大豆抗氧化肽的制備及對大蒜根尖過氧化的保護作用

鄒文廣，尹樂斌，賀超，劉聰，龍盼，李敏娟

摘要：為探究不同蛋白酶酶解大豆分離蛋白（soybean isolate protein，SPI）對多肽得率及體外抗氧化活性的影響，采用6種蛋白酶（堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶）進行篩選，測定酶解產物多肽得率、光譜特性及體外抗氧化能力，分析其對過氧化氫誘導的大蒜根尖氧化損傷的保護作用。結果表明，堿性蛋白酶酶解條件下，多肽得率最高為67.78%；多肽在200～230 nm處有最大吸收峰；6種多肽在酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶均有吸收峰；所有多肽均具有較好地清除自由基能力，且隨著多肽濃度的增加而增加。綜合其抗氧化活性評價，堿性蛋白酶制備的多肽清除能力均優于其他蛋白酶；經多肽處理后大蒜根尖細胞凋亡程度下降45.90%。

關鍵詞：蛋白酶；酶解；多肽；體外抗氧化活性；細胞凋亡

中圖分類號：TS214.2? ? ? ? ? ? ? ? ??文獻標志碼：A

Preparation of soybean antioxidant peptides and their protective effect against garlic root tip peroxidation

ZOU Wenguang1， YIN Lebin1，2， HE Chao1， LIU Cong1， LONG Pan1， LI Minjuan1

（1. School of Food and Chemical Engineering， Shaoyang University， Shaoyang 422000， China; 2. Key Laboratory of Soybean Product Processing and Safety Control in Hunan Province， Shaoyang 422000， China）

Abstract： In order to investigate the effects of enzymatic hydrolysis of soybean protein isolate with different proteases on the yield of polypeptide and antioxidant activity in vitro， six proteases （alkaline protease， papain， bromelain， neutral protease， trypsin， pepsin） were selected to determine the yield， spectral characteristics and antioxidant capacity of the polypeptide products of enzymatic hydrolysis. The protective effect on oxidative damage of garlic root tips induced by hydrogen peroxide was analyzed. The results show that the highest polypeptide yield was 67.78% under the condition of alkaline protease hydrolysis. The maximum absorption peak of polypeptide was at 200-230 nm. The absorption peaks of the 6 peptides were found in the amide A， B， Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ bands. All peptides have good scavenging ability of free radicals， and the ability increases with the increase of peptide concentration. According to the evaluation of antioxidant activity， the scavenging ability of polypeptide prepared by alkaline protease is better than that of other proteases. The apoptosis of garlic root tip cells decreases by 45.90% after polypeptide treatment.

Key words： protease; enzymatic hydrolysis; polypeptide; in vitro antioxidant activity; cell apoptosis

大豆分離蛋白[1]（soybean isolate protein，SPI）是經過各種物理或化學方法處理得到的一種優良蛋白質，其中含有8種人體必需氨基酸[2]，其具有獲取價格低廉、生物活性強等特點[3]。由于SPI具有大量的帶電氨基酸和疏水氨基酸殘基，因此，SPI是傳遞疏水生物活性物質的優良載體[4]。

生物活性肽可以通過酸水解、酶解或其他方法從蛋白質中獲得。采用酶法制備的生物活性肽，具有條件溫和、專一性強、副產物少等優勢[5]，且酶解后可以改善其功能特性[6]。不同的酶在蛋白質中酶切位點不同，肽段所呈現的功能特性也會不同，大豆多肽包括抗菌肽、抗氧化肽等[7]。大豆抗氧化肽是酶解SPI后得到的具有良好生物活性的物質；同時，也具有比酶解前蛋白更好的理化特質[8]。鄭輝等[9]利用不同蛋白酶水解碧根果蛋白制備蛋白肽，研究發現堿性蛋白酶水解碧根果蛋白6 h時水解度最高為32.54%。不同蛋白酶酶解得到的多肽，具有不同的分子量以及生物活性。探究不同蛋白酶酶解產物的生物活性，可以促進多肽產品的開發利用。

