基于SCF/C-kit 信號通路探討黃連解毒湯對腦出血急性期模型大鼠胃損傷的影響

王春燕 蘭雅文 唐 明 高召凱 張 增 劉歡歡 孔曉璇李雯雯 潘岳峰 安朋朋

（1.山東中醫藥大學第一臨床醫學院，山東濟南 250013；2.青島市中醫醫院，山東青島 266033；3.青島大學第一臨床醫學院，山東青島 266071）

腦出血可歸屬于中醫學“出血性中風”范疇[1]，是一種后果嚴重的腦卒中亞型，具有發病急、病情變化快及高致死率和致殘率的特點，約占所有高死亡率腦卒中的23.4%[2]。據統計，胃損傷是腦出血后較常見的并發癥，發生率為1%~5%[3]。腦出血后全身血管收縮，胃部血流減少，胃部細菌屏障減弱，表現為脘腹脹滿、餐后腹脹、早飽、噯氣、惡心和嘔吐、腹瀉以及便秘，嚴重時可出現嘔血、便血等癥狀。研究表明，腦出血急性期胃損傷的發生甚至加重，嚴重影響了腦出血的預后[4]。

對急性胃損傷病因的研究發現，Cajal間質細胞（interstitial cells of Cajal，ICC）可能對胃部正常收縮具有重要影響。ICC是分布在胃部平滑肌細胞與神經細胞之間的一類間質細胞，其表面可以表達酪氨酸激酶受體（C-kit），而作為C-kit受體自然配體的干細胞因子（SCF），與C-kit相結合可以激活SCF/C-kit信號通路，且該通路與ICC的發育有重要關聯。當SCF或C-kit發生突變或其信號通路受損，會影響ICC發育、分化，使ICC數目減少。

風火痰瘀虛毒是中風的致病因素，自王永炎院士提出“毒損腦絡”的理論后，營衛失和、毒損腦絡已成為出血性中風的重要病機，清熱解毒法治療出血性中風已越來越被臨床所重視。課題組前期研究發現，大鼠腦出血急性期可引發胃黏膜損傷，其機制可能與胃ICC的結構變化和數目減少有關，而黃連解毒湯可通過調節大鼠胃動素（MTL）及血管活性腸肽（VIP）來改善胃的敏感性及胃的運動功能紊亂，從而保護胃黏膜[5-6]。基于前期研究，本研究將從SCF/C-kit信號通路著手，制作腦出血急性期大鼠模型，造模成功后即給予黃連解毒湯，觀察給藥后24 h、4 d、7 d三個時間點大鼠胃損傷及胃組織SCF、C-kit mRNA及蛋白相對表達量變化情況。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康SD雄性10周齡大鼠120只，體質量（200±20）g，由山東大學動物實驗中心提供，合格證號：0009256。本實驗經青島市中醫醫院倫理委員會審批通過（倫理審批號：2018HC11LQ019）

1.2 實驗藥物 黃連解毒湯藥物組成：黃連9 g，黃芩6 g，黃柏6 g，梔子9 g。使用華潤三九醫藥股份有限公司生產的同批次顆粒劑，6 g生藥可換算0.5 g顆粒劑，使用時用蒸餾水配制為27 mg/mL懸濁液。枸櫞酸莫沙必利片，5 mg/片，國藥準字H19990317，山東臨沂魯南貝特制藥有限公司生產，使用時用蒸餾水配制為0.09 mg/mL懸濁液。

1.3 主要試劑 無水乙醇（批號：10009218）、二甲苯（批號：X112051），國藥集團化學試劑有限公司；曙紅Y（醇溶，批號：A600190），生工生物工程（上海）股份有限公司；蘇木精（批號：H8070），北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：WLA004）、SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒（批號：WLA013）、Western洗滌液（批號WLA025）、ECL發光液（批號：WLA003），沈陽萬類生物科技有限公司。

