基于虛擬篩選-分子對(duì)接-活性評(píng)價(jià)技術(shù)探討四逆湯抗抑郁的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)*

趙若嵐,董盛,宋亞剛,權(quán)偉,馬善波

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,陜西 咸陽(yáng) 712046; 2.河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450046;3.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院,陜西 西安 710032

抑郁癥屬于中醫(yī)“郁證”范疇,郁證主要是由情志不舒、氣機(jī)郁滯引起的,以心情抑郁、情緒不寧、胸部滿悶或易怒易哭等為主要表現(xiàn)[1]。名老中醫(yī)李可辨治郁證,從中醫(yī)陰陽(yáng)觀出發(fā),運(yùn)用《傷寒雜病論》經(jīng)典方劑四逆湯,形成系統(tǒng)的治療方案。四逆湯由甘草(炙)、干姜、附子(生用,去皮)三味藥組成,基于此方,逐日增加附子用量,即可有效緩解抑郁癥狀[2-3],但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不清楚。

中藥藥效物質(zhì)是指能夠反映中藥臨床療效的化學(xué)成分群。這些成分是中藥在進(jìn)入機(jī)體后,作用于多個(gè)靶點(diǎn)并產(chǎn)生整體治療效果的化學(xué)組分[4]。虛擬篩選和分子對(duì)接技術(shù)能夠?qū)⒁阎男》肿踊钚晕镔|(zhì)與相關(guān)靶蛋白進(jìn)行對(duì)接,從而在分子層面闡明中藥效應(yīng)成分與靶標(biāo)之間的作用機(jī)制。目前,這項(xiàng)技術(shù)在揭示中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與心血管疾病、癌癥等眾多疾病的病理機(jī)制方面都發(fā)揮重要作用[5]。

藥物靶點(diǎn)是藥物發(fā)揮治療作用的生物大分子,其中蛋白質(zhì)是最重要的藥物靶點(diǎn)[6]。目前,臨床上使用的抗抑郁藥物主要是基于“單胺神經(jīng)遞質(zhì)假說(shuō)”而研發(fā),包括選擇性5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)再攝取抑制劑、選擇性去甲腎上腺素(norepinephrine,NA)再攝取抑制劑、選擇性NA/5-HT再攝取抑制劑以及單胺氧化酶抑制劑(monoamine oxidase inhibitor,MAOI)等[7]。這些靶點(diǎn)不僅是抗抑郁藥物的“可成藥”靶點(diǎn),也是研究相對(duì)成熟的靶點(diǎn)。中藥作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)對(duì)于闡明中藥的作用機(jī)制具有重要意義。

因此,本研究首先檢索四逆湯的化學(xué)成分,并結(jié)合類(lèi)藥五原則、口服生物利用度等參數(shù)進(jìn)行篩選。然后,采用Discovery StudioTM2016軟件,對(duì)化合物與抗抑郁藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,探索兩者的親和力與結(jié)合模式。最后,采用小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22細(xì)胞和小鼠抑郁模型,觀察四逆湯活性成分的抗抑郁作用,初步闡明四逆湯抗抑郁的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物清潔級(jí)健康C57BL/6雄性小鼠,體質(zhì)量(20±1) g,購(gòu)自陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(陜)2021-001,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(陜)2021-001。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理審批編號(hào):SUCMDL20230620003。

1.2 細(xì)胞小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞,購(gòu)自武漢梓杉生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):STCC20011P。

1.4 儀器懸尾實(shí)驗(yàn)測(cè)試儀、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)測(cè)試儀(上海欣軟信息科技有限公司,型號(hào):XR-XX203、XR-XQ202);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司,型號(hào):BPN-80CRH);熒光顯微鏡(OLYMPUS 光學(xué)技術(shù)公司,型號(hào):BX53M)。

2 方法

2.1 四逆湯抗抑郁的關(guān)鍵活性成分篩選

2.1.1 四逆湯活性成分篩選通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)[8]檢索四逆湯三味中藥(甘草、干姜、附子)的活性成分。根據(jù)類(lèi)藥五原則及相關(guān)條件進(jìn)行二次篩選:(1)分子量<500;(2)脂水分配系數(shù)<5;(3)氫鍵給體數(shù)目<5;(4)氫鍵受體數(shù)目<10;(5)口服生物利用度>50%;(6)類(lèi)藥性>0.18,最終得到的化合物以mol2的格式保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 抑郁癥作用靶點(diǎn)篩選通過(guò)RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)[9]檢索抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn),分別以“serotonin transporter 5i71”“dopamine transporter 4m48”“monoamine oxidase A 2z5x”“histamine receptor H1 3rze”作為關(guān)鍵詞,檢查相應(yīng)的靶蛋白并下載pdb格式的文件。

