2型糖尿病患者血清γ-谷氨酰轉移酶與頸動脈粥樣硬化的關聯性*

李茂婷,何佩真,李 睿,周廣舉△

川北醫學院附屬醫院:1.內分泌科;2.影像醫學科,四川南充 637000

近年來,2型糖尿病(T2DM)的患病率持續升高,其相關的心腦血管并發癥一直是人們關注的焦點。T2DM相關的并發癥中,動脈粥樣硬化(AS)及其相關的心腦血管并發癥,如心肌梗死、腦卒中是其主要的死亡原因[1]。頸動脈粥樣硬化(CAS)是全身動脈硬化的一種表現,也是DM患者大血管病變的早期主要征兆之一,由于頸動脈位置淺而相對固定,彩色多普勒可用于檢查頸動脈內中膜厚度,進而預測全身AS[2]。AS是一種與年齡相關的心血管疾病,其發生的始動因素為血管內皮細胞損傷,此外還與炎癥細胞浸潤、脂質代謝異常、氧化應激等密切相關,其中氧化應激貫穿于AS的形成、發展和斑塊破潰的整個過程[3-5]。因此,及早發現氧化應激的相關因素并進行干預,有助于延緩AS的發生和發展,對于預防缺血性腦卒中、心肌梗死、下肢缺血性壞疽等AS相關血管事件的發生至關重要,同時可減輕全球疾病負擔。血清γ-谷氨酰轉移酶(GGT)是一種糖基化的線粒體酶,主要存在于細胞膜表面[6],它的主要功能是分解細胞外谷胱甘肽(GSH),因而被認為是氧化應激的生物標志物。許多觀察性研究表明,血清GGT可能與AS、腦卒中、冠心病等心腦血管疾病的發生風險相關[7-12],但也有研究表明血清GGT與頸動脈內膜厚度及CAS之間缺乏關聯[13-14]。因此,目前血清GGT與CAS之間的因果關系尚不明確。上述截然不同的研究結果可能是因為觀察性研究常受混雜因素、反向因果關系的影響,導致其驗證因果關系的能力有限。孟德爾隨機化(MR)是流行病學研究中一個強有力的工具,該方法的核心思想是利用遺傳變異來評估危險因素與特定疾病之間的因果關系[15]。本研究將通過觀察性研究探討血清GGT水平與CAS之間的關聯性,同時將基于全基因組關聯研究(GWAS)的匯總數據選取與血清GGT水平存在顯著關聯的單核苷酸多態性(SNP)位點作為工具變量(IV)來進一步探討血清GGT水平與CAS之間的因果關聯。本項MR分析選擇的IV需同時滿足以下3個條件[15]:(1)關聯性假設,所選擇的IV與GGT強相關。(2)獨立性假設,IV不能與血脂、血壓等混雜因素相關。(3)排他性假設,IV僅通過影響GGT從而導致AS發生。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2023年6月本院內分泌科收治的符合診斷標準的354例T2DM患者作為研究對象,男217例,女137例;年齡42～80歲。將其中247例CAS患者作為CAS組,107例無CAS患者作為無CAS組。一般資料包括一般信息、一般體格檢查及詳細檢查結果。所有研究對象均進行頸動脈超聲檢查。納入標準:(1)年齡≥40歲;(2)T2DM患者。排除標準[16-17]:(1)急慢性肝病,如脂肪肝、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、肝硬化、肝功能不全等;(2)膽道疾病,如膽囊炎、膽石癥、膽囊息肉、膽道腫瘤等;(3)大量飲酒者,乙醇攝入量男性每周>280 g,女性每周>140 g;(4)近6個月服用過他汀類調脂藥物及肝功能保護藥物。診斷標準:(1)高血壓參照2018版《中國高血壓防治指南》的診斷標準或既往已診斷為高血壓且目前正在服用降壓藥物;(2)T2DM參照2020版《中國2型糖尿病防治指南》T2DM診斷標準或既往已明確診斷的T2DM患者;(3)CAS參照2015版《中國腦卒中血管超聲檢查指導規范》的診斷標準。所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。本研究已獲得本院醫學倫理委員會審核批準(2023ER302-1)。

