人體二十二碳六烯酸檢測方法的研究進展*

陸佳露,周春艷 綜述,余曉丹△ 審校

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心:1.發(fā)育行為兒科;2.轉(zhuǎn)化所,上海 200127

二十二碳六烯酸即DHA(C22:6n-3),是一種n-3多不飽和脂肪酸(PUFAs)。n-3 PUFAs為一種碳原子數(shù)為18～22個并含有2個及以上雙鍵的PUFAs,因第1個雙鍵出現(xiàn)在碳鏈甲基端的第3位,所以稱為n-3 PUFAs,也叫ω-3 PUFAs。DHA為人體內(nèi)占比最高的n-3 PUFAs,不僅與嬰兒大腦生長和功能發(fā)育相關(guān),在維持成人腦功能方面也有重要作用。因此,DHA素有“腦黃金”之稱。目前已報道與DHA缺乏相關(guān)的疾病包括兒童注意缺陷多動障礙、抑郁癥、精神分裂癥、孤獨癥等[1-2]。此外,DHA還具有預(yù)防心血管疾病、抗炎、抗癌及免疫調(diào)節(jié)等功能[3-4]。由此可見,保證人體充足的DHA對于維持其健康至關(guān)重要,尤其是在生命的早期階段。人體DHA主要來源于膳食,如攝入的魚油、海藻等[5]。另外,人體也可以通過α-亞麻酸(ALA,C18:3n-3)合成DHA。ALA也屬于n-3 PUFAs,其作為人體必需的脂肪酸之一同樣僅能從食物中獲得,但其大部分被氧化用以提供能量,僅有極少部分轉(zhuǎn)化成DHA,可見人體內(nèi)合成的DHA并不能滿足日常生長、發(fā)育所需。因此,保證膳食中充分的DHA攝入是預(yù)防或改善因DHA不足或缺乏導(dǎo)致相關(guān)疾病的最有效方法。事實上,人體不同部位DHA水平不同,用于人體DHA水平檢測的方法也多種多樣。如何選取最佳的生物標(biāo)本及合適的檢測方法對監(jiān)測人體DHA水平至關(guān)重要。本文對近幾年發(fā)表的人體內(nèi)DHA檢測方法的文章進行綜述,為準(zhǔn)確評估人體DHA水平提供依據(jù)。

1 人體DHA分布

DHA廣泛分布于人體所有器官,其中神經(jīng)組織大腦和視網(wǎng)膜部位的DHA水平最高[6]。有研究表明,DHA在大腦脂肪酸中的水平為12%～15%[7]。DHA還可酯化成甘油三酯儲藏在脂肪組織中,但水平極低。相對于神經(jīng)組織,DHA在血液中的水平同樣較低。血液中的DHA主要分布在血漿中,以及單核細胞、紅細胞和血小板等細胞上,其中血漿中的DHA主要酯化成磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、膽固醇和甘油三酯等,并且與蛋白結(jié)合形成脂蛋白。紅細胞主要為磷脂形式的DHA。除神經(jīng)組織、血液和脂肪組織外,DHA還廣泛分布在精子、肝臟、脾臟和心臟等部位,因取樣困難,一般不作為常規(guī)生物標(biāo)本用于人體DHA水平檢測。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)部位的DHA水平最受關(guān)注,但因取樣困難,極少檢測該部位的DHA水平。脂肪組織中DHA周轉(zhuǎn)率較低且不受急性疾病的影響,被視為研究DHA攝入與人體DHA水平變化的最佳選擇。相對于脂肪組織,DHA在血漿或紅細胞膜中的周轉(zhuǎn)率較快,血漿中為幾天或幾十天,紅細胞膜中為幾個月[5]。因此,對短期DHA攝入后人體DHA水平變化的研究,血液標(biāo)本則應(yīng)用更廣。同時,血液標(biāo)本還具有取樣容易,標(biāo)本預(yù)處理簡單等優(yōu)勢。另外,血漿和紅細胞中的DHA還是大腦、視網(wǎng)膜、肝臟和其他器官DHA的主要來源。因此,血漿和紅細胞磷脂DHA成為研究和分析人體DHA水平的常規(guī)生物材料[8]。

