二倍體蒼白莖藜組織培養研究

摘要" ［目的］建立藜麥二倍體蒼白莖藜的組織培養體系。［方法］以二倍體蒼白莖藜種子為外植體，先獲得無菌幼苗，在此基礎上進行不同脫毒外植體不同激素濃度配比對愈傷組織的誘導、不定芽分化的誘導、生根的誘導及移栽馴化的相關研究。［結果］二倍體蒼白莖藜的種子最佳消毒時間為2%次氯酸鈉消毒6 min；愈傷組織誘導的最佳培養基為MS+1.0 g/L水解酪蛋白+35 mg/L肌醇+690 mg/L脯氨酸+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D，誘導率達到86.63%；不定芽分化誘導培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L 2-IP+1.0 mg/L KT，誘導率為11.67%；MS+2.0 mg/L IBA或MS+0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA為最佳生根培養基，生根率均達100%，試管苗經煉苗和移栽馴化后成活。［結論］該研究通過蒼白莖藜種子誘導獲得再生植株，經煉苗移栽馴化后成活，為二倍體藜麥的遺傳轉化體系的建立提供基礎。

關鍵詞" 蒼白莖藜；二倍體；組織培養

中圖分類號" S519" 文獻標識碼" A" 文章編號" 0517-6611（2024）05-0103-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.05.025

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on the Tissue Culture of Diploid Chenopodium pallidicaule

ZHANG Quan1， LIN Tong1， LIU Zheng-jie1，2 et al

（1.College of Agronomy and Biotechnology， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201;2.Research Center of Characteristic Small Population Crops， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201）

Abstract" ［Objective］In order to establish the tissue culture system of diploid Chenopodium pallidicaule. ［Method］Researches of callus induction， adventitious bud differentiation， rooting and transplanting were conducted by using the seeds of diploid Chenopodium pallidicaule. ［Result］The results showed that the best disinfection time of diploid C. pallidicaule seeds was 6 min under 2% sodium hypochlorite;the callus induction medium was MS+1 g/L hydrolyzed casein+35 mg/L inositol+690 mg/L proline+1.0 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D， the induction rate reached 86.63%;the induction medium of adventitious bud differentiation was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L 2-IP+1.0 mg/L KT， and the induction rate was 11.67%;MS+2.0 mg/L IBA or MS+0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA were the best rooting medium， with the rooting rate were 100%. ［Conclusion］Regenerated plants were obtained from the explants of C. pallidicaule seeds， and then survived after being domesticated， which provided a basis for the establishment of the genetic transformation system of diploid C. pallidicaule.

Key words" Chenopodium pallidicaule;Diploid;Tissue culture

基金項目" 國家自然科學基金項目（32060421）；云南省科技廳外專引智項目（202105AQ130002）；云南農業大學第十四屆學生科技創新創業基金項目（2021YPY001）。

