制備高效液相色譜用于紐莫康定雜質B1和B5的純化

摘要：目的 開展低含量成分的富集和純化研究，從Glarea lozoyensis菌體的發酵產物（即紐莫康定B0粗品）中制備出雜質B1和B5，并對其進行結構鑒定。方法 建立了基于制備高效液相色譜（prep-HPLC）技術的兩步純化法，第一步使用親水（HILIC）模式固定相對目標雜質進行富集，第二步采用反相（RPLC）模式固定相對雜質進行制備。得到的兩個雜質采用質譜（MS）、核磁（NMR）進行鑒定，確定化合物結構。結果 兩個雜質為B1和B5，相對分子質量均為1049 Da，色譜純度分別為97.83%和98.13%。經核磁鑒定，B1為B0的高酪氨酸類似物，B5為B0的鳥氨酸類似物。結論 本研究發展的基于prep-HPLC的兩步純化方法為低含量成分制備提供參考，第一步分離實現目標成分富集，第二步利用正交性的色譜柱提高分離選擇性，成功制備出雜質B1與B5，有助于B0雜質譜的建立和進一步的質量控制研究。

關鍵詞：紐莫康定；雜質；制備高效液相色譜；純化；結構鑒定

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Purification of pneumocandin B1 and B5 impurities based on preparative high performance liquid chromatography

Zhang Hongzhi，" Fu Qing， and Jin Yu

（School of Pharmacy， East China University of Science and Technology， Shanghai 200237）

Abstract Objective This research was carried out on the enrichment and purification of components with low content." The purification of impurities" B1 and B5 from Glarea lozoyensis fermentation broth （i.e.， the crude product of pneumocandin B0） was prepared， following their structures identification. Method A two-step purification method based on preparative high performance liquid chromatography （prep-HPLC） was established. The HILIC mode stationary phase was used in the first step in order to enrich the targeted impurities， and the RPLC mode stationary phase was used in the second step in order to purify the impurities. The two impurities were identified by mass spectrometry （MS） and nuclear magnetic resonance （NMR）. Results The two impurities were B1 and B5， with a relative molecular mass of 1049 Da and chromatographic purity of 97.83% and 98.13%， respectively. By NMR identification， B1 is a homo tyrosine analogue of B0 and B5 is an ornithine analogue of B0. Conclusion The two-step purification method based on prep-HPLC developed in this study provides a reference for the isolation of components of low content. The first-step separation was to enrich the target components. The second-step separation that used an orthogonal column to improve the separation selectivity. As a result， impurities B1 and B5 were successfully isolated. It is helpful in establishing the impurity profile of B0 and furthering its quality control.

Key words Pneumocandin; Impurity; Preparative high performance liquid chromatography; Purification; Structure identification

卡泊芬凈（caspofungin）是棘白菌素類（echinocandins）抗真菌藥物的代表，其通過抑制真菌細胞中β-1，3-D-葡聚糖合成酶的活性實現抗真菌作用，因其抗菌譜廣、交叉耐藥性小且不經過腎臟代謝等優勢而被廣為使用[1-2]。紐莫康定類化合物是由天然和非天然氨基酸共同形成的六元環肽，來源于野生Glarea lozoyensis菌體的發酵產物，其成員之一紐莫康定B0（pneumocandin B0）是合成卡泊芬凈的前體，B0依次由3，4-二羥基高酪氨酸、3-羥基谷氨酰胺、3-羥基脯氨酸、4，5-二羥基鳥氨酸、蘇氨酸、4-羥基脯氨酸連接形成封閉環肽，并且4，5-二羥基鳥氨酸的氨基酸殘基的N端連接了10，12-二甲基肉豆蔻酸的側鏈，將環肽中6個氨基酸按成環順序依次編號為position 1～6（圖1）[3-5]。由野生Glarea lozoyensis生產發酵紐莫康定B0的過程中會產生眾多的相關雜質，基于position 3脯氨酸取代基團的差異，可將其分為A、B、C、D、E類，其position 3對應的結構依次是4-甲基-3-羥基脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、3，4-二羥基脯氨酸和脯氨酸[6-9]。每一類雜質中又由于其他氨基酸取代基差異而包含了不同化合物，具體如圖1所示。