2 DHA檢測方法

最初,研究者們采用膳食調(diào)查法,如食物頻率問卷法(FFQ)、24 h膳食回顧法(24HRs)等對個體膳食中攝入的脂肪酸水平進行分析以了解人體血液DHA水平,但該方法存在回憶偏倚等不足,且無法準(zhǔn)確反映人體DHA水平。目前主要采用色譜法,如薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、液相色譜法(LC)等對取自人體的生物材料進行脂肪酸水平檢測。色譜法涉及固定相和流動相,當(dāng)流動相流過加有標(biāo)本的固定相時,基于待分析物在2個相之間的水平比例不同最終以不同速度移動而互相分離開來。此外,核磁共振技術(shù)(NMR)、近紅外光譜技術(shù)(NIR)等也被用于脂肪酸的檢測中。本研究對以上幾種方法的原理、優(yōu)勢和局限性進行匯總,見表1。

表1 4種DHA檢測方法的原理、優(yōu)勢和局限性

2.1膳食調(diào)查法 膳食調(diào)查法是調(diào)查人群在一定時間內(nèi)所攝入的能量和各種營養(yǎng)素的數(shù)量和質(zhì)量,以判斷個體正常營養(yǎng)需要是否得到滿足的方法。目前應(yīng)用于脂肪酸攝入量評價的有FFQ、24HRs等[9]。

2.1.1FFQ FFQ是通過問卷調(diào)查人群在過去限定的某段時間內(nèi)某些食物的攝入頻率或食用量實現(xiàn)對能量或各種營養(yǎng)素攝入量進行計算,分為定性和定量兩類。定性FFQ是指某種食物特定時期內(nèi)所食用的次數(shù),不包括食物量和份額大小;定量FFQ是指某種食物在特定的時期內(nèi)食用的平均估量,包括食物名稱、攝入頻率和攝入量信息。FFQ已廣泛用于調(diào)查飲食和疾病之間聯(lián)系的流行病學(xué)研究中。趙芮等[10]利用FFQ分析了上海市居民 n-3 PUFAs膳食攝入情況,提出上海市18歲以下、18～25歲、>25～60歲、>60歲4個年齡段人群預(yù)防心血管疾病的n-3 PUFAs推薦攝入量分別為1 032～2 569、759～3 170、419～3 569、209～3 729 mg/d。SALA-VILA等[11]通過FFQ對DHA攝入水平與攜帶阿爾茲海默病易感基因的中年人發(fā)生阿爾茲海默病的比率進行分析發(fā)現(xiàn),在認知功能未受損的載脂蛋白E-ε4純合子中,較高的DHA攝入量與較輕的阿爾茲海默癥相關(guān)的病理改變相關(guān)。FFQ雖存在回憶偏倚,但其簡單易行、可操作性強且費用較低,適用于評估人群中期或長期膳食攝入情況。

2.1.224HRs 24HRs通過詢問調(diào)查對象過去24 h實際的膳食攝入情況,對其食物和營養(yǎng)素攝入量進行計算和評價。24HRs成熟、目的明確、易于實施、適用范圍廣,是目前人群營養(yǎng)調(diào)查使用最普遍的膳食調(diào)查方法[12]。ZHANG等[13]調(diào)取中國健康與營養(yǎng)調(diào)查報告中的中國9個省份的15 100名成年人(≥20歲)3 d 24 h膳食報告數(shù)據(jù)中魚類或海洋類食物中n-3 PUFAs攝入量,分析與2型糖尿病(T2DM)發(fā)生風(fēng)險的關(guān)系,結(jié)果顯示,當(dāng)前膳食海洋類來源的n-3 PUFAs攝入量太低(250 mg/d),95%的受試者并不能降低發(fā)生T2DM的風(fēng)險。ZHANG等[13]利用同一批數(shù)據(jù),分析n-6/n-3 PUFAs攝入比例與病死率的關(guān)系,結(jié)果顯示,n-6/n-3 PUFAs攝入比例在6～10時可降低病死率[14]。24HRs優(yōu)點是調(diào)查對象負擔(dān)較小、配合度較高,但同時也存在相應(yīng)要求,如需要對調(diào)查人員進行培訓(xùn),營養(yǎng)素需要精細計算等。24HRs局限性同樣為存在回憶偏倚、不適合記憶不清的老人或兒童、食物份額的重量很難被準(zhǔn)確評估,比較適合用于家庭中個體食物消耗狀況的調(diào)查。在實際運用中,24HRs常與稱重法、FFQ等方法相結(jié)合以獲取更全面的信息。

