宏基因組二代測序技術對結核病診斷價值的Meta分析

摘要：目的" 應用Meta分析評價宏基因組二代測序技術在結核病診斷中的應用價值。方法" 檢索PubMed MEDLINE、Ovid MEDLINE、Web of Science、Cochrane Library、EMbase、Scopus、中國知網、萬方、維普數據庫中有關宏基因組二代測序技術應用于診斷結核病的相關文獻，檢索時限為建庫至2021年10月31日，由2名研究者獨立進行文獻檢索、篩選、數據提取、質量評價。使用MetaDISc 1.4軟件進行閾值效應和異質性檢驗、數據的合并分析，使用StataMP 16軟件繪制Deek’s漏斗圖評估發表偏倚。結果" 共檢索出623篇文獻，依據納入和排除標準最終納入14項研究，涉及2159個樣本，其中結核病樣本964個。Meta分析結果顯示，宏基因組二代測序技術診斷結核病的合并敏感度為0.600（95%CI：0.568～0.631），合并特異度為0.985（95%CI：0.976～0.991），合并陽性似然比為30.513（95%CI：18.536～50.226），合并陰性似然比為0.414（95%CI：0.357～0.481），合并診斷比值比為77.408（95%CI：46.090～130.010），合并曲線下面積為0.9680，合并Q*值為0.9167。Deek's漏斗圖提示不存在發表偏倚（P＞0.05）。結論" 宏基因組二代測序技術對結核病具有較高的診斷價值，可作為快速診斷的有效方法。

關鍵詞：宏基因組二代測序；分子診斷技術；結核病

中圖分類號：R825.2" " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.05.003

文章編號：1006-1959（2024）05-0020-07

Meta-analysis of the Diagnostic Value of Metagenomic Next-generation Sequencing Technology

for Tuberculosis

WANG Chao-ran1，2，YANG Zong-qiang1，NIU Ning-kui1

（1.Department of Orthopedics，General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia，China;

2.School of Clinical Medicine，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia，China）

Abstract：Objective" To evaluate the diagnostic value of metagenomic next-generation sequencing technology for tuberculosis using Meta-analysis.Methods" PubMed MEDLINE， Ovid MEDLINE， Web of Science， Cochrane Library， EMbase， Scopus， CNKI， Wanfang， and VIP databases were searched for relevant literature on the application of metagenomic next-generation sequencing technology in the diagnosis of tuberculosis. The search time was from the establishment of the database to October 31， 2021. Two researchers independently performed literature search， screening， data extraction， and quality evaluation. MetaDISc 1.4 software was used to test the threshold effect and heterogeneity， and the data were combined and analyzed. StataMP 16 software was used to draw Deek's funnel plot to evaluate publication bias.Results" A total of 623 papers were retrieved. According to inclusion and exclusion criteria， 14 studies involving 2159 samples， including 964 tuberculosis samples. Meta-analysis showed that the pooled sensitivity of metagenomic next-generation sequencing technology for the diagnosis of tuberculosis was 0.600 （95%CI：0.568-0.631）， the pooled specificity was 0.985 （95%CI：0.976-0.991）， the pooled positive likelihood ratio was 30.513 （95%CI：18.536-50.226）， the pooled negative likelihood ratio was 0.414 （95%CI：0.357-0.481）， the pooled diagnostic odds ratio was 77.408 （95%CI：46.090-130.010）， the pooled area under the curve was 0.9680 and the pooled Q*-value was 0.9167. Deek's funnel plot suggested no publication bias （Pgt;0.05）.Conclusion" The metagenomic next-generation sequencing technology has high diagnostic value for tuberculosis， and can be used as an effective method for rapid diagnosis.

