基于生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)探討PDXK在肝臟肝細(xì)胞癌的表達(dá)及臨床價(jià)值*

龍芳敏 陳祥鳳 易三桂 李根亮

右江民族醫(yī)學(xué)院 1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 2 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 3 生物醫(yī)藥與大健康現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院,廣西百色市 533000

肝臟肝細(xì)胞癌(Liver hepatocellular carcinoma,LIHC)是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率和病死率極高,病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制尚不明晰[1]。目前對(duì)LIHC的治療主要為藥物療法、手術(shù)切除和肝移植、化療、放療、免疫治療法、經(jīng)動(dòng)脈放射栓塞療法和射頻消融等,盡管在診斷和治療方面取得了進(jìn)展,但總體預(yù)后不佳,復(fù)發(fā)率仍然很高,超過(guò)50%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,3～6年內(nèi)死亡;近年免疫檢查點(diǎn)抑制劑對(duì)晚期肝癌表現(xiàn)出潛在的治療效果,但受肝臟功能、免疫耐受性、腫瘤微環(huán)境、肝癌干細(xì)胞性等多方面影響,給肝癌治療帶來(lái)了挑戰(zhàn)[2]。我國(guó)作為煙酒消費(fèi)大國(guó),國(guó)人的肝癌發(fā)病率長(zhǎng)期居高不下,挖掘與肝癌診療及預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因?qū)μ岣吒伟┰缙谠\療和預(yù)后評(píng)估仍具有重要臨床價(jià)值。

吡哆醛激酶(Pyridoxal kinase,PDXK)是一種產(chǎn)生維生素B6生物活性形式的酶,目前發(fā)現(xiàn)PDXK在卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤中起著重要作用[3-5]。目前涉及PDXK在LIHC中的研究鮮有報(bào)道,且PDXK在LIHC中的表達(dá)、功能、作用機(jī)制仍未知。因此,本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法和實(shí)驗(yàn)初步探討PDXK在LIHC中的表達(dá)及臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)集來(lái)源于Timer2.0數(shù)據(jù)庫(kù)(http://timer.cistrome.org/)、UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/)、HPA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.proteinatlas.org/)、STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)、DAVID(http://david.ncifcrf.gov/home.jsp)。人肝癌細(xì)胞Bel7404由右江民族醫(yī)學(xué)院肝癌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。PDXK小干擾RNA序列(small interfering RNA of PDXK,siPDXK) siRNA-PDXK-748、陰性對(duì)照序列(siRNA negative control,siNC)均由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成;Lipo fectamin 2000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司;PDXK和GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成。細(xì)胞RNA提取試劑盒購(gòu)于Omega Bio-Tek公司(R6834-01),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于碧云天生物科技有限公司(D7168M),實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于Tolobio公司(22204-2)。CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(C6005M)購(gòu)于UElandy公司。

1.2 方法

1.2.1 肝癌數(shù)據(jù)集篩選、提取及分析。利用Timer2.0數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析PDXK在腫瘤組織(n=371)和正常組織(n=50)中的表達(dá)情況、預(yù)后情況和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性。UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析PDXK在不同患者年齡、性別、瘤癥分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移情況、瘤癥分期、T53突變狀態(tài)和組織學(xué)亞型的LIHC組織與正常肝組織中的差異表達(dá)情況。HPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析PDXK免疫組化蛋白在LIHC組織和正常組織中的差異表達(dá)。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)繪制蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(置信度為0.04),利用數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID進(jìn)行功能富集分析,以FDR.P.val<0.05為入選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 采用小干擾RNA技術(shù)敲低肝癌細(xì)胞Bel7404中PDXK。選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Bel7404細(xì)胞(5×105個(gè)/mL)加入6孔板,培養(yǎng)過(guò)夜后,換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)1h,Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siRNA-PDXK-748序列: 正向引物序列為GGGCAGCAACUACCUGAUUTT,反向引物序列為AAUCAGGUAGUUGCUGCCCTT),轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列: 正向引物序列為UUCUCCGAACGUGUCACGUTT,反向引物序列為ACGUGACACGUUCGGAGAATT,轉(zhuǎn)染6h后,換成含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后檢測(cè)敲低效率。

1.2.3 觀察PDXK敲低后細(xì)胞形態(tài)變化。采用倒置顯微鏡觀察PDXK敲低組和陰性對(duì)照組的Bel7404細(xì)胞形態(tài)變化,10×目鏡視野下隨機(jī)采集4個(gè)視野的Bel7404細(xì)胞形態(tài)圖。