當前，國內外關于B0的研究主要包括改良發酵菌株[10-12]、優化發酵工藝[12-14]、開發制備純化方法[15-18]及建立分析檢測方法[19-21]，而針對B0雜質的研究相對較少。曾凡洲等[22]利用高效液相色譜（HPLC）技術制備紐莫康定雜質C0，并結合質譜、紅外及核磁數據對其結構進行確認。孫新強等[23]開發了親水作用色譜-反相色譜（HILIC-RPLC）方法用于純化紐莫康定雜質，并通過核磁技術鑒定其為B0絲氨酸類似物。本文利用制備高效液相色譜（prep-HPLC）技術，從紐莫康定粗品中分離出2種雜質B1和B5，并通過核磁和質譜進行結構鑒定，為B0雜質研究提供可借鑒的方法。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

Waters HPLC Alliance 2695配置包括四元溶劑管理系統、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器（PDA）、Empower 3數據管理系統（美國Waters公司）；制備液相色譜儀配置包括高壓輸液泵、紫外（UV）檢測器、直徑50 mm動態軸向壓縮柱（50 DAC）、Easy Chrom數據管理系統（江蘇漢邦科技股份有限公司）；旋轉蒸發儀（鄭州長城科工貿易有限公司）；冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；氮吹儀（拓赫機電科技有限公司）；質譜數據由SCIEX X500R QTOF質譜儀（美國AB公司）測定；核磁數據由Bruker Avance NEO 400 MHz核磁共振儀（德國布魯克公司）測定。

1.2 材料及試劑

紐莫康定粗品由國科化物生物技術服務部提供。

HPLC級MeOH和ACN購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；制備級MeOH和ACN購自安徽澤生科技有限公司；HPLC用水為娃哈哈純凈水，經0.22 μm水膜過濾；制備用水為實驗室自制純化水。

1.3 實驗方法

1.3.1 HPLC純度分析方法

色譜柱為YMC-pack ODS-AQ （3.0 mm×150 mm， 3 μm）；流動相為ACN/H2O=40/60 （V/V）；流速為0.5 mL/min；柱溫40 ℃；進樣室溫度為5 ℃；波長為210 nm。

1.3.2 第一步純化

粗品使用MeOH溶解，濃度為100 mg/mL，過0.45 μm有機膜，備用。

制備柱為X （50 mm×250 mm， 10 μm），流動相為MeOH/H2O=90/10 （V/V），流速為70 mL/min，進樣體積為5 mL，檢測波長為210 nm。

第一步純化收集兩個餾分，將兩個餾分在40 ℃條件下旋轉蒸發濃縮至干，進行第二步純化。

1.3.3 第二步純化

第一步純化所得樣品用MeOH溶解，濃度為100 mg/mL，過0.45 μm有機膜，備用。

制備柱為C18 （50 mm×250 mm， 10 μm）；B1的洗脫條件為ACN/H2O=45/55（V/V）；B5的洗脫條件為ACN/H2O=40/60 （V/V）；流速為70 mL/min；進樣體積為5 mL；檢測波長為210 nm。

收集目標餾分，經過旋轉蒸發儀濃縮、氮吹、冷凍干燥后得到白色絮狀固體。

1.3.4 質譜及核磁條件

質譜條件：電噴霧電離源（ESI）正離子模式，毛細管電壓5 kV，去簇電壓51 V，離子源溫度500 ℃；負離子模式，毛細管電壓-4.4 kV，去簇電壓-51 V，離子源溫度450 ℃。氣體流速：0.3 L/min，樣品濃度2 mg/mL，掃描范圍100～1200 Da。樣品采用直接進樣模式測定。

核磁條件：將適量樣品溶于CD3OD3中，測定1H NMR （400 MHz）和13C NMR （101 MHz）。

2 實驗結果與分析

2.1 紐莫康定粗品分析

紐莫康定粗品分析結果如圖2所示，其中B0的保留時間為23.4 min，色譜峰對稱性良好，與相鄰雜質分離充分。除B0外，譜圖中存在保留時間為27.2 min與31.3 min的色譜峰，其相對于B0的相對保留時間（relative retention time， RRT）為1.16和1.33，峰面積百分比分別為41%和20%。初步推算RRT 1.33為紐莫康定雜質B1，RRT 1.16為紐莫康定雜質B5，確定為本次雜質制備的目標。