Key words：Metagenomic next-generation sequencing;Molecular diagnostic technology;Tuberculosis

結核病（tuberculosis，TB）是一個迄今仍然威脅人類健康的慢性傳染病和重大公共衛生問題，其由結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起，可以累及全身各個系統，引起肺結核、結核性腦膜炎、骨與關節結核在內的多種疾病。TB的臨床表現多樣，給臨床診斷帶來極大困難，尤其是肺外結核病往往十分隱匿[1]。伴隨著耐藥結核病患者的日益增多，已有模型表明，在缺乏快速診斷和特異性治療的情況下，TB發病率將繼續增加[2]。宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）也被稱為高通量或大規模并行測序，可以無偏倚地分析臨床樣本中的微生物和宿主核酸含量，具有覆蓋廣、快速等特點，已被應用于中樞神經系統、血液系統、呼吸系統、消化系統等多個領域感染性疾病的病原檢測[3]。盡管mNGS技術應用于支氣管灌洗液、腦脊液等多種檢材診斷TB的研究日益增多，但單項研究的樣本量不大，報道的敏感度存在較大差異，因此其診斷價值仍有爭議。本研究采用Meta分析的方法對mNGS技術診斷TB的文獻進行系統和客觀評價，以評估mNGS技術在TB診斷中的應用價值，為臨床診療提供決策參考。

1資料與方法

1.1檢索策略" 檢索PubMed MEDLINE、Ovid MEDLINE、Web of Science、Cochrane Library、EMbase、Scopus、中國知網（CNKI）、萬方、維普數據庫中通過宏基因組二代測序技術診斷TB的診斷性研究論文，檢索時限為建庫起至2021年10月31日，語種限制為中文和英文。中文檢索詞：“宏基因組二代測序”“二代測序”“高通量核苷酸序列分析”“結核”及其他自由詞；英文檢索詞：“Metagenomic Next-generation Sequencing”“Next Generation Sequencing”“High Throughput Nucleotide Sequencing”“Tuberculosis”及其他自由詞。以維普數據庫為例，檢索策略如下：（（題名或關鍵詞=結核 OR 題名或關鍵詞=脊柱結核） AND （（（（（題名或關鍵詞=宏基因組 OR 題名或關鍵詞=宏基因組學） OR 題名或關鍵詞=宏基因二代測序） OR 題名或關鍵詞=宏基因組二代測序） OR 題名或關鍵詞=高通量核苷酸序列檢測） OR 題名或關鍵詞=二代測序））。

1.2納入與排除標準" 納入標準：①研究類型：采用mNGS技術診斷MTB的前瞻性研究或回顧性研究；②研究對象：確診為MTB的患者，診斷標準明確，對照組包括涉及的部位可能存在的結節、炎癥、癌癥等其他臨床需要和MTB進行鑒別的疾病；③結局指標：真陽性值（true positive，TP）、假陽性值（1 positive，FP）、假陰性值（1 negative，FN）和真陰性值（true negative，TN）。排除標準：①重復發表的文獻或數據；②會議摘要、學位論文、病例報道、綜述、Meta分析、系統評價等。

1.3文獻篩選及數據提取" 使用Endnote X9軟件剔除重復文獻，由2名獨立研究員閱讀初檢文獻的標題、摘要，按照文獻的納入與排除標準進行文獻篩選，對篩選出的文獻進一步閱讀全文，最終確定納入分析的文獻。同樣由以上2名獨立研究員對納入文獻進行信息采集和數據提取，包括第一作者、發表年份、研究對象、樣本量、診斷標準、診斷試驗參數TP、FP、TN、FN等。如有不一致可以通過討論達成共識，或向專家咨詢解決問題。

1.4文獻質量評價" 由2名獨立研究員使用Review Manager 5.4軟件，根據診斷準確性研究質量評價工具-2（quality assessment of diagnostic accuracy studies-2，QUADAS-2）[4]評價文獻質量，包括病例選擇、待評價試驗、金標準、病例流程及進展情況4個部分，共11個評價條目，對每個條目做出“是”“否”“不清楚”的判斷。若一個范圍內所有標志性問題判斷均為“是”，則評定為“低偏倚風險”；若所有信息化問題判斷中有一個為“否”，則評定為“高偏倚風險”；若文獻中沒有提供詳細的內容以致評價者難以做出判斷，則評定為“不清楚”。