2.1.3 分子對(duì)接與關(guān)鍵活性成分篩選采用Discovery StudioTM2016分子對(duì)接軟件,對(duì)靶蛋白進(jìn)行預(yù)處理,將其作為受體分子;將四逆湯活性成分作為配體分子,設(shè)置配體所在位置為活性中心。將受體與配體進(jìn)行分子對(duì)接,即可觀察受體蛋白氨基酸殘基與配體對(duì)接間的非鍵相互作用力,也可生成配體-蛋白相互作用的二維平面圖,從而直觀觀察兩者的相互作用及關(guān)鍵的氨基酸基團(tuán)。同時(shí),計(jì)算對(duì)接的Cdocker Energy,包含配體分子內(nèi)能、與受體的相互作用能。為了避免高得分化合物的屏蔽作用,減少假陰性化合物的產(chǎn)生,選取與靶蛋白的親和數(shù)、親和力排名前15位的化合物作為關(guān)鍵活性成分。

（1）上消化道出血相關(guān)知識(shí)的掌握情況：采用自制調(diào)查表，了解干預(yù)前后兩組患者對(duì)上消化道出血相關(guān)知識(shí)的掌握程度。共25題，每題4分，總分100分，得分≥90分，掌握程度為優(yōu)；70～89分，掌握程度為中；＜70分，掌握程度為差；（2）對(duì)兩組患者的生活質(zhì)量狀況采用生活質(zhì)量調(diào)查量表[5]進(jìn)行評(píng)價(jià)，該量表共35個(gè)條目，分為日常生活能力、社會(huì)活動(dòng)能力、焦慮心理狀態(tài)、抑郁心理狀態(tài)4個(gè)維度，每個(gè)條目1～4分，總分范圍35～140分，總分越高意味著個(gè)體的生活質(zhì)量越低。入院護(hù)理查體時(shí)和出院前進(jìn)行出院指導(dǎo)時(shí)，以同樣的方法和量表調(diào)查兩組患者的生活質(zhì)量狀況。

2.2 四逆湯活性成分抗抑郁的實(shí)驗(yàn)研究

2.2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1.1 藥物制備精密稱(chēng)取(R)-去甲烏頭堿、甘草素、山柰酚及皮質(zhì)酮適量,分別加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,配置濃度為1 mol·L-1的藥液。

2.2.1.2 HT22細(xì)胞培養(yǎng)HT22細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞,以1×105mL-1的密度接種至24孔板,培養(yǎng)過(guò)夜后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),待細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí),分為空白組、模型組、(R)-去甲烏頭堿組、甘草素組和山柰酚組。除空白組外,其余各組細(xì)胞先加入皮質(zhì)酮200 μL培養(yǎng)24 h,建立體外抑郁模型[10],隨后加入相應(yīng)藥物100 μL干預(yù) 24 h,光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)并拍照。

2.2.1.3 TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡情況采用TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。收集HT22細(xì)胞,4%冷乙醇固定細(xì)胞30 min,洗滌后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行蛋白酶消化,以去除背景蛋白質(zhì)干擾。將配置好的TUNEL溶液滴加到細(xì)胞上,反應(yīng)1 h,加入終止液停止反應(yīng),倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.2.1 藥物制備精密稱(chēng)取(R)-去甲烏頭堿、甘草素、山柰酚適量,分別加入生理鹽水配成質(zhì)量濃度為1 g·L-1、1.5 g·L-1、2 g·L-1的藥液。

2.2.2.2 小鼠抑郁模型建立40只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、(R)-去甲烏頭堿組(10 mg·kg-1)、甘草素組(15 mg·kg-1)、山柰酚組(20 mg·kg-1),每組8只。除空白組外,其余各組小鼠采用慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)的方式建立抑郁模型。刺激因素包括:熱水游泳5 min(45 ℃),夾尾5 min,冷水游泳5 min(6 ℃),人工水平震蕩5 min,夜間強(qiáng)光照射 5 min,禁食24 h,禁水24 h。每天隨機(jī)選取1種應(yīng)激源,連續(xù)28 d[11]。造模首日開(kāi)始給藥,每日1次,空白組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