1.2.4 CCK8法檢測(cè)PDXK敲低后細(xì)胞存活率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Bel7404細(xì)胞,以5×103個(gè)/孔接種96孔板,鋪板過(guò)夜后,換成無(wú)血清培養(yǎng)基,用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染 siRNA-PDXK-748處理6h,去上清液,再加含10% CCK-8的培養(yǎng)液放于37℃培養(yǎng)1.5h,移至酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)讀取吸光度(OD) 值,以CCK-8工作液為空白組,Bel7404細(xì)胞存活率= (OD實(shí)驗(yàn)-OD空白) /(OD對(duì)照-OD空白)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,采用GraphPad Prism 5.0軟件統(tǒng)計(jì)分析,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析PDXK在泛癌、LIHC組織和非肝癌組織中的mRNA表達(dá) Timer2.0和UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析PDXK在泛癌、肝瘤組織和正常組織中的表達(dá)情況,結(jié)果如下圖1a所示PDXK在多種癌組織中高表達(dá),肝癌組織(n=371)比正常癌旁組織(n=50)表現(xiàn)出較高的PDXK水平,見圖1b(P<0.001)。

圖1 PDXK在泛癌、LIHC組織與正常組織中的mRNA表達(dá)

2.2 生物信息學(xué)分析PDXK在LIHC組織和非肝癌組織中的蛋白表達(dá) 從HPA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的免疫組織化學(xué)(IHC)染色數(shù)據(jù)顯示PDXK蛋白在LIHC組織中明顯比人正常肝組織表達(dá)高,與前述的mRNA表達(dá)結(jié)果一致,見圖2。

正常肝組織 肝癌組織

2.3 PDXK表達(dá)水平與LIHC患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 整合UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中TCGA-LIHC和正常對(duì)照組樣本的多個(gè)臨床信息進(jìn)行分析,選擇年齡、性別、體重、T53突變狀態(tài)、癌癥分級(jí)、癌癥分期、淋巴轉(zhuǎn)移及組織學(xué)亞型等方面進(jìn)行相關(guān)性分析,比較不同組別LIHC患者PDXK的表達(dá)情況,結(jié)果顯示 PDXK在多個(gè)不同臨床病理特征及癌癥分期、分級(jí)中存在差異表達(dá),LIHC患者的PDXK轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平明顯高于正常組織,與體重、TP53變異、癌癥分級(jí)、癌癥分期、淋巴轉(zhuǎn)移呈一定程度正相關(guān)(P<0.05),與年齡、性別、病理學(xué)分型相關(guān)性不大(P>0.05),見圖3。

圖3 PDXK在LIHC不同臨床病理特征及癌癥分級(jí)、分期中的表達(dá)與關(guān)系

2.4 生物信息學(xué)分析PDXK與甲基化的相關(guān)性 基于UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)LIHC中PDXK啟動(dòng)子甲基化水平比正常對(duì)照組低,與不同癌癥分級(jí)(G2～G4)的啟動(dòng)子甲基化水平呈一定程度的負(fù)相關(guān),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001或P<0.01),見圖4。

圖4 PDXK表達(dá)與甲基化關(guān)系VS正常對(duì)照組 **P<0.01 ,***P<0.001

2.5 生物信息學(xué)分析PDXK與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性 通過(guò)TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn),PDXK基因與腫瘤微環(huán)境中各類免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性是高度一致的,即LIHC中PDXK表達(dá)水平與B淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突細(xì)胞的浸潤(rùn)水平均呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與腫瘤細(xì)胞的純度和CD8+T細(xì)胞無(wú)相關(guān)性(P>0.05),見圖5。

圖5 PDXK與腫瘤微環(huán)境中免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的相關(guān)性

2.6 生物信息學(xué)分析PDXK與LIHC患者生存預(yù)后的相關(guān)性 在Timer2.0數(shù)據(jù)庫(kù)收集分析371例肝癌患者中PDXK表達(dá)與總體生存期的關(guān)系,結(jié)果如圖6所示PDXK的高表達(dá)和低表達(dá)的總體生存期存在顯著性差異, PDXK高表達(dá)與LIHC患者較差的總體生存期密切相關(guān)(P<0.05)。

圖6 PDXK表達(dá)與 LIHC 患者生存率的相關(guān)性

2.7 敲低 PDXK引起細(xì)胞形態(tài)損傷和細(xì)胞存活率降低 在Bel7404細(xì)胞中敲低PDXK后,明顯抑制Bel7404細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、Bel7404細(xì)胞形態(tài)改變、出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象(見圖7a)。且敲低PDXK后明顯降低Bel7404細(xì)胞存活率(P<0.01,見圖7b)。