作者簡介" 張全（1997—），男，黑龍江黑河人，碩士研究生，研究方向：植物組織培養。

*通信作者，教授，博士，從事作物生理學研究。

收稿日期" 2023-03-16

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.，2n=36）為莧科藜屬（Chenopodium）四倍體一年生雙子葉草本植物［1］。原產于南美洲的玻利維亞、秘魯、厄瓜多爾和哥倫比亞等地區。約在5 000年前被馴化作為糧食及飼料作物。其籽粒含有均衡的不同種類的必需氨基酸、較高的蛋白質含量和高含量的礦質元素等平衡優越的營養，是印加人的重要食物，被稱為“糧食之母”［2］。由于藜麥具有抗旱、耐低溫、耐鹽堿、耐貧瘠等強耐逆的特性，FAO 把2013年認定為“國際藜麥年”，突顯了藜麥對全球糧食安全的重要作用，快速促進了全球藜麥的生產、消費與產業升級［3］。近年來，已被世界125個國家和地區引入作為新型農業生產的優選作物［4］。我國于2008年在山西、青海、陜西、甘肅、內蒙古、吉林、河北、四川及云南等省（區）開展引種、栽培示范及規模化種植，目前多個省份已經初步形成規模化的藜麥產業［5］。隨著藜麥產業的快速發展，國內學者關注于藜麥營養、食品加工、栽培技術及育種研究。目前世界廣泛種植的主要栽培種藜麥（quinoa）為一種異源四倍體（2A2B）物種，可能由二倍體的A基因組物種如蒼白莖藜（Chenopodium pallidicaule Aellen）及B基因組物種如Chenopodium suecicum等的祖先物種通過雜交而形成［6］。二倍體的蒼白莖藜（2A）是一種半馴化栽培作物，具有株型矮小、產量低、種子小的特點，作為栽培物種主要分布在安第斯山脈的高海拔地區［7］。蒼白莖藜是研究四倍體藜麥的育種及遺傳研究材料。近年已有學者報道四倍體藜麥的組織培養研究。1990年Komari等［8］僅涉及藜麥的愈傷組織誘導和原生質體培養。2005年Eisa等［9］從體細胞胚途徑誘導藜麥再生植株，獲得成功，但成苗率僅為5%。2015年俞涵譯等［10］通過對藜麥外植體篩選，進而對藜麥愈傷組織誘導進行探索，在愈傷組織誘導方面取得成果，但有關愈傷組織分化不定芽鮮見報道。2016年Hesami等［11］采用藜麥下胚軸作為外植體誘導愈傷組織，僅研究可分化產生叢生芽。2018年曹寧等［12］采用莖段為外植體建立臺灣紅藜的再生，不定芽分化率最高為86.67%。2020年段鵬慧等［13］以藜麥帶腋芽的莖段為外植體，初步建立了藜麥莖段的快繁體系。但至今有關二倍體蒼白莖藜的組織培養研究卻鮮見報道。筆者以二倍體蒼白莖藜的莖段為外植體進行不同激素濃度的配比，并對愈傷組織、不定芽分化和生根的誘導以及試管苗的移栽成活進行研究，旨在為建立一套穩定的二倍體藜麥組織培養體系，為藜麥的遺傳轉化及基因功能研究提供良好的材料。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

植物材料為直接從玻利維亞引進的藜麥二倍體栽培種蒼白莖藜（C.pallidicaule）PURA-PURANI。

1.2" 二倍體蒼白莖藜無菌外植體的培育

選取籽粒飽滿的二倍體蒼白莖藜PURA-PURANI的種子置于1.5 mL離心管中，用2倍體積的無菌水浸泡種子，并將離心管放入30 ℃水浴鍋中2 h輔助種子充分吸漲，取出冷卻至室溫；隨后用75%乙醇溶液消毒30 s，無菌水沖洗1次后置于2%次氯酸鈉溶液中消毒6 min；最后用無菌水沖洗5次后接種到MS培養基上，每瓶培養基接種10～15粒種子。置于37 ℃進行2 d暗培養，轉至光照時間12 h/d條件下培養15 d～30 d，獲得無菌實生苗備用。統計污染率：

污染率（%）=污染數/接種外植體數×100%

1.3" 二倍體蒼白莖藜愈傷組織的誘導培養

將無菌苗的莖段剪成0.5 cm小段，置于表1中不同處理條件下的培養基中，其基本培養基為MS+水解酪蛋白1 g/L+肌醇35 mg/L+脯氨酸690 mg/L+3%蔗糖+0.7%瓊脂，pH為5.8，添加不同濃度的植物生長調節劑。培養條件為（25±1） ℃，16 h光照。每個處理接種30個莖段，重復3次。接種14 d后統計愈傷組織的誘導及生長情況。

愈傷組織誘導率=出愈的外植體數/接種外植體數×100%

1.4" 二倍體蒼白莖藜愈傷組織的分化培養

選擇生長良好、大小均勻的二倍體蒼白莖藜愈傷組織，轉接到表2中不同處理的培養基中，每個處理轉接愈傷組織為20塊，重復3次，培養30 d后統計不定芽的分化率與不定芽生長情況，以此篩選出誘導不定芽的最佳培養基。

再分化率=出芽外植體數/接種外植體數×100%

1.5" 生根培養

二倍體蒼白莖藜的不定芽長至3～5 cm，將其轉移到含不同植物生長調節劑種類及不同濃度的培養基上，進行生根誘導培養。

生根率（%）=生根外植體數/接種外植體數×100%

1.6" 煉苗移栽

選擇長勢健碩、根系生長良好的二倍體蒼白莖藜組培苗，打開瓶蓋，向瓶中注入自來水，使水在瓶中的高度達1～2 cm，保證瓶內100%的相對濕度，在室溫中練苗3～4 d后，取出植株，將根部培養基洗凈，移栽至含有已滅菌的基質腐殖土的盆中。放置于通風、散光的環境中進行正常的栽培管理，保持環境溫度為22～24 ℃，空氣濕度在60%～80%。