通過對6種蛋白酶制備的大豆抗氧化肽進行篩選，比較其酶解后多肽的得率、光譜特性和體外抗氧化活性以評估其抗氧化能力。篩選出抗氧化能力最強的多肽，探究其對過氧化氫誘導大蒜根尖細胞的過氧化保護能力，為大豆抗氧化肽制備及多肽產品的開發提供一定的理論依據。

1材料與方法

1.1原料與試劑

SPI（河南糖柜食品有限公司）；蛋白酶（食品級，河南匯泉生物科技有限公司）；鄰苯三酚（上海麥克林生化科技股份有限公司）；水楊酸[福晨（天津）化學試劑有限公司]；無水乙醇（成都金山化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2主要儀器與設備

LS220A電子天平（上海天美天平儀器有限公司）；UV-2600i 紫外可見分光光度計[島津儀器（蘇州）有限公司]；3H16RI智能高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；SCIENTZ-18N 真空冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；VM-01U（HYQ-3110）渦旋混勻器（蘇州捷美電子有限公司）。

1.3試驗方法

1.3.1蛋白酶篩選

SPI→蛋白酶酶解→離心→超濾→真空冷凍干燥→抗氧化肽[10]，不同蛋白酶處理的酶解條件見表1[11]。

1.3.2多肽得率的測定

參照郭耀華等[12]的方法進行測定。

1.3.3多肽紫外光譜測定

稱取0.01 g多肽凍干粉，定容至10 mL，用紫外-可見分光光度計測定200～800 nm波長的吸光度，測定多肽紫外光譜。

1.3.4多肽紅外光譜測定

參照熊喆等[13]方法進行測定。

1.3.5抗氧化活性測定

多肽清除ABTS+自由基能力，參照KUT等[14]的方法；清除DPPH自由基能力，結合文獻[15]的方法；清除超氧陰離子自由基能力測定參照程超等[16]進行測定；清除羥自由基率能力結合文獻[17]進行測定。

1.3.6大蒜根尖細胞凋亡程度測定

取根系生長較良好的大蒜，分為對照組（水培養6 h）、空白組（過氧化氫處理4 h、水培養2 h）、實驗組（過氧化氫處理4 h、1 mg/mL多肽處理2 h）和損傷組（過氧化氫處理6 h），然后在室溫下浸泡在0.25%的伊文思藍水溶液中15 min。將根尖浸入5 mL N，N-二甲基甲酰胺中1 h后，收集浸出液，檢測600 nm下吸光度，以測定細胞凋亡程度。

1.4數據處理

所有試驗均進行了3次。采用IBM SPSS 19、Origin 2021等軟件分析及繪圖處理。

2結果與分析

2.1不同蛋白酶對多肽得率的影響

采用不同蛋白酶處理SPI后測定其多肽得率見圖1。由圖1可知，不同蛋白酶處理，其多肽得率由高到低為堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶。堿性蛋白酶處理后多肽得率最高，67.78%；菠蘿蛋白酶酶解條件下多肽得率最低，5.71%；不同蛋白酶酶解條件測定的多肽產率均有顯著性差異。不同的酶具有不同的酶切位點，試驗所選6種酶均屬于內切酶。內切酶主要在蛋白分子的肽鍵位置起作用，導致蛋白分子分解為多肽片段，內部疏水基團被暴露出來[12]。菠蘿蛋白酶酶解后多肽產率較低，可能是由于其作用酶切位點較多，水解程度更徹底，將大豆多肽水解成氨基酸[18]；經過堿性蛋白酶的處理多肽得率較高，可能是由于其自身的特性，能夠將SPI水解后得到更多分子量較小的多肽[18]。