圖7 敲低PDXK引起細(xì)胞形態(tài)破壞和細(xì)胞存活率降低

2.8 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與功能富集分析結(jié)果 結(jié)果顯示,PDXK與多個(gè)蛋白存在緊密互作的聯(lián)系(見圖8),與PDXK作用關(guān)聯(lián)緊密的Top10基因有PNPO、PDXP、AOX1、PHOSPHO2、PLPBP、TEF、FDX1、FDX 2、TP53RK、PCNAPDXK。PDXK的互作蛋白被用于GO和KEGG功能富集分析(見圖9)。GO富集分析主要包括1個(gè)生物學(xué)過(guò)程、4個(gè)細(xì)胞組分和4 個(gè)分子功能,其中細(xì)胞組分包括胞質(zhì)(GO:0005829)、核質(zhì)(GO:0005654)、外泌體(GO:0070062)、胞核(GO:0005634);分子功能包括磷酸吡啶酯結(jié)合(GO:0030170)、 ATP結(jié)合(GO:0005524)、蛋白質(zhì)均聚活性(GO:0042803)、鎂離子結(jié)合 (GO:0000287);生物學(xué)過(guò)程包括參與磷酸化作用(GO:0016310);KEGG富集的通路主要包括輔因子的生物合成(hsa01240)、維生素B6代謝(hsa00750)、代謝途徑(hsa01100)等信號(hào)通路中。

圖8 與PDXK存在緊密聯(lián)系的蛋白互作圖

圖9 PDXK基因及相關(guān)基因的功能富集

3 討論

吡哆醛激酶 (PDXK)是一種由PDXK基因編碼的維生素B6依賴性轉(zhuǎn)移酶,對(duì)維生素B6生物合成補(bǔ)救途徑至關(guān)重要,癌細(xì)胞依靠改變新陳代謝來(lái)支持其本身的異常增殖,PDXK對(duì)白血病細(xì)胞增殖至關(guān)重要,其活性的破壞會(huì)導(dǎo)致新陳代謝的改變以及核苷酸和多胺水平的降低[6]。研究表明PDXK缺乏可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的銅細(xì)胞凋亡,減少了腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[7]。PDXK表達(dá)與樹突狀細(xì)胞溶酶體相關(guān)膜糖蛋白呈正相關(guān),影響局部免疫監(jiān)視[8]。最近報(bào)道通過(guò)對(duì)1 816例卵巢癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)PDXK參與鉑和紫杉烷的耐藥相關(guān)性較高[3-4]。非小細(xì)胞肺癌中PDXK高表達(dá)與生存預(yù)后呈正相關(guān),且提高對(duì)順鉑的敏感性[4]。敲低大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞中的PDXK可顯著抑制細(xì)胞增殖及生長(zhǎng)[5]。在胃癌中,通過(guò)調(diào)控鋅指蛋白促進(jìn)膜聯(lián)蛋白A2和肌成束蛋白的表達(dá),同時(shí)抑制PDXK的表達(dá),影響胃癌的化療敏感性[9]。PDXK在多種癌癥中過(guò)表達(dá),可能是抗癌藥物設(shè)計(jì)和分子治療的潛在靶標(biāo),然而,目前PDXK在肝癌中的表達(dá)及對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。

本研究中,通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PDXK在肝癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均較正常肝組織高表達(dá),PDXK在不同臨床病理特征和不同癌癥分期、分級(jí)中存在差異表達(dá),且其表達(dá)水平與肝癌分期、分級(jí)均呈正相關(guān),提示PDXK可能是誘發(fā)肝癌的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因子。PDXK高表達(dá)與肝癌患者的生存預(yù)后呈負(fù)相關(guān),說(shuō)明PDXK可能是肝癌潛在的預(yù)后分子靶標(biāo);腫瘤的發(fā)生發(fā)展和臨床預(yù)后與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平密切相關(guān),癌變中免疫耐受和逃逸作用下會(huì)使腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的表達(dá)受抑制,無(wú)法進(jìn)行抗癌,反而利于腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[10-11]。肝癌中PDXK的高表達(dá)與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突細(xì)胞的浸潤(rùn)水平均呈顯著正相關(guān),說(shuō)明PDXK的異常高表達(dá)可能與腫瘤微環(huán)境免疫活性的調(diào)節(jié)有關(guān),從而影響肝癌患者免疫治療的效果,因此,PDXK可能是肝癌微環(huán)境免疫狀態(tài)的潛在標(biāo)志物。DNA甲基化在惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制中調(diào)節(jié)染色質(zhì)重塑和基因轉(zhuǎn)錄功能,最終在細(xì)胞水平影響癌癥的特征和行為;異常甲基化,包括啟動(dòng)子高甲基化和低甲基化,參與多種癌癥的腫瘤發(fā)生,在復(fù)制后期異常的整體甲基化丟失與免疫逃逸特征相關(guān)[12-14]。PDXK高表達(dá)與肝癌甲基化呈一定程度的負(fù)相關(guān),說(shuō)明PDXK高表達(dá)可能引起異常低甲基化,促進(jìn)肝癌的免疫逃逸。

