莫匹羅星高產菌株選育

摘要：目的 莫匹羅星高產菌株選育，提高發(fā)酵水平。方法 用常壓室溫等離子體誘變（ARTP）選育技術，對莫匹羅星生產菌種PF16002059進行處理，同時結合抗自身代謝產物壓力進行選育，并通過搖瓶發(fā)酵對突變株進行篩選。結果 得到1株穩(wěn)定高產的生產菌株PF22033156，該菌株搖瓶發(fā)酵水平達到7062 mg/L，較出發(fā)菌株PF16002059提升98%。結論 本研究運用ARTP誘變，結合抗自身代謝產物進行選育，獲得新菌株熒光假單胞菌PF22033156（Pseudomonas fluorescens PF22033156），其莫匹羅星發(fā)酵效價顯著提升，且遺傳性狀穩(wěn)定，適用于產業(yè)化生產。

關鍵詞：莫匹羅星；熒光假單胞菌；ARTP誘變選育；抗性突變篩選

中圖分類號：R978.1" " " " 文獻標志碼：A

Screening of high yield strain of mupirocin

Xu Hao， Xu Meidong， Yang Xiaohu， Mao Liangliang， Ying Lingping， and Yu Zhen

（Zhejiang Key Laboratory of Antifungal Drugs， Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co.， Ltd， Taizhou 318000）

Abstract Objective This study aimed to screen for a high-mupirocin-producing strain and improve the fermentation level. Methods The breeding technology of atmospheric room temperature plasma mutation （ARTP） was used to screen the strain PF16002059， which produced mupirocin. At the same time， the resistance to self-produced metabolites was used as the selection pressure， and the mutants were screened by shake flask fermentation. Results A stable and high-yield production strain PF22033156 was obtained. The shake flask fermentation level of the strain PF22033156 reached 7062 mg/L， which was 98% higher than the original strain PF16002059. Conclusion ARTP mutagenesis combined with resistance to self-produced metabolites were used to screen for the new strain PF22033156 （Pseudomonas fluorescens PF22033156） in this study， which significantly increased the production of mupirocinm， and the genetic character of the mutant strain was stable， which made it suitable for industrial production.

Key words Mupirocin; Pseudomonas fluorescens; ARTP mutation screening; Resistance mutation screening

莫匹羅星（mupirocin）又稱假單胞菌酸A（pseudo-monic acid A），是由熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）發(fā)酵產生的一種局部外用的廣譜抗生素，其對部分革蘭陰性菌和大多數革蘭陽性球菌如金黃色葡萄球菌具有良好的抑殺作用。研究表明，莫匹羅星在人體血液內分解極快，毒副作用少，同時與其他抗菌藥物聯用時未發(fā)現交叉耐藥性，具有安全易用，經濟實惠和開發(fā)潛力巨大的優(yōu)點[1]。莫匹羅星的生產主要通過微生物發(fā)酵的方法進行，此前國內外對其分子結構、生物合成機制和生產工藝進行了大量研究。1977年，Chain等[2]確定了莫匹羅星的分子式C26H44O9和化學結構式（圖1）。1985年，Everett等[3]確認了莫匹羅星的空間結構。2014年Bojarska等[4]確認了莫匹羅星的晶體結構。2016年，Mukul Yadav[5]對莫匹羅星的生物合成機制進行了研究，確定了影響莫匹羅星合成的關鍵基因。2019年，Jack等[6]研究了熒光假單胞菌合成莫匹羅星的主要功能基因，并確認了其生物合成過程。2012年，楊正行[1]采用自然選育和紫外誘變對莫匹羅星生產菌種進行誘變育種，得到高產穩(wěn)定菌株SIPI-A.1036，發(fā)酵水平較原出發(fā)菌株提高了243%，此后對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，發(fā)酵水平提高75%。2020年，孫術超[7]采用自然選育和離子注入誘變技術對莫匹羅星生產菌種進行誘變育種，得到莫匹羅星突變株PFMUMP27-14，發(fā)酵效價達到2550 mg/L，此后對發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化研究。

