4種固定液對乳腺癌冰凍切片固定效果對比

黃斐一 福建省廈門市婦幼保健院病理科 361003

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,是女性癌癥死亡的主要原因。2020年全球最新癌癥負擔數據顯示,乳腺癌已成為全球發病率最高的癌癥[1]。乳腺癌的治療方式以手術切除為主,術中常常通過快速冰凍病理診斷來確定腫物的性質,決定手術方式和手術范圍。若患者前哨淋巴結轉移,還需進行淋巴結清掃術,故術中腫物和前哨淋巴結的冰凍病理診斷非常重要。由于組織的特異性和時間的限制,冰凍切片質量往往不如石蠟切片。冰凍切片的質量會影響診斷的速度和準確性,為了提高冰凍切片質量,筆者通過對比4種固定液及3個不同固定時間來找出適合乳腺癌手術的固定液及固定時間。

1 材料和方法

1.1 標本來源 收集本院病理科2023年3月新鮮乳腺癌腫物、前哨淋巴結標本各15例。

1.2 儀器及試劑 Thermo CryoStar NX50冰凍切片機,Gemini AS Heated全自動染色機,包埋劑OCT,Thermo MX35型一次性刀片;蘇木精染液、1%鹽酸乙醇分化液、0.5%氨水返藍液、1%醇溶性伊紅(購自中山市奧博生物科技有限公司),各濃度梯度乙醇,二甲苯,中性樹膠。固定液: 冷丙酮: 置于 4℃ 冰箱保存備用;95%乙醇;10%中性福爾馬林;AAF 液:95%乙醇 85mL、40%甲醛 10mL、冰醋酸5mL。

1.3 方法 將Thermo CryoStar NX50冰凍切片機設置為-10℃,腫物、前哨淋巴結置于OCT包埋劑包埋,速凍后腫物連續切片12張,每張4.5μm,淋巴結連續切片12張,每張3μm,腫物12張切片平均放入4種固定液,這樣每種固定液有3張切片,3張切片分別固定1min、4min、7min,淋巴結同上。固定后放入快速冰凍染色機,染色機設定為蘇木素染色3min,水洗10s,鹽酸乙醇分化5s,水洗10s,0.5%氨水返藍5s,水洗10s,醇溶性伊紅40s,95%乙醇10s,無水乙醇10s后取出,電風吹吹干,中性樹膠封片。

1.4 HE染色情況觀察 每張切片按照細胞形態(0～10分),細胞清晰度(0～10分),核質對比度(0～10分)打分,3個指標之和為該片分值,即滿分為30分。15例的平均值為該種固定液在該固定時間下的分值。

1.5 統計學方法 采用 SPSS22.0 進行統計學分析,組間和組內比較用方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫物在不同固定液和不同固定時間下HE染色情況 腫物在固定1min時,AAF固定液與95%乙醇固定效果無明顯差異(P=0.997>0.05),但明顯優于冷丙酮和10%中性甲醛(P<0.05)。固定4min和7min時,4組固定液均有顯著性差異(P<0.05),AAF固定液固定效果最佳,其次依次為95%乙醇、冷丙酮、10%中性甲醛。95%乙醇、10%中性甲醛隨時間延長,染色效果無明顯差異(P>0.05),而AAF液、冷丙酮固定4min與7min無明顯差異(P>0.05),但均比固定1min效果好,見表1。腫物切片在固定4min時,AAF液固定的切片細胞形態較正常,細胞清晰,核質對比良好(見圖1),95%酒精固定的細胞尚清晰,細胞收縮,核質對比度一般(見圖2),冷丙酮固定的切片細胞染色較差,細胞明顯收縮,核質對比度不良(見圖3),10%中性福爾馬林固定的細胞固縮,染色模糊,核質對比度差,無法診斷(見圖4)。