1.2方法

1.2.1研究設計與數據來源 本研究選用已經公布的GWAS的匯總數據,選取來自IEU數據庫的血清GGT水平作為暴露表型,選取來自GWAS catalog數據庫的頸動脈內膜厚度及來自FinnGen數據庫(R9版本)的AS(不包括腦動脈粥樣硬化、冠狀動脈粥樣硬化及外周動脈疾病)作為結局表型,采用MR分析評估其因果關聯,同時采用敏感性分析來驗證因果關聯的可靠性。具體特征見表1。

表1 兩樣本MR分析中GWAS數據信息匯總

1.2.2IV的選擇 選取IEU數據庫的血清GGT水平作為暴露表型,選擇與其明顯相關的SNP位點作為IV(P<5E-10);設置參數r2=0.001且kb=10 000的標準排除連鎖不平衡的干擾;計算F值,排除F<10的弱IV;剔除與結局直接相關的IV(P<5E-8)。在進行MR分析前,先進行MR-PRESSO分析(NbDistribution=10 000),以排除任何具有潛在多效性的異常值,以確保MR估計的可靠性。

1.2.3MR分析 MR分析基于R語言統計軟件,采用TwoSampleMR包進行MR分析,采用逆方差加權法(IVW)作為主要分析方法,采用MR-Egger回歸法和加權中位數法(WM)進一步驗證MR結果。其中IVM是對所有SNP位點的效應值進行匯總。MR-Egger回歸法考慮了不同IV之間可能存在的異質性,同時校正由IV多效性所產生的偏倚。而WM是將SNP位點的效應值按照權重排序后獲得的分布函數的中位數,WM對于有明顯離群SNP位點的因果推斷更為穩健。

1.2.4敏感性分析 采用異質性檢驗、多效性檢驗和逐個剔除檢驗進一步進行敏感性分析。采用Cochran′sQ檢驗對不同IV之間的異質性進行檢驗,當P<0.05時,表明不同IV之間存在異質性,且P值越小,不同IV之間的異質性越大。采用MR-Egger回歸法的截距項進行多效性分析,以評估檢驗各個IV是否存在水平多效性。如果IV不存在水平多效性,模型截距應為0,回歸截距的P>0.05。當研究結果存在水平多效性時,表明IV可以通過除暴露結局以外的其他途徑導致結局發生,最終可能導致獨立性假設及排他性假設不成立。當研究結果存在水平多效性時應當對結果進行謹慎解釋。逐個剔除檢驗主要是逐個剔除IV后計算剩下IV的MR結果,如果剔除某個IV后其他IV的MR結果和總結果差異很大,則說明MR結果對該IV是敏感的。

2 結 果

2.1CAS組和無CAS組基線特征比較 CAS組體質量指數、年齡均大于無CAS組,吸煙患者比例、糖化血紅蛋白水平、血尿酸水平均高于無CAS組,高密度脂蛋白膽固醇水平低于無CAS組,差異均有統計學意義(P<0.05);而CAS組與無CAS組性別比例、高血壓比例、T2DM病程、低密度脂蛋白膽固醇水平及GGT水平比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 CAS組和無CAS組基線特征比較[n(%)或M(P25,P75)或

2.2血清GGT水平與CAS的關聯性

2.2.1兩樣本MR分析結果 采用IVW作為評估血清GGT水平與CAS間因果效應的主要方法,IVW結果不支持血清GGT水平與CAS之間存在因果效應(GGT→頸動脈內膜厚度:P=0.423;GGT→AS:P=0.345)。