雖然上述研究工作對莫匹羅星的發(fā)酵水平提升提供了一定幫助，但總體來看，莫匹羅星的發(fā)酵水平仍然較低，生產成本較高，不利于其商業(yè)化生產和應用。常壓室溫等離子體技術（ARTP）是近年來新興的菌種誘變選育技術，具有可控性強，操作過程安全簡便，誘變突變體性狀穩(wěn)定等特點[8]。本研究采用ARTP選育，結合抗自身代謝產物選育等手段，對莫匹羅星生產菌種進行誘變選育，得到一株穩(wěn)定高產的生產菌株PF22033156，該菌株搖瓶發(fā)酵水平達到7062 mg/L，較出發(fā)菌株PF16002059提升98%，且遺傳性狀穩(wěn)定，有利于莫匹羅星的商業(yè)化生產和應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發(fā)菌株

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）PF16002059，浙江海正藥業(yè)股份有限公司保存。

1.1.2 主要試劑

莫匹羅星標準品（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，純度≥99.0%）。

1.1.3 培養(yǎng)基

平板/斜面培養(yǎng)基（g/100 mL）：酵母抽提物0.5、胰蛋白胨1.0、氯化鈉1.0，瓊脂1.5，pH 7.5。

種子培養(yǎng)基（g/100mL）：葡萄糖 2.0、黃豆餅粉 2.0、酵母粉 1.0，碳酸鈣 0.2，pH 7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/100mL）：葡萄糖 3.0、甘油5.0，黃豆餅粉 2.0、棉籽餅粉 1.0、玉米漿干粉 0.5、硫酸銨0.05，氯化銨 0.05、氯化鈉0.5、碳酸鈣0.5， pH：7.5。

1.1.4 儀器設備

凈化工作臺（江陰市璜土凈化空調設備廠）；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（KBF240，德國賓得公司）；搖瓶機（INNOVA-5000，上海澤權儀器設備有限公司）；可見分光光度計（721N，上海精密科學儀器有限公司）；離心機（4KR，賽默飛世爾科技公司）；高效液相色譜儀（LC-20A，日本島津公司）；ARTP誘變育種儀（無錫思清源生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 單孢子菌懸液的制備

取出發(fā)菌株PF16002059的新鮮斜面一支，加入

5 mL無菌生理鹽水，將菌苔用接種針刮下后，將菌懸液倒入裝有10 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，玻璃珠振蕩打散，將打散后的菌懸液適量稀釋制成單孢子菌懸液（A600 0.6～0.8）。

1.2.2 ARTP誘變選育

取10 μL “1.2.1”制備好的單孢子菌懸液均勻涂布在金屬載片表面，用無菌鑷子將載片放到對應孔位，設置電源功率120 W，工作氣流量10 SLM，照射距離2 mm，各實驗組樣品照射時間分別為0、15、30、45、60、90和120 s。用無菌鑷子將處理好的載片放至裝有1 mL生理鹽水的EP管中，將EP管置于 振蕩器上振蕩1 min，形成新的菌懸液。將新的菌懸液進行梯度稀釋，取100 μL稀釋液涂布于平板培養(yǎng)基上，26℃培養(yǎng)6 d，以未經照射的菌懸液涂布平板作為對照，觀察菌落生長情況，并進行菌落計數，考察照射時間與致死率的關系。根據致死率，采用45和60 s照射時長，重復進行等離子體誘變選育，梯度稀釋后涂布平板，26℃培養(yǎng)6 d，挑取單菌落進行搖瓶初篩和復篩。

1.2.3 抗自身產物篩選

將“1.2.1”制備好的單孢子菌懸液進行梯度稀釋后分別涂布于含不同濃度莫匹羅星的平板培養(yǎng)基中，26 ℃培養(yǎng)6 d，觀察菌落生長情況，進行菌落計數并計算致死率。

1.2.4 搖瓶培養(yǎng)