1.5統計學方法" 使用MetaDISc 1.4軟件進行數據的合并分析。納入研究的閾值效應通過計算Spearman相關系數并擬合受試者工作特征曲線（summary receiver operating characteristic，SROC）進行評估，標準如下：①存在閾值效應：Spearman相關系數呈現相關性且P＜0.05；②不存在閾值效應：Spearman相關系數較小且P＞0.05。通過診斷比值比Cochrane-Q檢驗I2值評估納入研究的異質性，相應地選擇模型對納入研究的原始數據進行Meta分析，標準如下：I2≤25%為異質性較小，25%＜I2≤50%為中度異質性，選擇固定效應模型（fixed effect model，FEM）；I2＞50%為高度異質性，選擇隨機效應模型（random effects model，REM）。使用StataMP 16軟件繪制Deek's漏斗圖評估發表偏倚。

2結果

2.1文獻篩選流程及檢索結果" 根據預先設定的檢索策略，初步獲得相關文獻623篇，剔除重復文獻后剩余381篇，剔除綜述、系統評價、Meta分析、學位論文等文獻62篇，剩余319篇閱讀題目和摘要后排除不相關文獻250篇，剩余69篇獲取全文進行閱讀，再次排除不符合納入標準和診斷標準的文獻55篇，最終共納入14篇文獻[5-18]，文獻篩選流程及結果見圖1。

2.2納入文獻的基本特征及質量評價結果" 共納入14項原始研究，基本情況見表1。所有原始研究類型均為采用mNGS技術診斷MTB的前瞻性研究或回顧性研究，研究對象均為經過病原學（包括細菌學和分子生物學）或臨床上結合流行病史、臨床表現、影像學檢查、結核免疫學檢測、鑒別診斷及抗結核藥物治療等確診為MTB的患者，診斷標準明確，對照組均包括涉及的部位可能存在的結節、炎癥、癌癥等其他臨床需要和MTB進行鑒別的疾病。納入文獻的質量均較高，其QUADAS-2偏倚風險評價見圖2、圖3。

2.3閾值效應和異質性檢驗" Spearman相關系數=0.220，P=0.449，SROC曲線中各數據點未呈“肩臂狀”分布，表明本次Meta分析納入的原始研究間不存在閾值效應，見圖4。異質性檢驗結果為：敏感度（？字2=59.82，P=0.000，I2=78.10%）、特異度（？字2=9.38，P=0.744，I2=0）、陽性似然比（positive likelihood ratio，PLR）（Cochran-Q=3.98，P=0.991，I2=0）、陰性似然比（negative likelihood ratio，NLR）（Cochran-Q=39.11，P=0.000，I2=66.80%）、診斷比值比（diagnostic odds ratio，DOR）（Cochran-Q=6.74，P=0.915，I2=0），其中敏感度與NLR異質性較大，采用REM合并效應量，特異度、PLR、DOR異質性較小，采用FEM合并效應量。

2.4診斷性實驗的評價指標" Meta分析結果顯示，mNGS技術診斷TB的合并敏感度為0.600（95%CI：0.568～0.631），合并特異度為0.985（95%CI：0.976～0.991），合并PLR為30.513（95%CI：18.536～50.226），合并NLR為0.414（95%CI：0.357～0.481），合并DOR為77.408（95%CI：46.090～130.010），合并計算曲線下面積（area under the curv，AUC）為0.9680，合并Q=0.9167，見圖5。