2.2色譜法 色譜法檢測主要分為3個基本步驟:(1)提取標(biāo)本中的脂肪酸;(2)待分析物的分離并將目標(biāo)脂肪酸進行硅烷衍生化或甲酯化;(3)待分析物的鑒定和量化。其中步驟(1)為關(guān)鍵步驟,因生物組織中的脂質(zhì)通常與蛋白質(zhì)相互作用形成脂蛋白,脂質(zhì)提取的成功往往決定了后續(xù)分析、鑒定和定量的準(zhǔn)確程度。

2.2.1TLC TLC是基于待分析物在流動相和固定相(常為硅膠)中存在極性差異,實現(xiàn)對待檢測標(biāo)本分離、鑒定和定量的一種層析分離技術(shù),是最早用于脂質(zhì)分析的色譜方法。方景泉等[15]采用高效TLC-GC-四極桿質(zhì)譜聯(lián)合應(yīng)用的方法對母乳中的各類脂肪酸水平進行檢測,其中DHA水平檢出限為2.3 mg/L。GUO等[16]采用TLC-GC研究攝入相應(yīng)n-3 PUFAs制劑后人體血液(紅細胞和血漿)中的二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和DHA的代謝差異。有研究采用TLC-GC研究男性弱精子和正常精子中的PUFAs水平,結(jié)果顯示弱精子DHA水平明顯下降[17]。TLC操作簡便、快速、價格便宜、通量高、標(biāo)本前處理簡單,而流動相的多樣性可使復(fù)雜混合物得到有效分離。但薄層色譜板表面暴露于環(huán)境中在短時間內(nèi)易被氧化而影響使用,精密度和重現(xiàn)性差,分離性能有限。目前TLC主要用于脂質(zhì)分析前的標(biāo)本制備并結(jié)合LC、GC或質(zhì)譜技術(shù)(MS)等進行標(biāo)本分析。

2.2.2GC GC的流動相為氣體,其原理同樣是利用物質(zhì)在相對運動的2個相中具有不同的分配系數(shù)實現(xiàn)對物質(zhì)的分離和檢測。目前用于生物標(biāo)本中各類脂肪酸檢測方法主要包括與MS聯(lián)合GC(GC-MS)和GC-以火焰離子化檢測器(GC-FID)[18]。BROS-KONOPIELKO等[19]采用GC-FID檢測孕婦及其孩子血清標(biāo)本中的n-3 PUFAs和n-6 PUFAs水平,比較了不同膳食補充劑的有效性。血漿中各類脂肪酸水平可用于監(jiān)測糖尿病和糖尿病腎病患者疾病的發(fā)展進程,也可用于各種風(fēng)險評估,如ZHANG等[20]研究妊娠期孕婦脂肪酸水平與妊娠期糖尿病亞型的關(guān)系時,采用GC定量分析血清脂肪酸發(fā)現(xiàn),妊娠早期ALA和DHA水平升高明顯增加妊娠期空腹血糖升高女性發(fā)生妊娠期糖尿病的風(fēng)險;汪潔云等[21]使用GC檢測肥胖兒童與健康兒童多不飽和脂肪酸水平時發(fā)現(xiàn),肥胖兒童血清ω-3 PUFAs水平為(6.75±2.27)%,健康兒童為(10.35±3.30)%。GC有效率高、選擇性強、分析過程耗時短和標(biāo)本量需求少等優(yōu)點,目前為生物標(biāo)本中各類脂肪酸檢測和定量的首選方法。GC-MS不僅可以提供更多的結(jié)構(gòu)信息,同時因為MS完善的脂肪酸數(shù)據(jù)庫,該方法的有效性和選擇性也更高[18]。