2.2.2敏感性分析及可視化結果 盡管不同IV之間異質性較大(P<0.001),但MR-Egger回歸法及WM的結果與IVW一致,也不支持血清GGT水平與CAS之間存在因果效應。此外,多效性檢驗結果顯示,此研究不存在水平多效性(GGT→頸動脈內膜厚度:MR-Egger回歸截距=0.00,P=0.262;GGT→AS:MR-Egger回歸截距=0.00,P=0.059),見表3。MR分析結果散點圖見圖1。漏斗圖顯示兩側的SNP位點基本對稱分布,未見明顯異常的離群值,提示上述因果關聯受到潛在偏倚影響的可能性較小,見圖2。

圖1 血清GGT水平對頸動脈內膜厚度(左)和AS(右)因果效應的散點圖

圖2 血清GGT水平對頸動脈內膜厚度(左)和AS(右)因果效應的漏斗圖

表3 不同MR分析方法評估血清GGT水平對頸動脈內膜厚度或AS的因果效應

3 討 論

DM是一種以胰島素缺乏或胰島素抵抗為核心的由遺傳、環境等多種因素共同決定的慢性代謝性疾病,其在全球范圍內呈高患病率,與人們久坐不動、飲食結構由素食向肉食轉變、快餐化等生活方式的改變密切相關,此外,還與人口老齡化也有一定關系。依據2021年全球DM地圖第10版數據,2021年大約有5.37億20～79歲的成年人患DM,預測至2030年將增至6.43億,其中T2DM是DM的主要類型。DM可能導致大血管和微血管損傷,甚至引發自主神經病變,導致大小便失禁等。T2DM相關的并發癥中,AS及其相關的心腦血管并發癥,如心肌梗死、腦卒中是其主要的死亡原因[1]。有研究發現,血清GGT與氧化應激密切相關[7],而氧化應激貫穿于AS形成的整個過程。GGT是一種糖基化的線粒體酶,為二聚體糖蛋白,其相對分子質量為68×103,包含相對分子質量為46×103的重鏈和相對分子質量為22×103的輕鏈,輕鏈含有GGT活性,而重鏈則將蛋白質錨定在細胞膜上[8,9,18]。GGT廣泛存在于各個器官及組織中,包括肝臟、腎臟、肺、胰腺和血管內皮等[8]。有研究表明,GGT至少以4種不同的分子形式存在于血液循環中,包括大GGT、中GGT、小GGT和游離GGT,每種不同分子形式的GGT均有自己的相對分子質量和獨特的理化性質[9,19]。一直以來,關于GGT與CAS之間的因果關聯存在爭議[13-14,20-21],可能有以下原因:首先,血清GGT參與GSH的降解,而GSH是體內重要的硫醇類抗氧化劑。其次,GGT在分解GSH的過程中產生半胱氨酸-甘氨酸,半胱氨酸-甘氨酸作為強還原劑,使Fe3+轉變為Fe2+,參與了包括超氧化物及過氧化氫在內的活性氧產生[22],而這些活性氧可誘導低密度脂蛋白膽固醇氧化,從而參與AS。此外,血清GGT還介導了炎癥介質白三烯C4向白三烯D4轉換。最后,在CAS斑塊中還發現了活性GGT,其與泡沫細胞共定位[7,10]。