2.2.2.3 行為學(xué)檢測(cè)方法(1)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test,FST):將小鼠放入盛水的透明玻璃桶中,水溫(22±1)℃,水深12 cm。通過(guò)高清數(shù)碼攝像機(jī)記錄小鼠6 min內(nèi)的活動(dòng)情況,然后采用雙盲法計(jì)算第2—6 min小鼠不動(dòng)行為的時(shí)間。不動(dòng)行為的判斷標(biāo)準(zhǔn)為:小鼠停止掙扎,呈漂浮直立狀態(tài),僅有偶而的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮在水面,身體無(wú)屈曲或扭動(dòng)[12]。(2)懸尾實(shí)驗(yàn)(tail suspension test,TST):使用膠帶固定小鼠尾巴,固定位置距離尾尖大約1 cm;懸掛小鼠,頭部距離桌面約10 cm;高清數(shù)碼攝像機(jī)采集圖像,采用雙盲法分析小鼠在6 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間[13]。(3)糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)(sucrose preference test,SPT):末次灌胃后,小鼠禁食禁水24 h,每籠放置1%糖水和普通飲用水,為了避免小鼠產(chǎn)生位置偏好,每1 h交換水瓶位置,2 h后取下水瓶并稱(chēng)重,計(jì)算糖水偏愛(ài)度[14]。

糖水偏愛(ài)度 =糖水消耗量(g)/[糖水消耗量(g)+普通水消耗量(g)]×100%

3 結(jié)果

3.1 四逆湯抗抑郁的關(guān)鍵活性成分篩選

3.1.1 四逆湯活性成分與抑郁癥靶點(diǎn)通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取四逆湯活性成分493個(gè),其中干姜148個(gè),甘草280個(gè),附子65個(gè)。根據(jù)類(lèi)藥五原則及相關(guān)條件篩選得到91個(gè)化合物,占總化合物的18.5%。通過(guò)RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到抑郁癥作用靶點(diǎn)4個(gè),即單胺氧化酶A(monoamine oxidase A,MAO-A)、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopamine transporter,DAT)、5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(serotonin transporter,SERT)、組胺H1受體(histamine H1 receptor,H1R)。

3.1.2 四逆湯抗抑郁癥的關(guān)鍵活性成分通過(guò)Discovery StudioTM2016對(duì)91個(gè)活性成分與4個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,篩選出15個(gè)關(guān)鍵活性成分,包括(R)-去甲烏頭堿、山柰酚、甘草素、甘草黃酮醇等,見(jiàn)表1。

表1 四逆湯抗抑郁的關(guān)鍵活性成分信息

3.1.3 關(guān)鍵活性成分與4個(gè)靶點(diǎn)的親和力將15個(gè)關(guān)鍵活性成分與4個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,取Cdocker Energy排名前10位的結(jié)果予以展示,見(jiàn)表2。其中,MAO-A與(R)-去甲烏頭堿、甘草黃酮醇A、山柰酚的親和力最強(qiáng);DAT與甘草素、異甘草素、(R)-去甲烏頭堿的親和力最強(qiáng);H1R與山柰酚、甘草素、異甘草素的親和力最強(qiáng);SERT與(R)-去甲烏頭堿、甘草黃酮醇A、山柰酚的親和力最強(qiáng)。

表2 分子對(duì)接結(jié)合能 (kcal·mol-1)

3.1.4 四逆湯關(guān)鍵成分與抑郁癥靶點(diǎn)的結(jié)合模式選取與每個(gè)靶點(diǎn)親和力最強(qiáng)的化合物,繪制活性成分與靶點(diǎn)結(jié)合圖,可直觀觀察兩者的結(jié)合模式以及與周?chē)被釟埢南嗷プ饔谩ERT的活性空腔主要由Ile172、Ala173、Tyr176、Phe341、Phe335、Gly338、Ser438、Leu443等組成,(R)-去甲烏頭堿占據(jù)了SERT的活性空腔,且與Phe335、Gly338、Ser438存在較好的疏水作用,與Ile172、Ala173、Phe341、Leu443存在較好的π-π共軛。(R)-去甲烏頭堿占據(jù)了由殘基Gly67、Asn180、Asn181、Gln215、Ile335、Tyr407和Met445形成的MAO-A活性空腔,其氨基與Asn181形成一個(gè)氫鍵,其環(huán)狀結(jié)構(gòu)與Tyr407形成π-π堆積作用。DAT的活性空腔Ala44、Asp121、Ser320、Ser422、Ser421均為疏水殘基,推測(cè)疏水作用是甘草素與DAT結(jié)合的主要推動(dòng)作用。另外,Val120存在疏水作用,且與Tyr431、Phe432存在T型的π-π堆積作用,見(jiàn)圖1。