圖1 腫物在95%酒精固定4minHE染色

圖3 腫物在冷丙酮固定4min的HE染色

表1 腫物在不同固定液和不同固定時間下HE染色評分

2.2 淋巴結在不同固定液和不同固定時間下HE染色情況 淋巴結在固定1min和4min時,AAF固定液與95%乙醇固定效果無明顯差異(P>0.05),10%中性甲醛固定效果最差。固定7min時,4組固定液均有顯著差異(P<0.05),AAF液固定效果最好,其次依次為95%乙醇、冷丙酮、10%中性甲醛。AAF液固定1min、4min、7min均有顯著性差異(P<0.05),而其他固定液固定效果無顯著改變(P>0.05),見表2。淋巴結在AAF液與95%乙醇中固定4min(見圖5～6),細胞和組織結構尚清晰,無明顯差異,在冷丙酮10%中性甲醛中固定4min細胞結構不清,細胞收縮,染色不鮮艷,核質對比不清(見圖7),在10%中性甲醛中固定4min細胞結構模糊,核固縮,無法觀察(見圖8)。

圖5 淋巴結在AAF液固定4min的HE染色

圖7 淋巴結在冷丙酮固定4min的HE染色

表2 淋巴結在不同固定液和不同固定時間下HE染色評分

3 討論

乳腺癌患者術中冰凍腫物的性質、浸潤與否、淋巴結有無癌轉移均決定患者不同的手術方式,故術中冰凍診斷結果極其重要。在冰凍制片過程中,固定是極其重要的步驟,一張優質的切片是建立在適當而完全的固定基礎上的,固定不良,將導致后續的染色不良,影響診斷。本次實驗由3名醫生對切片進行評分,染色的蘇木素、醇溶性伊紅均采購已驗證穩定的試劑,每種固定液均實驗當天配置,保證結果的可靠性。

10%中性福爾馬林是 HE 染色中最常用的固定液之一,但其在冷凍切片中表現欠佳,可能與10%中性福爾馬林成分中含水量較多、無法低溫固定,造成了組織自溶,不適應于對冷凍切片組織進行快速固定的樣本[2],且用10%中性福爾馬林緩沖液固定冷凍切片時間長,需固定10min以上[3],故短時間固定效果差,組織形態模糊,核固縮,核質對比度差,無法診斷。丙酮為極易揮發、易燃的無色液體,可使蛋白質沉淀,滲透力強,核的固定不好,易使組織收縮[4]。冷丙酮固定的冰凍切片組織結構可見,但細胞核模糊,皺縮明顯,對比度欠佳,著色不均勻。冷丙酮冰凍固定一般在10min以上,故短時間固定效果不良,腫物切片延長固定時間,染色效果有改善,而淋巴結細胞較多,間質較少的組織,延長固定時間,染色效果沒有顯著變化。95%乙醇用于固定,對纖維蛋白和彈性纖維等固定效果好,其滲透力弱,能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白,但核蛋白經沉淀后,能溶于水,不利于染色體的固定[5]。高濃度乙醇對組織有較大收縮力,而AAF液在95%乙醇的基礎上加入了甲醛和醋酸,甲醛對組織染色效果較好,醋酸可以防止乙醇引起的收縮,醋酸能沉淀核蛋白,因此染色質固定很快,對蛋白質具有保存作用。本實驗固定1min時兩者差距顯微鏡下觀察并不明顯,可能是由于本實驗經過95%乙醇固定后的切片不水洗,直接蘇木素染色,避免洗滌造成核蛋白流失,影響染色,也可能與AAF液中酒精對組織的收縮作用尚不能防止冷凍引起的細胞內液體膨脹和冰醋酸對組織的膨脹作用,仍可引起核溶解,導致胞核染色欠佳有關[6]。當固定4min,兩者出現差距,腫物在AAF液固定效果明顯更好,AAF 液中的乙醇起快速固定作用,甲醛固定速度慢,起補充固定作用,而冰醋酸既可抵抗甲醛和乙醇對組織細胞的皺縮又有助染作用[7]。而淋巴結組織細胞密集,AAF液固定7min效果明顯優于其他幾種固定液。有文獻顯示用AAF液固定6min、8min、10min免疫組化染色較清晰、均勻,細胞形態良好,陽性信號定位清楚,定量準確,背景較淺,而固定1min免疫染色普遍較弱,細胞形態較差,陽性信號定位與定量均不理想,并可出現假陽性或假陰性[8]。

綜上所述,AAF液固定乳腺癌冰凍切片效果最好,腫物切片固定4min,淋巴結切片固定7minHE染色效果優于其他時間。