2.5 Deek's發表偏倚檢驗" 由Deek's模型繪制的漏斗圖中各研究散點在中線左右兩側基本呈對稱分布，P＞0.05，見圖6，提示納入研究的原始文獻之間存在發表偏倚的可能性較小。

3討論

早診斷、早治療是實現“終結結核病”戰略、實現早期干預及個體化治療、改善預后效果的關鍵環節，延遲診斷將導致個體化治療的延誤和MTB的傳播[19]。實驗室檢查對TB的防治及診斷起著不可或缺的作用，包括以全菌體為靶標的細菌學診斷、以細菌核酸為靶標的分子生物學診斷、以機體免疫反應及其產物為靶標的血清學診斷、病理學診斷及影像學診斷[20]。細菌學診斷包括涂片鏡檢和MTB培養，前者廉價、快速、方便、簡單，但敏感度不高、易受染色及鏡檢技術影響、不能區分MTB及非MTB；后者被世界衛生組織稱為TB診斷的“金標準”，但檢測周期較長，難以為臨床提供時效性的檢測結果。近年來，隨著技術日趨成熟，出現了GeneXpert MTB/RIF、線性探針、T-SPOT等一系列診斷方法[21-23]，但也存在著以下不足：GeneXpert MTB/RIF對于肺外結核，尤其是對于菌量極少的標本檢出率不高；線性探針技術對實驗室環境及人員水平要求較高，且受膜上探針的限制，不能檢測出所有的突變類型；T-SPOT難以區分活動性結核和潛伏性結核感染。

mNGS技術通過對疑似感染患者樣本中微生物和宿主的核酸進行高通量測序，可以無偏倚地分析臨床樣本中包括病毒、細菌、真菌和寄生蟲在內的多種微生物、耐藥基因和毒力因子[24，25]，有研究顯示其敏感度、特異度高于傳統MTB培養[26]。近年來mNGS技術應用于支氣管灌洗液、腦脊液等多種檢材診斷TB的研究在逐漸增多，但單項研究的樣本量不大，報道的敏感度存在較大差異，因此其診斷價值仍有爭議。為了評估mNGS技術在TB中的診斷價值，為臨床提供參考，本研究采用Meta分析的方法對mNGS技術診斷TB的文獻進行系統和客觀評價，以期更精確地早期診斷TB。

本研究共納入14項通過mNGS技術診斷TB的原始研究，涉及2159個樣本，通過Meta分析對診斷指標進行計算并定量合并分析。本研究納入的14項研究無閾值效應，除敏感度與NLR異質性較大，采用REM進行數據合并分析外，其余指標均采用FEM進行數據合并分析，結果顯示mNGS技術診斷TB的合并敏感度為0.600（95%CI：0.568～0.631），合并特異度為0.985（95%CI：0.976～0.991），合并PLR為30.513（95%CI：18.536～50.226），合并NLR為0.414（95%CI：0.357～0.481），合并DOR為77.408（95%CI：46.090～130.010），合并AUC=0.9680，合并Q=0.9167，合并PLR＞10，提示mNGS在TB的診斷中具有較高的臨床價值，可作為TB快速診斷的有效方法。

盡管通過mNGS技術進行的泛病原體檢測的潛力已在許多研究和臨床環境中得到證實，該技術目前也存在著一部分弊端。首先，mNGS操作過程復雜，檢測成本高，邊際效用低[27]，且目前沒有國家和地區正式批準mNGS用于臨床感染性疾病的病原診斷[28]，導致其結果原則上都需要其他方法驗證，使用受到限制。其次，臨床提供的檢驗樣本多元，對mNGS結果的解釋缺乏可信的標準[26]，造成檢測質量良莠不齊。但隨著測序技術的不斷進步，有專家預測在未來5年，更多前瞻性臨床試驗數據將評估mNGS的臨床效用，其總體成本和周轉時間將繼續下降，在對抗傳染病方面發揮關鍵作用[29]。

本研究存在著以下局限性：目前有關mNGS診斷TB的原始研究較少，檢材的處理方法存在差異，可能造成偏倚；納入的原始研究所涉及到的檢材性質、疾病類型不同，患者間具有個體差異，將導致潛在的臨床異質性；納入的原始研究中，大部分為回顧性設計類型，降低了研究的質量；本研究只納入了中、英文文獻，可能造成語言偏倚。

綜上所述，宏基因組二代測序技術對結核病具有較高的診斷價值，可作為快速診斷的有效方法，其發展前景樂觀，但在相關部門批準應用之前尚需更多前瞻性、大樣本、高質量的臨床對照研究對其進行持續性評估。

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收稿日期：2023-04-02；修回日期：2023-04-17

編輯/王萌