2.2 第一步親水模式制備

雖然目標雜質在粗品中的純度比較高，但是樣品組成仍然比較復雜，需要進一步純化。分離目標為B0的結構類似物，屬于多肽類物質，第一步純化選擇了離子型親水固定相X。離子型官能團既有利于固定相表面富水層的形成，同時又可提供附加的靜電作用，從而提高方法的分離選擇性。實驗先使用X分析柱（4.6 mm×250 mm， 10 μm）進行模擬制備，優化有機相種類（ACN和MeOH）和比例，得到MeOH/H2O=90/10 （V/V）的流動相條件；接著優化流速，在0.6 mL/min條件下實現雜質與B0的完全分離。根據X制備柱（50 mm×250 mm， 10 μm）尺寸進行流速換算，確定制備流速為70 mL/min。上樣量是制備的重要指標，樣品采用MeOH溶解，濃度為100 mg/mL，逐漸增加進樣體積，當進樣體積為5 mL時，對應的上樣量為填料質量的0.15%，此時雜質B1、B5與B0的分離度依然較好（圖3A）。第一步制備涉及到多次重復進樣以達到富集B1和B5的目的，所以重復性是保證富集效果的重要因素。連續制備3針，譜圖均重復，說明該方法的重復性良好。根據制備譜圖結果（圖3A），收集兩個餾分，經檢測分別包含B5和B1，HPLC純度分別為74.15%和77.42%，經過計算，雜質B5和B1的第一步回收率分別為95.49%和92.86%。

2.3 第二步反相模式制備

第二步制備中采用了反相色譜模式，選用了最常用的C18固定相。因為親水色譜與反相色譜的分離機理不同，兩者有很好的互補性，所以能解決親水色譜中某些色譜峰分離不充分的問題，從而有效提高目標雜質的純度。經過方法優化，在C18固定相上采用ACN/H2O為流動相，優化洗脫比例，確定B1用45%ACN，B5用40%ACN進行分離，可以達到目標峰的理想分離效果。為了保證制備的效率和純度，在制備過程中按照時間收集B1和B5餾分（圖3B和3C），間隔時間為3 min，經過HPLC檢測，合并純度≥97%的餾分。對餾分依次進行柱濃縮、旋蒸和凍干處理，最終得到B1重量為276 mg，B5為522 mg，HPLC純度分別為97.83%、98.13%。B1和B5性質穩定，在后處理過程中純度均未發生顯著變化。

2.4 結構鑒定

2.4.1 質譜結構解析

對B1分別進行ESI-及ESI+模式檢測，m/z 1047.5625為[M-H]-峰，1049.5730為[M+H]+峰，1071.5548為[M+Na]+峰，推測B1分子量為1048.5 Da，元素組成為C50H80N8O16。

對B5分別進行ESI-及ESI+模式檢測，m/z 1047.5599為[M-H]-峰，1049.5743為[M+H]+峰，1071.5562為[M+Na]+峰，1031.5634為[M-H2O+H]+，推測B5分子量為1048.5 Da，元素組成為C50H80N8O16。