注:A:SERT與(R)-去甲烏頭堿;B:MAO-A與(R)-去甲烏頭堿;C:DAT與甘草素;D:H1R與山柰酚。

3.2 四逆湯活性成分的抗抑郁作用

3.2.1 (R)-去甲烏頭堿、甘草素及山柰酚對(duì)HT22細(xì)胞形態(tài)的影響空白組細(xì)胞光澤度好,突起交錯(cuò)分布且相互連接,有較為明顯的突起相連形態(tài)。模型組細(xì)胞光澤度較差,突起連接部分?jǐn)嗔严?可見(jiàn)細(xì)胞變圓皺縮。與模型組比較,(R)-去甲烏頭堿組細(xì)胞形態(tài)皺縮減輕,分布較為規(guī)則,有一定的突起連接形態(tài);甘草素組細(xì)胞光澤度較好,形態(tài)皺縮減輕,存在突起相連形態(tài);山柰酚組細(xì)胞形態(tài)皺縮減輕,存在突起連接形態(tài),見(jiàn)圖2。

注:A:空白組;B:模型組;C:(R)-去甲烏頭堿組;D:甘草素組;E:山柰酚組。

3.2.2 (R)-去甲烏頭堿、甘草素及山柰酚對(duì)HT22細(xì)胞凋亡的影響空白組基本未見(jiàn)細(xì)胞凋亡;與空白組比較,模型組細(xì)胞凋亡增加;與模型組比較,(R)-去甲烏頭堿組、甘草素組及山柰酚組細(xì)胞凋亡減少,見(jiàn)圖3。

注:A:空白組;B:模型組;C:(R)-去甲烏頭堿組;D:甘草素組;E:山柰酚組。

3.2.3 (R)-去甲烏頭堿、甘草素及山柰酚對(duì)CUMS小鼠行為學(xué)的影響與空白組比較,模型組小鼠糖水偏愛(ài)度降低(P<0.05);與模型組比較,(R)-去甲烏頭堿組小鼠糖水偏愛(ài)度升高(P<0.05)。與空白組比較,模型組小鼠不動(dòng)時(shí)間(TST和FST)均增加(P<0.05);與模型組比較,甘草素組小鼠TST不動(dòng)時(shí)間減少(P<0.05),(R)-去甲烏頭堿組、甘草素組小鼠FST不動(dòng)時(shí)間減少(P<0.05),見(jiàn)圖4。

注:A:糖水偏愛(ài)度;B:TST不動(dòng)時(shí)間;C:FST不動(dòng)時(shí)間;與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05。

4 討論

名老中醫(yī)李可將《傷寒雜病論》的六經(jīng)辨證思想應(yīng)用于臨床遣方用藥,尤善附子、烏頭等峻藥治療危重患者。四逆湯是張仲景治療心腎陽(yáng)衰寒厥證的代表方劑,李可臨床應(yīng)用四逆湯不限于少陰病,還將其用于抑郁癥、咳喘、足心發(fā)熱等病[15]。本研究采用“虛擬篩選-分子對(duì)接-活性評(píng)價(jià)”的中藥新藥發(fā)現(xiàn)與評(píng)價(jià)新模式,深入挖掘四逆湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為該方的二次開(kāi)發(fā)提供思路,這也是中藥現(xiàn)代化研究的一個(gè)重要方向。