取培養(yǎng)好的新鮮平板單菌落1個（Φ3～5 mm），接種于種子培養(yǎng)基中（裝量20 mL/250mL），將種子搖瓶置于26 ℃，搖床轉速250 r/min條件下培養(yǎng)24～32 h，以5%的移種量將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中（裝量20 mL/250mL）。將發(fā)酵搖瓶置于28 ℃，搖床轉速250 r/min條件下培養(yǎng)5 d。

1.2.5 分析方法

效價檢測：吸取放瓶發(fā)酵液0.5 mL，加入4.5 mL無水乙醇，振蕩20～30 min左右，3000 r/min離心10 min，吸取上清液1 mL進行高效液相色譜檢測。HPLC檢測方法如下：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C8（4.6 mm×250 mm， 5 μm），檢測波長：230 nm，流速：1.0 mL/min，進樣量：5 μL，柱溫：25 ℃，緩沖液：10.5 g乙酸銨溶于1 L去離子水中，用乙酸調節(jié)pH5.7，流動相：緩沖液：四氫呋喃：水=500：300：200。以莫匹羅星標準品為對照品，根據樣品效價=樣品峰面積/標準品峰面積×標準品濃度×稀釋倍數計算樣品效價，發(fā)酵效價取3次平均值。

1.2.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析，實驗數據以“平均值±標準差”表示，當Plt;0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變效果

2.1.1 ARTP誘變劑量的選擇

取100 μL ARTP誘變后的稀釋菌懸液涂布于平板培養(yǎng)基上，26 ℃培養(yǎng)6 d，以未經照射的菌懸液涂布平板作為對照，觀察菌落生長情況，并進行菌落計數，考察照射時間與致死率的關系。實驗結果如圖1所示，隨著照射時間的延長，菌落生長數量顯著下降，致死率顯著上升。照射時間45 s時，菌落致死率82.6%，照射時間60 s時，菌落致死率93.8%，照射時間90s及以上時，菌落致死率100%。ARTP誘變處理時間與菌落致死率之間存在正相關關系。根據菌落致死率曲線，確定45 s和60 s為莫匹羅星出發(fā)菌株PF16002059的ARTP誘變最佳處理時間。

2.1.2 ARTP突變株的選擇

以菌株PF16002059作為出發(fā)菌株，ARTP誘變處理45 s和60 s后的菌懸液分別進行梯度稀釋后涂布于平板培養(yǎng)基上，對照組（未經ARTP誘變）挑選20株單菌落，ARTP誘變處理45 s和60 s實驗組分別各挑取100株單菌落，按照“1.2.5”方法進種子搖瓶和發(fā)酵搖瓶進行效價比較。結果顯示，ARTP誘變處理45 s的實驗組有18株為正突變株（效價較對照組提升10%以上），誘變處理60 s的實驗組有15株為正突變株，其余實驗組為未突變菌株（效價較對照組提升+10%）和負突變株（效價較對照組降低10%以上）（表1）。

對33株正突變株進行多次復篩驗證，得到3株效價提升較多的突變菌株，其效價平均提高30%以上，其中突變株PF22028188搖瓶發(fā)酵水平較出發(fā)菌株PF16002059提升49%，發(fā)酵5 d放瓶效價達到5291 mg/L（表2）。

2.1.3 突變株的遺傳穩(wěn)定性研究

將“2.1.2”得到的高產突變株PF22028188連續(xù)傳代4次，將培養(yǎng)好的試管斜面置于4℃保藏，同時從5代斜面分別挑取少量菌苔進搖瓶種子培養(yǎng)基中，按照“1.2.4”培養(yǎng)條件進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，以驗證其傳代穩(wěn)定性（表3）。

表3結果顯示，以突變株PF22028188初代菌株F0作為對照，其新鮮斜面發(fā)酵相對效價（RT）為100，從F1～F4連續(xù)傳代4次，種子移種指標（pH）和發(fā)酵放瓶指標（pH和相對效價）均相對穩(wěn)定。說明該突變菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.2 抗自身產物選育