本研究通過比較T2DM患者中有CAS患者與無CAS患者的血清GGT水平,發現二者之間差異無統計學意義(P>0.05)。同時進一步進行兩樣本MR分析,結果不支持血清GGT水平與CAS之間存在因果關聯,這與既往大部分流行病學研究結果不一致,可能有以下原因:(1)流行病學研究表明,GGT與AS的危險因素,如胰島素抵抗、高血壓、高血脂等代謝異常密切相關[23-24],這些代謝異常性疾病可能介導了GGT與CAS的關聯,而MR分析中與致病危險因素相關的遺傳變異在遺傳過程中隨機分配,自出生時已確定,避免了上述因素的影響。(2)觀察性研究中,暴露與結局常常同時確定,究竟是高水平血清GGT導致了CAS的發生和發展還是CAS的發生和發展導致了血清GGT水平升高,目前尚無法確定,且本項MR分析只研究了GGT對CAS的影響,可進一步進行反向MR分析確定CAS的發生是否導致GGT水平升高。(3)MR分析的基礎是假設GGT水平與CAS的發生存在線性因果關聯,陰性結果表明GGT水平與CAS的發生之間不存在線性因果關聯,但可能存在其他形式的關聯。(4)有研究發現,在4種不同分子形式的GGT中,實際與CAS相關的是大GGT,其不僅存在于CAS的斑塊中,而且與心血管結局相關[19],但目前尚無與大GGT相關的GWAS匯總數據,未來可進一步開展不同分子形式的血清GGT與CAS的關聯性研究。(5)有研究表明,GSH在細胞外被GGT分解后產生的前體氨基酸重新用于細胞內GSH的合成,此過程稱為γ-谷氨酰循環,γ-谷氨酰循環與GSH的合成和再循環密切相關[18]。因此,GGT在生理狀況下可能具有保護組織細胞免受氧化應激損害的作用,但流行病學研究表明其為氧化應激的血清學標志物[7],因此可提出以下假設:在受到氧化應激損傷時,血清GGT水平升高以抵御氧化應激,然而當GGT升高到一定水平時,反而成為導致氧化應激加重的危險因素,但仍需進一步研究去檢驗假設。(6)MR分析中所選擇的IV只解釋了暴露因素的一部分,且MR分析得出的結論是理論上的,不能代替臨床上實際的干預效果,仍需隨機對照試驗進一步證實。(7)MR分析未考慮生物體在發育過程中存在渠道化的特性,也就是個體在發育過程中,可能會通過自身調節的方式對抗由于環境變化導致的遺傳變異所決定的表型改變,努力維持自身的穩態,生物體渠道化的特性可能會使因果關聯的估計出現偏差。實際上,MR分析除了3個主要條件外,還有其他的次要附加假設,在實行MR分析過程中,不可能滿足所有的附加假設,盡管如此,但只要滿足MR分析的3個主要條件,所得出的結論仍然是有效的,可以為探究因果關系、選擇干預靶點等提供一定的臨床價值。未來可使用不同的MR分析方法進一步探討GGT與CAS的因果關聯,以盡可能減少誤差,并且提高結果的可信度。

本研究存在以下局限性:(1)有研究表明,血清GGT水平可能與年齡、種族、吸煙等因素相關[25-26],但本研究未進行進一步分層分析;(2)兩樣本的MR分析中未找到CAS的GWAS匯總數據,只使用了頸動脈內膜厚度與AS(排除腦動脈粥樣硬化、冠狀動脈粥樣硬化與外周動脈疾病)的GWAS匯總數據代替;(3)MR研究中的參與者主要為歐洲白種人,在歐洲白種人中發現的遺傳變異不一定與其他地區及人種的人群相同,未來需要對其他地區及人種的人群采用兩樣本MR分析進一步論證因果關聯;(4)MR分析是假設因果關聯發生在同一個方向上,由于生物系統的復雜多樣性,暴露和結局之間可能存在反饋通路,會使結果變得不準確。

盡管本研究有諸多局限,但也有以下優點:(1)本研究與既往的流行病學研究比較,巧妙結合了MR分析探討血清GGT水平與CAS的因果關聯[20];(2)本研究MR分析克服了傳統流行病學研究易受混雜因素及反向因果關系的影響,且數據容易從公開的遺傳數據庫中獲得。

綜上所述,本次觀察性研究及MR分析結果均不支持血清GGT水平與CAS之間存在因果關聯,未來可進一步開展更大樣本,以及不同地區及人種人群的MR分析,以論證二者之間的因果關聯。