2.2不同蛋白酶制備的多肽結構特性

2.2.1多肽紫外掃描光譜分析

蛋白質存在的不飽和結構肽鍵、羧基等都會對紫外光區有吸收[19-20]。不同樣品的紫外波長掃描見圖2。不同蛋白酶解多肽最大吸收峰出現在210～230 nm，符合大豆多肽的特征吸收峰；在260～280 nm波長處也有一定的吸收，但吸收峰較小，說明多肽中含有一定量的芳香族氨基酸；經堿性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶處理，其多肽峰值比其他3種更低。可能原因是這3種蛋白酶酶解后，得到的大豆多肽具有更小的分子量；且在260～280 nm處吸收峰，后者紫外光譜吸收帶的最大吸收峰波長向長波方向移動。這種現象的主要原因是，肽鍵中的羰基π電子與相鄰氨基的孤對電子發生了p-π共軛作用。由于共軛效應，使得電子在π-π*躍遷過程中產生的吸收峰發生了紅移[20]。

2.2.2多肽紅外光譜分析

多肽分子能夠選擇性吸收某些紅外波長，從而導致分子中振動能級和轉動能級的躍遷。因此，可分析紅外光譜來探究多肽結構[10]。由圖3可知，6種樣品有相似的紅外光譜特征吸收峰，其中，酰胺A帶均在3 293.51 cm-1附近，其原因與形成氫鍵，導致N—H鍵的伸縮振動相關[10]；酰胺B帶在2 933.77 cm-1附近，其中，中性蛋白酶解多肽峰值表現較弱；酰胺Ⅰ帶出現1 644.34～1 661.70 cm-1附近，是CO基團的特征譜帶；酰胺Ⅲ帶出現在1 238～1 249 cm-1附近，其原因來自C—N鍵的伸縮振動、N—H鍵的彎曲振動，以及氨基酸上—CH2基團的搖擺振動；酰胺Ⅱ帶（1 500～1 600 cm-1）有明顯的吸收峰，但也存在一定差異。圖3中6種多肽在1 000～1 500 cm-1區域有很明顯的吸收峰吸收差異，可能由于不同蛋白酶酶解后多肽側鏈基團的分子構成存在顯著差異，最終引起多肽之間抗氧化活性的差異[21]。

2.3不同蛋白酶制備多肽的抗氧化活性

2.3.1多肽清除ABTS+自由基的能力

ABTS+法在抗氧化試驗中使用較廣泛，對極性和非極性物質都可以檢測[14]。由圖4可知，樣品對ABTS+自由基均具有清除效果，且清除能力隨著樣品質量濃度增加而逐漸增強。從總體的清除能力來看，堿性蛋白酶處理獲得的多肽，其ABTS+自由基清除能力高于其他蛋白酶的。因此，SPI經堿性蛋白酶解后，具有更強的ABTS+自由基清除能力。

IC50可以反映清除能力，其數值越小，說明清除能力越強[22]。從表2可知，6種蛋白酶解液的IC50值之間存在顯著性差異（P＜0.05）。從6種蛋白酶的IC50來看，堿性蛋白酶的IC50最小，（0.568 9±0.009 8）mg/mL，菠蘿蛋白酶的IC50最大，（0.598 7±0.006 1）mg/mL，說明堿性蛋白酶處理的多肽的ABTS+自由基清除能力更強，具有更強的抗氧化能力。

2.3.2多肽清除DPPH自由基的能力

不同樣品清除DPPH自由基的能力見圖5。由圖5可知，樣品對DPPH自由基均具有清除效果，隨著樣品質量濃度增加，其清除能力增強。堿性蛋白酶得到的多肽，其DPPH自由基清除能力優于其他蛋白酶；而對于菠蘿蛋白酶酶解得到的多肽，它的自由基清除效果最差。可能原因是堿性蛋白酶酶解所得多肽，其N-端多為疏水性氨基酸，因而其具有較高的抗氧化活性[23]。