2.2.3LC 目前普遍采用的是高效LC(HPLC),該方法基于待分析物在高壓下被固定相分離,隨后被相應(yīng)的溶劑洗脫后實現(xiàn)對物質(zhì)的檢測。檢測器主要包括紫外/可見光檢測器、熒光檢測器、電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等。SUN等[22]采用LC-MS/MS對精神分裂癥患者血漿中未酯化的DHA進行檢測,利培酮單藥治療患者血漿DHA水平為(6.40±2.74)μg/mL,氯氮平單藥治療患者血漿DHA水平為(6.67±2.77)μg/mL,氯氮平和利培酮聯(lián)合治療患者血漿DHA水平為(5.93±2.75)μg/mL,對照健康人群血漿DHA水平為(12.31±4.89)μg/mL。目前,LC或HPLC檢測人體血液或組織中包括DHA在內(nèi)的多不飽和脂肪酸通常需要對標(biāo)本進行前處理,如甲基酯衍生化等,以提高檢測的靈敏度,因而會導(dǎo)致耗時較長。此外,相對于TLC,LC成本更高,與GC相比則存在溶劑消耗量較大和選擇性較低等缺點[18]。

2.3NMR NMR是一種用于結(jié)構(gòu)解析或物質(zhì)定量的分析技術(shù),其原理是利用原子核的磁矩,在恒定磁場和高頻電磁波共同作用下且滿足一定條件時,發(fā)生共振吸收某一定頻率的射頻輻射的物理過程。其中1H和31P由于高度靈敏是NMR光譜進行脂肪酸定量分析的主要自旋原子核[23],13C由于靈敏度較低,13C在NMR中的應(yīng)用相對較少。如THESING等[24]采用NMR對2 724例來自荷蘭抑郁和焦慮研究的受試者血漿DHA水平進行檢測,結(jié)果顯示,中位DHA水平為0.13 mmol/L。BARRILERO等[25]開發(fā)出一款針對1H NMR檢測人體血漿脂肪酸并進行定量的生物信息學(xué)工具(LipSpin),其定量的DHA結(jié)果與質(zhì)譜結(jié)果呈明顯正相關(guān)(r=0.96,P=4.9×10-26)。

目前,因NMR設(shè)備昂貴且結(jié)果需要專業(yè)人士解讀,采用該設(shè)備分析人體脂肪酸水平并不普遍。此外,與MS定量脂肪酸比較,NMR存在靈敏度低、信號重疊、信號分離能力差等問題,其中31P NMR只能用于含P的脂肪酸或DHA分析[23]。但NMR的優(yōu)勢在于重復(fù)性好、輕松辨別分子結(jié)構(gòu)、儀器穩(wěn)定性好、提供分子動力學(xué)信息和直接獲取定量數(shù)據(jù),同時進行分析時不會破壞標(biāo)本等。

2.4NIR NIR是一種利用近紅外譜區(qū)(650～1 100 nm)包含的光譜信息對有機物質(zhì)水平及結(jié)構(gòu)進行分析的技術(shù),信息源主要是物質(zhì)內(nèi)部原子間振動的倍頻與組合頻。由于NIR在采樣技術(shù)上獨有的快速、無損、高效、低成本、采樣重現(xiàn)性好、測量方便、操作性強等優(yōu)點,被廣泛用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域。

目前,NIR在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用主要集中在對大腦功能的分析[26]、血液中各成分,如血糖、總膽固醇、甘油三酯、轉(zhuǎn)移酶和尿酸等的檢測及體液中的一些蛋白檢測,對DHA水平分析的研究較少見。已報道的主要針對三文魚、豬、牛、羊等動物肉或魚油、藻油中DHA水平檢測[27-28]。目前,還沒有基于近紅外的人體血液DHA水平檢測的報道,僅有部分采用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)檢測人體口腔黏膜和人乳多不飽和脂肪酸水平的研究[29]。

