基于JNK/MAPK信號通路分析脊痛消膠囊治療腰椎間盤突出癥的作用機制*

謝希,李玲,石曄,鄧漢清,婁宏君,高曦

1.黑龍江中醫藥大學第一臨床醫學院,黑龍江 哈爾濱 150040; 2.湖南中醫藥大學中醫學院,湖南 長沙 410208;3.湖南中醫藥大學中西醫結合學院,湖南 長沙 410208; 4.湖南中醫藥大學第一臨床醫學院,湖南 長沙 410208;5.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院,黑龍江 哈爾濱 150040

腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation,LDH)是因腰椎間盤變性、纖維環破裂、髓核組織突出壓迫和刺激腰骶神經根、馬尾神經所引起的一種綜合征[1]。LDH的臨床表現主要為腰背部疼痛、僵硬、活動受限、下肢麻木,嚴重者甚至可出現大小便困難等癥狀。目前,針對LDH的治療可分為保守治療和手術治療,其中保守治療是大多數初發患者的首選方式,主要形式為臥床休息、藥物治療、運動療法、硬膜外注射、腰椎牽引和中醫治療等,且多數患者經過保守治療后臨床癥狀得到減輕,有的還會出現腰椎間盤重吸收現象[2]。研究顯示,經過中醫保守治療后,320例患者的腰椎間盤突出率顯著下降,其中189例患者的突出吸收率>30%,81例患者的突出吸收率>50%,表明中醫保守治療LDH具有潛在優勢[3]。脊痛消膠囊是黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院院內制劑,由當歸、澤瀉和川芎等14味中藥組成,具有清熱利尿、活血化瘀、通經止痛的功效,臨床常用其治療LDH和頸椎病,療效確切[4-6]。該藥組分復雜,作用靶點繁多,深入闡明其治療LDH的物質基礎和藥效機理對于其臨床運用和現代藥理學研究具有重要價值。近年來,網絡藥理學成為研究中藥組方有效成分體系與病證復雜生物系統相互作用關系的重要方法,其核心理念為“網絡靶標”,將方藥和病證映射于生物分子網絡,從分子和信號通路等層面對網絡進行解析,根據生物分子在網絡中的重要性度量,篩選關鍵靶標和有效成分,從而對方藥-疾病的作用機制和有效成分進行機制性地計算和預測[7]。本研究借助網絡藥理學的方法對脊痛消膠囊治療LDH的靶標和成分進行預測,再進一步利用分子對接技術和體外實驗對預測結果進行驗證,以期為脊痛消膠囊的臨床運用提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 脊痛消膠囊有效成分和靶點收集在中藥系統藥理學(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology,TCMSP)數據庫中收集脊痛消的化學成分,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug likeness,DL)≥0.18為條件篩選有效成分,并收集其作用靶點;由于地龍和五靈脂未被TCMSP數據庫收納,故在BATMAN-TCM數據庫收集五靈脂的化學成分和作用靶點,在中醫藥資料@Taiwan數據庫收集地龍的化學成分,并將檢索到的化學成分導入SwissADME數據庫,以Gatrointestinal absorption為High,Drug likeness 5個指標中滿足兩個為條件篩選兩者的有效成分,然后以Probability>0為條件在Swiss Target Prediction數據庫預測其作用靶點。利用Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org)對蛋白靶點名稱進行校正,以“Homo sapiens”為種屬來源,刪除未經驗證和無對應基因名的蛋白靶點,得到蛋白靶點的官方基因名稱。

1.2 LDH靶點收集在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org)、OMIM數據庫(https://www.omim.org)和DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org)中以“lumbar disc herniation”為關鍵詞檢索疾病相關靶點。

1.3 PPI網絡構建與關鍵靶點篩選利用Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對成分靶點和LDH靶點進行映射獲得潛在靶點,隨后將交集靶點導入String數據庫(https://string-db.org),設置置信度為0.7,隱藏網絡中孤立的節點,將結果保存為TSV格式文件并在Cytoscape 3.9.1軟件中對PPI進行分析,構建可視化網絡,利用軟件中的插件CytoNCA篩選關鍵靶點。