2.2.1 抗自身產物濃度的確定

以ARTP高產突變株PF22028188作為出發(fā)菌株，按照“1.2.1”的方法制備單孢子菌懸液，進行梯度稀釋后分別涂布于含不同濃度莫匹羅星的平板培養(yǎng)基中，26 ℃培養(yǎng)7 d，以未添加莫匹羅星的平板培養(yǎng)基作為對照，觀察菌落生長情況并計算致死率（表4）。

表4結果顯示在含莫匹羅星濃度6000 mg/L的平板培養(yǎng)基上菌落致死率92.6%，在含莫匹羅星濃度8000 mg/L的平板培養(yǎng)基上菌落致死率96.8%，在含莫匹羅星濃度10000和12000 mg/L的平板培養(yǎng)基上菌落完全不生長，即菌落致死率100%。最終確定抗自身產物濃度為6000和8000 mg/L。

2.2.2 抗自身產物突變株的選擇

以ARTP高產突變株PF22028188作為出發(fā)菌株，將出發(fā)菌株分別涂布于含莫匹羅星濃度6000和8000 mg/L的平板培養(yǎng)基上，在對照組（不含莫匹羅星）的平板上挑取20株單菌落，在莫匹羅星濃度6000和8000 mg/L實驗組分別挑取100株單菌落，分別進種子搖瓶和發(fā)酵搖瓶并按照“1.2.5”方法進行效價比較。結果顯示，莫匹羅星濃度6000和8000 mg/L的實驗組分別有11株和8株為正突變株（效價較對照組提升10%以上），其余實驗組為未突變菌株（效價較對照組提升+10%）和負突變株（效價較對照組降低10%以上），具體數據見表5。

對19株正突變株進行多次復篩驗證，得到2株效價提升較多的突變菌株，其效價平均提高20%以上，其中突變株PF22033156搖瓶發(fā)酵水平較ARTP誘變高產菌株PF22028188提升35%，較初始菌種PF16002059提升98%，發(fā)酵5 d放瓶效價達到7062 mg/L（表6）。

比較抗自身產物突變株PF22033156與原始菌株PF16002059的單菌落外觀與形態(tài)，結果如圖3所示： 原始菌株整體呈乳白色；經過ARTP和抗自身產物誘變選育后菌株整體呈淺黃略帶紅色，菌落更扎實飽滿。

2.2.3 突變株的遺傳穩(wěn)定性研究

采用“2.1.3”的方法對突變株PF22033156的遺傳穩(wěn)定性進行研究（表7）。結果顯示，以突變株PF22033156初代菌株F0作為對照，其新鮮斜面發(fā)酵相對效價（RT）為100，從F1～F4連續(xù)傳代4次，種子移種指標（pH）和發(fā)酵放瓶指標（pH和相對效價）均相對穩(wěn)定。說明該突變菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

3 討論

ARTP是近年來新興的菌種誘變選育技術，具有可控性強，操作過程安全簡便，誘變突變體性狀穩(wěn)定等特點。本研究采用ARTP誘變技術得到3株高產突變株，其中突變株PF22028188搖瓶發(fā)酵水平較出發(fā)菌株PF16002059提升60%，發(fā)酵5 d放瓶效價達到5291 mg/L，且傳代穩(wěn)定性良好。然而，菌株經過多次誘變后，對誘變劑的敏感度逐漸下降，正突變率也大幅下降；另一個方面，抗生素對其產生菌會具有反饋調節(jié)作用，為解除這種反饋調節(jié)，增加生產菌株對其自身產物的耐受性，可通過使之適應逐漸增加的抗生素濃度，或將經誘變處理的群體置于濃度梯度增加的抗生素中篩選[9]。因此后續(xù)以ARTP高產菌株PF22028188作為出發(fā)菌株，采用抗自身產物方式進行誘變育種，得到2株高產菌株，其中突變株PF22033156搖瓶發(fā)酵5 d效價達到7062 mg/L，較ARTP高產菌株PF22028188提升35%，較初始菌種PF16002059提升98%，且該菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，有利于莫匹羅星的商業(yè)化生產和應用。

參 考 文 獻

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