目前,NIR檢測DHA技術(shù)有限,且因DHA水平較低,采用NIR檢測誤差通常相對于其他脂肪酸偏大。NIR也存在設(shè)備昂貴及結(jié)果解讀要求專業(yè)人士等不足。另外,NIR獲得的數(shù)據(jù)尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的分析方法及無法進行絕對定量。

3 小結(jié)與展望

DHA作為人類必需的長鏈多不飽和脂肪酸之一,在人體無法自主合成。因此,準(zhǔn)確檢測人體DHA水平成為預(yù)防因DHA不足或缺乏引起的疾病的關(guān)鍵。目前,DHA尚無標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法,而已有的檢測方法多種多樣,這導(dǎo)致人體DHA水平檢測結(jié)果參差不齊,無法對DHA水平與疾病狀態(tài)相關(guān)性進行有效評估,更無法提出一個合理的健康人群DHA水平參考區(qū)間。為此,本研究對當(dāng)前廣泛使用的人體DHA水平檢測方法進行綜述。

3.1優(yōu)化色譜技術(shù) 目前,廣泛用于人體DHA水平評估和檢測的方法包括膳食調(diào)查法、色譜法及近幾年逐漸開始使用的NMR和NIR。其中膳食調(diào)查法雖然能夠?qū)ι攀硵z入脂肪酸水平與疾病之間相關(guān)性進行評價,但膳食攝入量不能替代人體內(nèi)實際的脂肪酸或DHA水平。而NMR和NIR設(shè)備昂貴,無法普遍使用。因此,當(dāng)前最理想的可實現(xiàn)DHA水平標(biāo)準(zhǔn)化檢測的是色譜法,尤其是廣泛使用的GC。近年來,GC的檢測靈敏度、特異度或檢測下限因需要偶聯(lián)各種質(zhì)譜儀[23],如三重四極桿質(zhì)譜、時間飛行質(zhì)譜或離子阱質(zhì)譜等有了明顯改善。當(dāng)下,色譜技術(shù)仍存在標(biāo)本前處理時間久和脂肪酸內(nèi)標(biāo)缺乏導(dǎo)致脂肪酸定量不精準(zhǔn)等問題。因此,色譜法DHA檢測方法仍需繼續(xù)優(yōu)化以期更加簡潔、直接、精準(zhǔn)。

3.2完善標(biāo)本收取、保存和結(jié)果解讀的科學(xué)性 人體DHA水平的準(zhǔn)確測量還存在其他干擾因素,如生物標(biāo)本的保存方式。目前最常用于檢測DHA的生物標(biāo)本為血漿和紅細胞。將紅細胞凍存于-20 ℃條件下數(shù)日,DHA水平明顯下降;當(dāng)置于室溫或零度以上的冰箱,紅細胞中DHA水平則較為穩(wěn)定;將標(biāo)本凍存在-80 ℃條件下,紅細胞中的DHA水平可以穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)年[30]。此外,盡管血漿或紅細胞中的DHA水平被廣泛用于人體DHA水平評估,然而因人群年齡、疾病狀態(tài)等差異,通過膳食攝入的DHA或使用DHA制劑補充的DHA與人體DHA水平的變化并非始終有相關(guān)性[31]。因此,根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的生物標(biāo)本、注意標(biāo)本保存方式并基于人群特點對檢測結(jié)果進行科學(xué)評估和分析,對準(zhǔn)確獲取人體DHA水平并進行合理補充至關(guān)重要。

3.3提出健康人群DHA水平參考區(qū)間 目前國內(nèi)外均少見推薦人體DHA水平正常參考區(qū)間的報道。今后有望在比較現(xiàn)有檢測方法優(yōu)缺點的基礎(chǔ)上,國內(nèi)各大醫(yī)院檢驗科能共同制訂1項DHA檢測標(biāo)準(zhǔn)化指南,就檢測標(biāo)本類別、標(biāo)本檢測相關(guān)設(shè)備及檢測結(jié)果的科學(xué)解讀等達成共識,并將該指南廣泛推廣應(yīng)用,將為未來預(yù)防和治療DHA缺乏提供重要指導(dǎo)。