1.4 “藥物-活性成分-潛在靶點”網絡構建將交集靶點與有效化學成分導入Cytoscape 3.9.1軟件構建“藥物-活性成分-潛在靶點”網絡。

1.5 富集分析將交集靶點導入R Studio軟件,利用clusterProfiler包對潛在靶點進行基因本體(Gene Ontology,GO)功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,設置P<0.05,物種為Homo sapiens,再通過ggplot2包對分析結果進行可視化。

1.6 分子對接從Protein Data Bank(PDB)數據庫(https://www.rcsb.org)下載各靶點基因的蛋白質晶體結構,從TCMSP數據庫下載藥物活性成分的3D結構,運用AutoDockTools軟件對受體蛋白和配體小分子進行加氫、平衡電荷等修飾。利用AutoDock Vina軟件對受體蛋白與配體小分子進行分子對接,結合能打分,Pymol和Discovery Studio軟件將對接結果進行可視化。

1.7 動物實驗驗證

1.7.1 實驗動物SPF級雄性SD大鼠50只,購自湖南斯萊克景達實驗動物公司,體質量200～220 g,許可證號:SYXK(湘)2019-0009,飼養溫度 22～24 ℃,相對濕度40%～60%。本研究經黑龍江中醫藥大學倫理委員會審批通過,批號:2022030102。

1.7.2 主要實驗試劑與儀器脊痛消膠囊(黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院,每粒0.25 g,批號:黑藥制字Z20100379);塞來昔布膠囊(輝瑞制藥有限公司,每粒0.2 g,批號:國藥準字J20140072);c-JUN、p-c-JUN、c-FOS、p-c-FOS、JNK、p-JNK、p38-MAPK和p-p38-MAPK抗體(貨號:bsm-42050M、bs-1735R、bsm-33204M、bs-12910R、bs-2592R、bs-4163R、bs-0637R、bs-2210R,北京Bioss);IL-6、IL-10、TNF-α的ELISA試劑盒(貨號:E-EL-R0015c、E-EL-R0016c、E-EL-R2856c,武漢Elabscience);BCA試劑盒(C05-02001,北京Bioss)。多功能酶標儀(Infinite?M Nano+,瑞士Tecan);石蠟切片機(A0820,美國華納-蘭伯特技術公司);電泳儀(Mini-ProteanTetra,美國Biorad);微量移液器(FinnpipetteTMF2,美國Thermo)。

1.7.3 造模與分組50只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、脊痛消膠囊低劑量組、脊痛消膠囊高劑量組和塞來昔布組,參考杜肖勛等[8]的造模方法,其中模型組、脊痛消膠囊組、塞來昔布組中取大鼠第3、4尾椎椎間盤2個,以10 mL針頭刺破椎間盤正中纖維環,暴露并取出髓核,并將其置于硬膜外腔暴露處,隨后逐層縫合,并于傷口處涂抹紅霉素眼膏。假手術組大鼠僅暴露椎間盤,不作其他處理。按照人與動物體表面積換算法,脊痛消膠囊低劑量組和高劑量組分別按照0.57 g·kg-1和1.14 g·kg-1灌胃給藥,塞來昔布組按照0.02 g·kg-1灌胃給藥,假手術組給予等量體積生理鹽水,14 d后處死動物。

1.7.4 組織蛋白測定水合氯醛麻醉后,取大鼠椎間盤髓核組織,PBS沖洗兩次,RIPA提取總蛋白,BCA法定量蛋白濃度,電泳2 h,轉移到PVDF膜,封閉2 h,按照11 000 比例孵育一抗過夜,TBST洗滌3次,每次10 min,按照15 000比例孵育二抗 2 h,TBST洗滌,顯影,Image J軟件對結果進行分析。

1.7.5 血清細胞因子測定大鼠行腹主動脈采血,離心后收集血清,免疫酶聯吸附法檢測血清中白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-10和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,嚴格按照試劑盒說明書操作。

2 結果

2.1 脊痛消膠囊有效化學成分和靶點收集收集到脊痛消膠囊有效成分:白芍13種、車前子9種、川芎7種、澤蘭2種,當歸2種、杜仲28種、莪術3種、防己3種、黃芪20種、三棱5種、延胡索49種、澤瀉10種、五靈脂7種和地龍5種,去重后共獲得139種活性成分。收集到作用靶點:白芍123個、車前子195個、川芎42個、澤蘭69個、當歸69個、杜仲532個、莪術24個、防己47個、黃芪462個、三棱140個、延胡索1 098個、澤瀉9個、五靈脂115個和地龍248個。靶點去重后獲得479個靶點,見圖1。