為研究PDXK的細(xì)胞組成、分子功能和生物學(xué)特性,對(duì)PDXK進(jìn)行基因功能富集分析,其中與PDXK作用關(guān)聯(lián)緊密的基因有PNPO、PDXP、AOX1、PHOSPHO2等,這些基因均參與了癌癥的發(fā)展。例如:PNPO過(guò)度表達(dá)與患者的總體生存率呈負(fù)相關(guān),敲低PNPO會(huì)導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和集落形成減少,使細(xì)胞周期停滯在G2/M期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。PDXP的遺傳和表觀遺傳學(xué)改變會(huì)導(dǎo)致計(jì)時(shí)蛋白表達(dá)的改變,從而可調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與侵襲之間的相互作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)與具有AOX1甲基化的個(gè)體相比,沒(méi)有AOX1甲基化的個(gè)體患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)高1.37倍(95%CI:1.02～1.84),AOX1和IRF4的非甲基化是乳腺癌的危險(xiǎn)因素[17]。AOX1的高表達(dá)通過(guò)活性氧 (ROS) 的產(chǎn)生促進(jìn)結(jié)直腸癌增殖和侵襲并抑制細(xì)胞凋亡[18]。與非腫瘤組織相比,腫瘤組織中PHOSPHO2顯著升高,PHOSPHO2的高表達(dá)與肝癌患者較差的總生存期相關(guān),PHOSPHO2的敲低降低了OR-6和 Huh 7.5.1 肝癌細(xì)胞中用索非布韋治療增加的細(xì)胞增殖和遷移[19]。以上結(jié)果均與本研究的結(jié)果相符合,說(shuō)明PDXK高表達(dá)可能是促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)展的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因子。GO富集分析發(fā)現(xiàn),PDXK基因及相關(guān)基因參與的細(xì)胞組分包括外泌體(GO:0070062)。外泌體是含有microRNA、RNA、DNA片段和蛋白質(zhì)的小膜囊泡,可從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞釋放外泌體來(lái)重新編程與腫瘤微環(huán)境相關(guān)的因子,從而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和免疫逃逸;新的證據(jù)表明,癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體攜帶免疫抑制分子程序死亡配體1,它與受體程序死亡蛋白1結(jié)合,并通過(guò)逃避免疫反應(yīng)來(lái)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[20]。由此推測(cè),PDXK可能通過(guò)外泌體介導(dǎo)調(diào)控肝瘤轉(zhuǎn)移和免疫逃逸。KEGG富集的通路集中在輔因子的生物合成(hsa01240)、維生素B6代謝(hsa00750)、代謝途徑(hsa01100)等信號(hào)通路中。葡萄糖代謝紊亂是腫瘤代謝的十大特征之一,研究發(fā)現(xiàn)PDXK的下調(diào)影響葡萄糖代謝的穩(wěn)態(tài)和DNA完整性,PDXK基因的突變可導(dǎo)致染色體畸變,使葡萄糖含量增加,暗示PDXK可能通過(guò)調(diào)控葡萄糖代謝來(lái)促進(jìn)肝瘤發(fā)展[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)維生素B6代謝參與DNA損傷和癌癥發(fā)展,維生素B6缺乏與多種腫瘤的明顯增加有關(guān),特別是影響胃腸道和肺部[6],這提示PDXK可能通過(guò)調(diào)控維生素B6代謝來(lái)影響肝癌的發(fā)生發(fā)展。肝臟是人體最重要的新陳代謝器官,PDXK的異常表達(dá)可能通過(guò)改變多個(gè)代謝相關(guān)信號(hào)通路調(diào)節(jié)參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展。

為進(jìn)一步確認(rèn)PDXK對(duì)肝癌細(xì)胞的形態(tài)和生物學(xué)功能的影響,運(yùn)用siRNA技術(shù)對(duì)Bel7404細(xì)胞中的PDXK進(jìn)行敲低,利用倒置顯微鏡觀察Bel7404細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài),結(jié)果顯示PDXK敲低后引起B(yǎng)el7404細(xì)胞形態(tài)改變、損傷,出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象,顯著抑制Bel7404細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,進(jìn)一步運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)Bel7404細(xì)胞的存活率,發(fā)現(xiàn)PDXK敲低后可顯著降低Bel7404細(xì)胞的存活率。該結(jié)果與先前研究中敲低PDXK顯著抑制腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的研究結(jié)果一致[5]。

綜上所述,本文通過(guò)生物信息學(xué)方法和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證揭示了PDXK在肝癌中的價(jià)值, PDXK高表達(dá)可能是導(dǎo)致LIHC患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,PDXK有望成為肝癌的抗癌藥物設(shè)計(jì)、分子治療的有效分子靶點(diǎn)和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物,但仍需更多實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步研究。