本研究發(fā)現(xiàn)四逆湯抗抑郁的15個(gè)關(guān)鍵活性成分,包括(R)-去甲烏頭堿、山柰酚、甘草素、甘草黃酮醇A、3,4,5,7-四羥基-8-甲氧基黃酮、異甘草素等。這些化合物富含黃酮類(lèi)成分,已有文獻(xiàn)報(bào)道黃酮類(lèi)化合物具有抗抑郁作用[16]。研究表明,山柰酚具有抗癌、抗癲癇、抗炎、抗氧化等作用[17]。王佳等[18]研究發(fā)現(xiàn),山柰酚具有抗大鼠抑郁的作用,能提高抑郁大鼠腦內(nèi)NA、多巴胺、5-HT水平,與本研究的虛擬篩選結(jié)果一致。(R)-去甲烏頭堿是一種含氮原子的雜環(huán)化合物,廣泛存在于藥用植物中,具有多種藥理活性,如抗炎、擴(kuò)張血管、抗心律失常等[19]。本研究發(fā)現(xiàn),(R)-去甲烏頭堿與MAO-A、SERT具有較強(qiáng)的親和力,可能是四逆湯抗抑郁的藥效物質(zhì)之一。此外,本研究發(fā)現(xiàn)甘草素與DAT、H1R具有很強(qiáng)的親和力,甘草素或有可能開(kāi)發(fā)成為具有抗抑郁活性的先導(dǎo)化合物。因此,四逆湯的活性成分可能通過(guò)抑制DA等神經(jīng)遞質(zhì)代謝、減少5-HT攝取、抑制H1R活性等機(jī)制發(fā)揮抗抑郁作用。

分子對(duì)接結(jié)果表明,(R)-去甲烏頭堿占據(jù)SERT的活性空腔,與Ile172、Ala173、Phe341、Leu443存在較好的π-π共軛。Henry等[20]通過(guò)定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Ile172是SERT的關(guān)鍵殘基,與本研究結(jié)果相符。(R)-去甲烏頭堿占據(jù)MAO-A的活性空腔,其氨基與Asn181形成氫鍵,環(huán)狀結(jié)構(gòu)與Tyr407形成π-π堆積作用。Upadhyay等[21]研究表明,與Asn181、Tyr407的相互作用是決定化合物能否與MAO-A活性中心結(jié)合的關(guān)鍵,這與本研究的結(jié)果一致。另外,肉葉蕓香堿與Tyr407也存在π-π堆積作用,這表明Tyr407可能是影響化合物與MAO-A結(jié)合的關(guān)鍵殘基之一。DAT的活性空腔組成均為疏水殘基,且與Val120存在較好的π-π共軛。Penmatsa等[22]研究表明,與Val120的相互作用是抗抑郁活性的關(guān)鍵。山柰酚的3號(hào)、7號(hào)、1號(hào)氧原子與Ser111、Thr194、Tyr431形成氫鍵,環(huán)狀結(jié)構(gòu)與Tyr108、Trp428、Phe432、Phe435、Ile454存在疏水作用,且與Tyr431、Phe432存在T型π-π堆積作用。Heifetz等[23]研究表明,Asp107、Tyr108、Ser111、Thr112、Phe432、Tyr458是H1R與化合物作用的關(guān)鍵殘基。

分子對(duì)接技術(shù)尚存在諸多缺陷和局限性,其結(jié)果不能取代實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),在很多情況下需要結(jié)合其它方法加以驗(yàn)證[24]。本研究采用皮質(zhì)酮刺激HT22細(xì)胞模擬體外抑郁狀態(tài),發(fā)現(xiàn)(R)-去甲烏頭堿、甘草素及山柰酚能夠有效保護(hù)皮質(zhì)酮刺激下的HT22細(xì)胞。CUMS模型具有良好的抑郁癥表面效度、結(jié)構(gòu)效度和預(yù)測(cè)效度,主要模擬抑郁癥的快感缺失癥狀。這種癥狀在造模成功后可持續(xù)數(shù)周,并被抗抑郁藥物逆轉(zhuǎn)[25]。本研究發(fā)現(xiàn),(R)-去甲烏頭堿、甘草素及山柰酚可有效緩解抑郁模型大鼠的抑郁情緒和絕望情緒。

綜上所述,本研究采用中藥新藥發(fā)現(xiàn)與評(píng)價(jià)的新模式“虛擬篩選-分子對(duì)接-活性評(píng)價(jià)”,深入挖掘四逆湯抗抑郁的物質(zhì)基礎(chǔ)主要為(R)-去甲烏頭堿、甘草素及山柰酚,為四逆湯的二次開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。