圖1 脊痛消膠囊與LDH靶點映射結果

2.2 LDH靶點收集在3個數據庫中共檢索到590個與LDH相關的靶點,見圖1。

2.3 PPI網絡構建與關鍵靶點篩選將上述獲得的化學成分靶點與TNBC靶點取交集后,得到潛在作用靶點,共84個,將交集靶點導入String數據庫(https://string-db.org),設置置信度為0.7,隱藏網絡中孤立的節點,將結果保存為TSV格式文件并在Cytoscape 3.9.1軟件中,對蛋白相互作用結果進行分析,構建可視化網絡,見圖2,利用Cytoscape 3.9.1軟件中的插件CytoNCA進行關鍵靶點篩選,根據度值獲得排名前10位的核心靶點,見表1。

表1 核心靶點信息

圖2 PPI可視化結果

2.4 “藥物-成分-靶點”網絡構建將交集靶點與有效化學成分導入Cytoscape3.9.1軟件構建“藥物-成分-靶點”網絡,該網絡共217個節點,594條邊,其中紫色三角形節點代表藥物,黃色圓形節點代表靶點,綠色菱形節點代表活性成分,度值越大者節點越大,見圖3。

圖3 “藥物-成分-靶點”網絡

借助R語言進行生物過程(biological process,BP)、細胞組成(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)分析,制作結果排名前10位的柱狀圖和氣泡圖。生物過程主要涉及上皮細胞增殖、腺體發育、對脂多糖的反應、對細菌起源的分子的反應、對活性氧的反應、肌肉細胞增殖、對氧化應激的反應、傷口愈合、對MAPK信號通路的正調控等;細胞組成主要包括膜筏、膜微區、含有膠原蛋白的細胞外基質、囊泡腔、細胞外顆粒腔、血小板α顆粒管腔、黏著斑等;分子功能主要涉及信號受體激動劑、受體配體活性、細胞因子及其受體活性、內肽酶活性、絲氨酸型肽酶活性、生長因子受體結合等,見圖4。

注:A:柱狀圖;B:氣泡圖。X軸表示計數或者基因比例的顯著增加;Y軸代表GO功能富集分析中的“生物學過程”“細胞組分”和“分子功能”。

2.5 KEGG通路富集分析KEGG通路富集分析結果顯示,交集基因主要涉及糖尿病中的AGE-RAGE信號通路、流體剪切力和動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、TNF信號通路、癌癥中的蛋白聚糖、前列腺癌、松弛素信號通路、膀胱癌、恰加斯病、人巨細胞病毒感染、胰腺癌、乙型肝炎、結直腸癌、類風濕性關節炎、內分泌抵抗、MAPK信號通路、Toll樣信號通路、丙型肝炎、百日咳、甲型流感、肺結核、FoxO信號通路、HIF-1信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性、C型凝集素受體信號傳導途徑通路等,見圖5。

注:A:柱狀圖;B:氣泡圖。X軸表示計數或者基因比例的顯著增加;Y軸表示主要的信號通路。

2.6 分子對接Autodock Vina軟件對化學成分和PPI篩選出的核心靶點STAT3(PBD ID:6NUQ),JUN(PBD ID:1S9K),MAPK14(PBD ID:5LAR),MAPK1(PBD ID:2Y9Q),AKT1(PBD ID:4EKL),CTNNB1(PBD ID:1QZ7),FOS(PBD ID:1A02),IL-10(PBD ID:1ILK),IL-6(PBD ID:4CNI),TNF(PBD ID:2AZ5)進行分子對接,結合能≤5 kcal·mol-1即表明活性成分與靶點有較強的結合活性(圖6)。Pymol和Discovery Studio軟件將對接結果進行可視化,活性成分與作用靶點之間主要是通過氫鍵、π-π作用等分子作用力形成較強結合力,見圖7。

圖6 分子對接結合能熱圖

注:A:AKT1-二氫血根堿(Dihydrosanguinarine);B:TNF-荷包牡丹堿(Bicuculline);C:MAPK14-二氫血根堿(Dihydrosanguinarine);D:IL-6-西加小冠花苷(Hyrcanoside)。