2.4.2 核磁結構解析

表1為B1的核磁數據匯總表。按照該化合物的結構將其分為4-羥基高酪氨酸（4-OH HTyr）、3-羥基谷氨酰胺（3-OH Gln）、3-羥基脯氨酸（3-OH Pro）、4，5-二羥基鳥氨酸（4，5-DiOH Orn）、蘇氨酸（Thr）、4-羥基脯氨酸（4-OH Pro）和10，12-二甲基肉豆蔻酸（10，12-DMM）7個片段。1H-1H-COSY圖譜中顯示如下自旋偶合相關體系：4-OH HTyr：2-CH→3-CH2→4-CH，2′/6′-CH→3′/5′-CH；3-OH Gln：2-CH→3-CH→4-CH2；3-OH Pro：2-CH→3-CH→4-CH2→5-CH2；4，5-DiOH Orn：2-CH→3-CH2→4-CH→5-CH；Thr：2-CH→3-CH→4-CH3；4-OH Pro：2-CH→3-CH24-CH5-CH2；10，12-DMM：2-CH2→3-CH2→4-CH2→5-CH2→6-CH2→7-CH2→8-CH2→9-CH210-CH→11-CH2→12-CH→13-CH2→14-CH3。HMBC譜中，4-OH HTyr的H-2與4-OH Pro中的C-1相關，表明4-OH HTyr通過酰胺鍵連接在4-OH Pro的C-1位；3-OH Gln的H-2與4-OH HTyr中的C-1相關，表明3-OH Gln通過酰胺鍵連接在4-OH HTyr片段的C-1位；3-OH Pro的H-5與3-OH Gln中的C-1相關，表明3-OH Pro通過酰胺鍵與3-OH Gln相連；4，5-DiOH Orn的H-5與3-OH Pro中的C-1相關，表明4，5-DiOH Orn通過酰胺鍵與3-OH Pro相連；同樣，Thr的H-2與4，5-DiOH Orn中的C-1相關，4-OH Pro的H-5與Thr中的C-1相關，4，5-DiOH Orn的H-2與10，12-DMM中的C-1相關，表明上述片段同樣通過酰胺鍵相連。通過二維相關譜圖，把各基團連接，得到B1結構，如圖1所示。B1為B0的高酪氨酸類似物，Position 1上為4-羥基高酪氨酸，而B0為3，4-二羥基高酪氨酸。

B5的核磁數據匯總見表1。其與B1的區別在Position 1和4上，B5分別為3，4-二羥基高酪氨酸和5-羥基鳥氨酸，而B1為4-羥基高酪氨酸和4，5-二羥基鳥氨酸。下文僅分析其與B1結構差異部位。1H-1H-COSY圖譜顯示，3，4-DiOH HTyr的自旋耦合體系為2-CH→3-CH→4-CH，2′/6′-CH→3′/5′-CH；5-OH Orn的自旋耦合體系為2-CH→3-CH2→4-CH2→5-CH。HMBC譜中，3，4-DiOH HTyr的H-2與4-OH Pro中的C-1相關，表明3，4-DiOH HTyr通過酰胺鍵與4-OH Pro相連；3-OH Gln的H-2與3，4-DiOH HTyr中的C-1相關，表明3-OH Gln通過酰胺鍵連接在3，4-DiOH HTyr片段的C-1位；同樣，5-OH Orn的H-5與3-OH Pro中的C-1相關，Thr的H-2與5-OH Orn中的C-1相關，5-OH Orn的H-2與10，12-DMM中的C-1相關，表明上述片段同樣通過酰胺鍵相連。通過二維相關譜圖連接各基團，得到B5的結構，如圖1所示。該化合物為B0的鳥氨酸類似物，Position 4上為5-羥基鳥氨酸，而B0為4，5-二羥基鳥氨酸。

結合B1與B5的1H-1H COSY和HMBC譜圖數據，標注了兩個化合物的關鍵HMBC相關信息，見圖4。

3 結論

本文介紹了從B0粗品中分離純化紐莫康定雜質的制備高效液相色譜方法，通過HILIC與RPLC模式相結合，兩步純化實現雜質制備，經質譜及核磁鑒定，兩種雜質為B1和B5，分別為B0的高酪氨酸類似物和鳥氨酸類似物，純度達到97.83%和98.13%，所制備的雜質可以作為紐莫康定B0質量控制的雜質對照品。對于發酵來源的樣品，雜質成分復雜且含量較低，僅通過一步制備往往無法得到高純度的單體化合物。本文建立了互補的兩步制備方案：第一步對低含量雜質進行富集，要求方法穩定且重復性好，具有一定的分離效果；第二步提高方法分離選擇性，提高目標雜質純度。該方案實現了紐莫康定粗品中雜質B1與B5的富集和制備，對紐莫康定B0其他雜質的純化具有借鑒意義，為低含量成分制備提供方法參考。

參 考 文 獻

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