1.7" 數據統計

利用Excel統計數據，運用 SPSS Statistics 24.0對數據進行方差分析。不同小寫字母表示處理間差異顯著（Plt;0.05）。

2" 結果與分析

2.1" 不同消毒時間對二倍體蒼白莖藜種子發芽的影響

由表3可知，處理①的外植體污染率最高，為55.56%，而處理②和處理③隨著消毒時間的延長，外植體的污染率降至0，發芽率也下降，但是各處理間發芽率無顯著差異（Pgt;0.05），因而，外植體的最佳消毒時間為6 min 2%次氯酸鈉溶液。

2.2" 不同植物生長調節劑配比對愈傷組織誘導的影響

將

培育的二倍體蒼白莖藜無菌苗莖段接種到含有不同濃度

6-BA、NAA和2，4-D的培養基中，由表4可知，處理A1、處理A2未能誘導出愈傷組織，處理A6誘導率達到64.97%，愈傷組織呈淺黃色，處理A7誘導率降低。處理A12培養基的誘導率達到83.57%，處理A13培養基誘導率降低，出現抑制現象。當6-BA、NAA和2，4-D濃度均為1.0 mg/L時，處理A14誘導率達到最高86.63%，愈傷組織呈淺黃色，結構疏松，繼代后愈傷組織為胚性愈傷（圖1 A），后期能夠分化出綠色芽點；處理A15培養基誘導率降低為56.67%，愈傷組織水漬化嚴重（圖1 B）。由此可知，適當NAA、2，4-D濃度能促進愈傷組織誘導，濃度過高則會抑制。多種激素處理更有利于誘導愈傷組織的誘導，其愈傷組織最佳誘導激素配比為A14處理，即MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D。

2.3" 不同植物生長調節劑配比對愈傷組織不定芽誘導的影響

在最適培養基上進行愈傷組織的繼代，淺黃色呈顆粒狀的愈傷組織繁殖速度快，但是誘導器官發生能力極低。挑選長勢良好、松軟的愈傷組織，轉接到添加不同濃度的NAA、6-BA、2，4-D、KT、ZT、TDZ及2-IP的不定芽再分化培養基上（表2）。在B1～B7培養基中，僅B2培養基能成功誘導愈傷組織再分化形成不定芽（圖1C），再分化率為11.67%，同時也誘導愈傷組織分化出不定根（圖1D），不定根的分化率為60.00%，比不定芽的分化率高（表5）。

2.4" 誘導生根及移栽

把2～3 cm高的不定芽接種到含有不同濃度的IBA與NAA的培養基中，進行生根誘導（表6）。在不含有激素的MS的C1處理與1/2MS的C2處理中，生根率分別為73.33%和76.67%。C1和C2處理生根率間無顯著差異（Pgt;0.05）。IBA單獨處理時，隨IBA濃度增大，生根率逐漸升高，在2.0 mg/L IBA C7處理時誘導率高達100%。而單獨添加0.1 mg/L NAA的C8處理生根率為90.00%。然而，IBA與NAA共同添加的C9處理的生根率也高達100%（圖1E）。可見，IBA與NAA共同添加具有增效的作用。因而，蒼白莖藜的最佳生根培養基為C7或C9。生根后的蒼白莖藜幼苗在大棚內開瓶煉苗5～7 d后移栽至基質盆中（圖1F），生長30 d后，形成長勢健壯的二倍體蒼白莖藜幼苗（圖1G）。

3" 討論

外植體的種類是植物組培成功的關鍵因素［14］。植物種類不同或同一種植物的不同器官、組織具有不同誘導愈傷組織的能力。該研究先以二倍體蒼白莖藜的種子作為外植體，獲得無菌的幼苗，再以其葉片和帶腋芽的莖段為無菌外植體均能誘導出愈傷組織，然而帶腋芽的莖段的愈傷組織誘導優于葉片，這與Yu等［15］和段鵬慧等［13］對四倍體藜麥的研究結果一致。筆者也以胚作為外植體，進行愈傷組織的誘導，易出現玻璃化現象，導致愈傷組織的死亡。這可能與二倍體蒼白莖藜包裹在胚乳外側、細長的環形胚有關［16］。因而，采用細長的環形胚作為外植體，對消毒劑比較敏感。四倍體藜麥植株包括葉片、花及莖稈等組織的外表面均有鹽泌囊泡的存在［17］，導致組培研究比較困難、進展緩慢，目前僅有少量組培成功的研究報道［9-11，12，17］。二倍體蒼白莖藜植株的外圍也同樣有鹽泌囊泡［16］。在已報道的藜麥組培中，通常以莖段、子葉、葉片及種子為外植體誘導愈傷組織［9-11，13，17］。該研究采用帶腋芽的莖段最適合作為二倍體蒼白莖藜的外植體。在植物組織培養中外植體的消毒及其時間是根本環節［7］。該研究對二倍體蒼白莖藜種子采用75%乙醇消毒30 s+0.2% NaClO消毒6 min，污染率為0。然而，Yu等［15］研究發現，四倍體藜麥的種子用75%乙醇消毒30 s+0.2% NaClO消毒15 min效果最佳，消毒時間縮短的原因可能是由于二倍體蒼白莖藜種子更小。二倍體蒼白莖藜種子的千粒重為0.36～0.48 g，而四倍體蒼白莖藜種子的千粒重一般在3.00～4.50 g，幾乎小了10倍。這主要由于小種子的相對表面積更大，導致消毒時間相應的縮短。