2.7 各組大鼠髓核組織p-c-JUN/c-JUN、p-c-FOS/c-FOS、p-JNK/JNK、p-p38-MAPK/p38-MAPK水平比較與假手術組比較,模型組大鼠髓核組織p-c-JUN/c-JUN、p-c-FOS/c-FOS、p-JNK/JNK、p-p38-MAPK/p38-MAPK水平均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,脊痛消膠囊低劑量組和高劑量組、塞來昔布組髓核組織p-c-JUN/c-JUN、p-c-FOS/c-FOS、p-JNK/JNK、p-p38-MAPK/p38-MAPK水平均顯著降低(P<0.05),見表2、圖8。

表2 各組大鼠髓核組織p-c-JUN/c-JUN、p-c-FOS/c-FOS、p-JNK/JNK、p-p38-MAPK/p38-MAPK水平

注:A:假手術組;B:模型組;C:脊痛消膠囊低劑量組;D:脊痛消膠囊低劑量組;E:塞來昔布組。

2.8 各組大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平比較與假手術組比較,模型組血清IL-6和 TNF-α 水平顯著升高(P<0.05),IL-10水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,脊痛消膠囊低劑量組和高劑量組、塞來昔布組血清IL-6和TNF-α水平顯著降低(P<0.05),IL-10水平顯著升高(P<0.05),見表3。

表3 各組大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平

3 討論

LDH是引起老年人腰腿痛的常見原因,且該病的發生逐漸年輕化。肥胖[9]、吸煙[10]和缺乏運動[11]等不良生活習慣均會增加LDH的發生率。疼痛是LDH最主要的癥狀。LDH疼痛產生的機制主要有機械壓迫機制、炎癥化學刺激機制、自身免疫反應機制等[12]。本研究基于網絡藥理學分析脊痛消膠囊治療LDH的作用機制,對脊痛消膠囊和LDH映射得到的分子生物學網絡進行蛋白質相互作用分析發現,重要性最大的前10個靶標是STAT3、JUN、IL-6、MAPK1、FOS、CTNNB1、MAPK14、AKT1、IL-10 和TNF。進一步分析發現,分子生物學網絡涉及的信號通路主要有AGE-RAGE信號通路、IL-17 信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路和Toll樣信號通路等。STAT3是STAT家族之一,由770個氨基酸組成,收到激活因子如干擾素、IL-6 和IL-10后,通過Janus酪氨酸激酶和MAPKs通路二聚化并從細胞質轉移到細胞核發揮調節細胞生長、凋亡和免疫應答等生物學過程[13]。研究發現,LDH會增加背根神經節神經元的興奮性,上調RAGE和p-STAT3蛋白的表達[14],提示RAGE/STAT3信號通路的激活是LDH引發疼痛的重要機制。p38-MAPK和JNK屬于MAPK信號通路的分支[15]。JNK通路是在受到感染、炎癥和氧化應激等刺激后被激活的,隨后磷酸化其底物JUN、FOS、ATF2和p53等,磷酸化的JUN和FOS結合形成轉錄因子活化蛋白1(activator protein-1,AP-1)從而調節細胞增殖、分化以及凋亡等[16]。在LDH大鼠模型中觀察到p-JNK/JNK的比例顯著升高[17],通過抑制JNK信號通路的激活可以顯著改善LDH模型的神經根性疼痛癥狀[18]。p38-MAPK家族有4種同型:p38α(MAPK14)、p38β(MAPK11)、p38γ(MAPK 12)和p38δ(MAPK13),在過氧化氫誘導的人軟骨終板細胞氧化應激損傷模型中,p38-MAPK信號通路被激活,p-p38-MAPK/p38-MAPK比例顯著升高,提示p38-MAPK通路在腰椎間盤退變中的重要作用[19]。本研究的動物實驗部分發現,在LDH模型大鼠中p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos、p-p38-MAPK/p38-MAPK的比例顯著升高,與現有研究結果一致。

