央保守區（CD）和保守序列區（CSB）［9］。

2.4" 系統發育樹

以泥鰍為外類群，基于鄰接法（NJ法）構建24種魚類線粒體基因系統發育樹（圖1）。結果顯示，三角鯉與大眼鯉首先聚為一支，形成姐妹群。另外，所有的鯉屬魚類構成一支，形成單系群。

3" 討論與結論

三角鯉的mtDNA基因的結構組成與大多數脊椎動物一樣，包括13個蛋白編碼基因，22個tRNA基因，2個rRNA 基因和1個控制區共37個基因。三角鯉基因組成、序列長度向與典型的脊椎動物相同，堿基組成中A+T含量明顯高于C+G的含量，這與其他魚類相一致［10-11］。三角鯉13個蛋白編碼基因中，除了COⅠ起始密碼子為GTG外，其他蛋白編碼基因均為ATG，這與其他硬骨魚類相似。在終止密碼子的使用情況中發現，13個蛋白編碼基因中有7個為不完全終止密碼子（以TA或T為結尾）。通常認為，在轉錄過程中轉錄產物加接上多腺苷酸（Ploy A）后形成UAA終止密碼子，來完成終止翻譯的功能［12］。

圖1" 24種魚類基于線粒體基因組12個蛋白質編碼基因的系統進化樹

Fig.1" NJ phylogenetic tree base on 12 protein-coding genes of mitochondrial genome of 24 fish species

三角鯉線粒體的OL區位于5個tRNA（tRNATrp、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr）組成的WANCY簇區內，可以形成穩定的莖環結構。三角鯉線粒體的OL區未發現被公認為參與RNA引物合成的保守序列5′-GCCGG-3′［13］，而該序列在蝦虎魚類［14］和石首魚類［15］中較為常見。兩棲類、爬行類和哺乳類線粒體基因組OL區的環結構中T堿基密集，而在已報道的硬骨魚類中，則為C堿基密集［16］。三角鯉OL區環結構中為C堿基密集，環區C含量為35.7%，結果與已報道的硬骨魚類相似。

在脊椎動物中，控制區序列可能由于受到較小的選擇壓力，進化速度相對較快，其通過堿基替換和長度變化進行的方式變異，因此是線粒體基因組變異最大的區域［17］。在研究控制區的3種保守區域時，發現CSB-1區域的序列與其他魚類相關保守序列可能存在較大差異，如鳑鲏魚類［9］、棘頭梅童魚［18］、瓦氏黃顙魚［19］等，可能會存在堿基的增減或堿基替換等情況。

采用NJ法對三角鯉線進化樹分析，結果顯示，三角鯉與大眼鯉親緣關系最近。三角鯉與大眼鯉首先聚為一支，然后與其余鯉屬魚類相聚，表明線粒體基因組序列適用于鯉屬魚類的系統發育分析。

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