從表3可知，不同樣品的IC50之間存在顯著性差異（P＜0.05），從6種蛋白酶的IC50來看，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解多肽的IC50之間無顯著性差異；堿性蛋白酶的IC50最小；說明經堿性蛋白酶處理獲得的多肽，有更強的DPPH自由基清除能力，具有更強的抗氧化能力。

2.3.3多肽清除超氧陰離子自由基清的能力

超氧陰離子自由基是活性氧之一，具有強烈的氧化能力[16]。由圖6可知，樣品對超氧陰離子自由基清除能力均隨著樣品質量濃度增加而逐漸增強。從總體的清除能力來看，經堿性蛋白酶與中性蛋白酶酶解的多肽，其超氧陰離子自由基清除能力優于其他蛋白酶酶解的多肽，說明堿性蛋白酶與中性蛋白酶水解產物對超氧陰離子有較好的清除作用。

從表4可知，不同樣品的IC50之間存在顯著性差異（P＜0.05），從6種多肽的IC50來看，堿性蛋白酶處理后樣品的IC50最小，（1.640 8±0.067 5）mg/mL，其清除能力最強。不同酶水解后的多肽抗氧化能力都不同，可能原因是水解后肽段的長度及本身的性質不同[17]。

2.3.4多肽清除羥自由基的能力

羥自由基是脂質氧化反應的常見中間產物，易與生物大分子發生反應[17]。如圖7所示，6種蛋白酶解多肽對羥自由基的清除效果隨質量濃度增加而增加。由表5可知，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解多肽的IC50二者之間無顯著性差異。但與其他蛋白酶酶解產物的IC50值存在顯著性差異，說明相同質量濃度下二者的抗氧化能力無顯著性差異，且其對羥自由基清除能力優于其他蛋白酶。研究顯示，經酶解處理的SPI，使得樣品中的活性基團或位點更加暴露，可作為氫供體還原自由基，從而終止自由基連鎖反應，以此實現其抗氧化能力[24]。

2.4大豆多肽對過氧化氫誘導大蒜根尖氧化應激細胞凋亡的影響

以吸收伊文思藍程度表示細胞凋亡程度[25]。由圖8可知，不同處理組之間存在顯著性差異（P＜0.05）。與對照組相比，空白組、實驗組和損傷組的伊文思藍吸光度分別提高了44.91%、9.58%和59.89%；經大豆多肽處理后，吸光度降低45.90%，與對照組相近。結果表明，大豆抗氧化肽可有效降低過氧化氫誘導的細胞凋亡，原因可能是大豆抗氧化肽作為生物活性物質，可以被機體吸收后，參與機體內有關抗細胞凋亡代謝途徑，有效抑制過氧化氫脅迫導致的氧化應激[25]。

3結論

1）6種蛋白酶酶解后多肽得率由高到低為堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶，其中堿性蛋白酶酶解SPI的多肽得率最高為67.78%；菠蘿蛋白酶酶解條件下多肽得率最低為5.71%。

2）多肽在200～230 nm處有最大吸收峰；6種多肽在酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶均有吸收峰，在1 000～1 500 cm-1區域有很明顯的吸收峰吸收差異。

3）6種蛋白酶酶解產物的自由基清除能力，均隨濃度增加而增加。從總體自由基清除率上看，堿性蛋白酶解產物對ABTS+、DPPH、超氧陰離子以及羥自由基4種自由基的清除效果均優于其他蛋白酶，其IC50值分別為0.568 9、1.010 4、1.640 8和3.936 5 mg/mL。

4）經堿性蛋白酶酶解制備的大豆抗氧化肽處理后，與對照相比，空白組、實驗組和損傷組的伊文思藍吸光度顯著提高了44.91%、9.58%和59.89%；經大豆多肽處理后大蒜根尖細胞凋亡程度下降45.90%。

因此，經堿性蛋白酶酶解得到的多肽，具有更強的抗氧化活性。研究能為SPI酶解制備抗氧化肽提供一定的理論依據。

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