炎癥反應是引發LDH疼痛的重要因素。IL是一類由白細胞產生并調節機體免疫反應的細胞因子家族,IL-6是一種炎癥介質,來源于多種免疫細胞,如巨噬細胞、樹突狀細胞和成纖維細胞等,在炎癥反應中,IL-6可以誘導其他炎癥介質的產生,如IL-1和TNF-α,促進白細胞的增殖、活化,促進成纖維細胞增殖從而實現組織的修復。有研究發現,IL-6水平與患者疼痛程度呈正相關[20]。另有研究發現,較高的血清IL-6水平與患者的恢復不佳相關[21]。TNF是一種Ⅱ型跨膜蛋白,作為三聚體在質膜上表達,被TNF-α轉化酶切割產生可溶性配體,通過與TNF受體1和TNF受體2結合傳導信號,TNF受體1可以激活NF-κB和MAPK信號通路從而介導細胞死亡,在TNF信號通路傳導中起主要作用[22]。TNF-α可以誘導髓核細胞中炎癥因子IL-1β、IL-4、IL-6的產生,NF-κB和MAPK信號通路的激活,抑制該通路的激活可以使LDH模型大鼠得到保護[23]。作為一種抗炎因子,IL-10的保護作用得到了廣泛研究。自體髓核突出誘導的LDH大鼠模型中,背根神經節中的IL-10水平顯著下降,TNF-α水平顯著升高,髓鞘內人工注射 IL-10 可以顯著減輕模型大鼠的疼痛,且該效應能被TNF-α抑制,體現了兩者的相互拮抗作用[24]。本研究中,脊痛消膠囊能顯著降低LDH大鼠血清 IL-6 和TNF-α水平,提高IL-10的水平,說明脊痛消膠囊可以抑制炎癥反應,提高LDH的抗炎能力。

LDH屬中醫“腰痹”“痹證”范圍,根本病機為本虛標實,腎虛和風寒濕熱為主要致病因素。《素問·脈要精微論》云:“腰者,腎之府,轉搖不能,腎將憊矣。”腎主骨,生髓,腎虛髓海空虛,腰部的骨骼經脈得不到濡養,導致腰部疼痛,活動受限。《素問·痹論》記載:“風寒濕三氣雜至,合而為痹也。其風氣勝者為行痹,寒氣勝者為痛痹,濕氣勝者為著痹也。”LDH通常兼見“行”“痛”“著”的特點:LDH患者常常伴有下肢放射性疼痛麻木,此為“行”;在寒冷季節容易發作且疼痛劇烈,此為“痛”;發病部位較為固定,影像學研究發現,腰椎間盤突出的好發部位為L4/L5、L5/S1,占90%以上,此為“著”。《素問·痿論》曰:“宗筋者,主束骨而利機關也。”中醫認為,LDH是由于“筋出槽,骨錯縫”,經絡相當于現代解剖學的肌腱、韌帶和筋膜等組織。LDG常常伴隨棘上韌帶、棘間韌帶和前后縱韌帶等軟組織的損傷,從而進一步引起椎體與椎體之間的穩定性下降,加重椎間盤的退變[25]。肝主血,在體合筋,肝血不足,血不養筋,筋脈失養,筋骨不堅,故見腰痛、膝軟、脛酸、足跟痛,甚至腰脊不舉、足不任身等癥。LDH的常見證型可分為血瘀證、寒濕證、濕熱證和肝腎虧虛證,而LDH常常是由于勞累和外傷導致氣滯血瘀,經脈閉阻,不通則痛而發病,故臨床以血瘀證最為多見。《血論證》云:“水病則累血,血瘀則累氣。”瘀血內阻,氣失宣降可導致水液停聚,瘀血與水濕相互為患,LDH導致神經根受到機械壓迫壓,神經根的血供障礙和水腫被認為是LDH疼痛重要機制[12]。脊痛消膠囊由白芍、車前子、川芎、澤蘭、當歸、杜仲、莪術、防己、黃芪、三棱、延胡索、澤瀉、五靈脂和地龍等14味藥組成,其中車前子、澤蘭和澤瀉清熱利尿消腫,川芎和延胡索緩急止痛,三棱和地龍活血化瘀,白芍和當歸養血舒筋,黃芪補氣升陽以助行水,全方相輔相成,相得益彰,共奏益氣、活血、行水之功效[4]。

綜上所述,脊痛消膠囊通過抑制炎癥反應和JNK/MAPK信號通路的激活從而發揮治療LDH的效應,網絡藥理學分析和實驗驗證結果佐證了這一結論,為脊痛消膠囊的臨床運用提供了一定的參考依據,也為脊痛消膠囊現代藥理學的深入研究夯實了基礎。