在四倍體藜麥愈傷組織的誘導研究中，俞涵譯等［10］采用2，4-D為基礎植物生長調節劑，添加KT和NAA進行激素的配伍。3個藜麥品種均在0.5 mg/L 2，4-D處理下，愈傷組織的誘導率高達100%，且隨著2，4-D濃度的增大，愈傷組織誘導率呈下降趨勢。該研究結果表明，隨著激素2，4-D濃度從0.5 mg/L增加到2.5 mg/L，其愈傷組織的誘導率隨濃度的升高而增大，但是2，4-D濃度過高也對愈傷組織誘導產生抑制作用。MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L與MS+2，4-D 2.5 mg/L處理對二倍體藜麥愈傷組織誘導率比較接近，均為85%左右，但是愈傷組織的形態差異較大，前者易形成淺黃色、疏松，表面呈球形顆粒狀的愈傷組織。這可能由于不同植物愈傷組織形成所需要的激素種類不同。這與俞涵譯等［10］的研究結果一致。而曹寧等［12］在四倍體藜麥的愈傷組織誘導中采用6-BA+NAA配伍，莖段的誘導率達75%。

在藜麥組織培養中，從愈傷組織誘導不定芽的分化是最難、最關鍵的環節之一［10］。段鵬慧等［13］以帶腋芽的莖段為外植體，僅研究了腋芽的萌發與增殖，而未涉及愈傷組織不定芽的分化情況。曹寧等［12］在藜麥不定芽的誘導中采用2.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA+2.0 mg/L 2-IP，其誘導率最高達86.67%，最低也有56.67%。而該研究設置7個不同激素配比，僅有0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2-IP配比能誘導形成不定芽，而且誘導率也僅為11.67%，在該激素配比下還誘導愈傷組織產生不定根，且誘導率高達60%。這說明采用生長素類的激素濃度過高，愈傷組織朝著不定根形成的方向分化，導致愈傷組織直接產生了不定根。

生長素類激素在誘導生根中占主導地位，不同激素種類及不同濃度誘導不定根的能力不同［14］。曹寧等［12］的藜麥快繁研究中，僅用1/2MS培養基誘導了藜麥生根，未涉及激素及濃度的配比研究。而段鵬慧等［13］的研究結果表明，在藜麥幼苗的生根培養中，采用MS+1.0 mg/L IBA+1.0 mg/L NAA或MS+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA生根率雖然達到90%以上，但是1/2MS+0.5 mg/L IBA培養基能誘導產生較多不定根數量，根較粗壯，移栽成活率較高。該研究中，不添加任何生長素，僅采用MS和1/2MS誘導生根率分別為73.33%和76.67%，且二者間無顯著差異（Pgt;0.05）。而單獨添加IBA和NAA，均能有效誘導組培苗產生不定根，然而IBA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L與IBA 2.0 mg/L的誘導生根率均到100%，比單獨添加NAA 0.1 mg/L的誘導生根率高，說明2種生長素疊加可以產生有效促進生根的增效作用。因而，1/2MS+0.5 mg/L IBA＋0.1 mg/L NAA或1/2MS+2.0 mg/L IBA均可以作為不定根誘導的最佳培養基。

4" 結論

該研究以藜麥的二倍體蒼白莖藜種子作為外植體進行組織培養研究，最佳消毒時間為2%次氯酸鈉消毒6 min；最佳愈傷組織誘導培養基為MS+1.0 g/L水解酪蛋白+35 mg/L肌醇+690 mg/L脯氨酸+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D，其誘導率為86.63%；不定芽分化誘導培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L 2-IP+1.0 mg/L KT，誘導率為11.67%；最佳生根培養基MS+2.0 mg/L IBA，生根率為100%；試管苗經煉苗和馴化后移栽能夠成活，該研究為二倍體蒼白莖藜快繁體系的建立及四倍體藜麥遺傳轉化體系的建立奠定了基礎。

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