1.4 主要儀器 RM2235石蠟切片機（德國Leica公司），QH01-9030A電熱恒溫鼓風干燥箱（中國上海精宏公司），BX53顯微鏡（日本OLYMPUS公司），DP73顯微鏡拍照系統（日本OLYMPUS公司），NW10LVF超純水系統（香港Heal Force公司），H-2050R超速冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司），Exicycler 96熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（韓國BIONEER公司），DYY-7C電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 造模 取若干大鼠，適應性飼養3 d，常規消毒麻醉，呈仰臥位固定于立體定向儀，消毒備皮，縱行切口，暴露并分離股動脈，取股動脈血50 μL。根據大腦立體定位圖譜調整大鼠體位，使前囟和后囟基本在同一平面上；于頭部正中行縱行切口，于前囟前0.2 mm，中線左旁3 mm處，用鉆頭鉆孔，骨孔大小約1 mm；緩慢注入自體血15 μL（注射速度約10 μL/min），靜置7 min，以同樣速率繼續注入自體血35 μL；留針20 min，緩慢退針，骨蠟封閉顱骨孔，縫合皮膚。術后采用動物行為學（Longa神經功能缺損）評分評價模型大鼠神經功能，評分為1～3分說明造模成功[7]。取24只大鼠行假手術，僅進針不注入。

2.2 分組 將造模成功的大鼠采用隨機數字表法隨機分為模型組、黃連解毒湯組、莫沙必利組，每組24只，行假手術的24只為假手術組，另取24只正常大鼠作為正常組。

2.3 給藥 參照徐叔云教授的《藥理實驗方法學》[8]進行人與動物等效劑量換算大鼠給藥劑量，本研究黃連解毒湯、枸櫞酸莫沙必利用量均根據人正常使用劑量換算動物等效劑量，且因本研究所用大鼠體質量基本一致，故使用固定給藥劑量。確認造模成功后，黃連解毒湯組大鼠每日給予黃連解毒湯54 mg/d灌胃（每次灌胃給予1 mL濃度為27 mg/mL的黃連解毒湯顆粒劑懸濁液，每日2次），莫沙必利組大鼠每日給予枸櫞酸莫沙必利0.27 mg/d灌胃（每次灌胃給予1 mL濃度為0.09 mg/mL的枸櫞酸莫沙必利懸濁液，每日3次），正常組、假手術組和模型組均給予生理鹽水灌胃（每次1 mL，每日2次）。各組均連續灌胃7 d。

2.4 取材 各組分別于給藥24 h、4 d、7 d后，隨機各取8只大鼠，脫頸法處死，規定時間內切除全胃，沿胃大彎側剪開，流水清洗胃內容物，肉眼觀察胃的大體觀、有無出血點及潰瘍。隨即取各組大鼠胃自賁門至幽門寬約0.5 cm的條形組織，放入10%甲醛溶液中固定24 h，蒸餾水沖洗24 h，脫水、透明、浸蠟、包埋，制成3 μm切片，置于烤片機內烤30 min后，備用于蘇木精-伊紅（HE）染色使用。取各組大鼠胃竇距幽門0.5 cm的條形組織收集于凍存管中，液氮速凍后，保存于-80 ℃冰箱中，備用于實時熒光定量PCR（quantitative Real-Time PCR，RT-PCR）法、蛋白免疫印跡（Western blot）法的檢測。

2.5 觀察指標

2.5.1 HE染色法觀察大鼠胃組織病理形態 取各組各觀察時點大鼠胃組織樣本，包埋切片，將展開的切片移到載玻片上，于60 ℃溫箱中放置2 h，烘干，常規脫蠟至水，蘇木素染色5 min，鹽酸酒精分化，自來水返藍，伊紅染色3 min，依次浸入75%、85%、95%的乙醇中脫水各2 min，用二甲苯及無水乙醇透明，滴加中性樹膠封片，晾干。通過光鏡觀察胃黏膜的組織形態及病理變化。

2.5.2 胃黏膜損傷病理評分 按照文獻[9]中的標準對各組各觀察時點大鼠胃黏膜損傷程度進行評分。

2.5.3 RT-PCR法檢測大鼠胃組織SCF、C-kit mRNA表達 取各組各觀察時點大鼠胃組織樣本，加入1 mL TRIpure裂解液，混勻后室溫靜置5 min；再加入200 μL氯仿，靜置3 min；4 ℃、10 000×g離心10 min，將得到的水相轉移到新的離心管中；加入等體積異丙醇，置于-20 ℃條件下過夜；15 h后再次離心，棄上清；加入1 mL 75%乙醇，4 ℃、3400×g離心3 min，棄上清；室溫靜置5～6 min使殘余乙醇揮發；加30 μL RNase-free ddH2O室溫靜置2 min，提取總RNA，檢測RNA的濃度，進行反轉錄，得到對應的cDNA，置于-20 ℃保存，進行熒光定量分析。本實驗使用2-△△Ct方法分析樣本mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 各引物序列

2.5.4 Western blot法檢測大鼠胃組織SCF、C-kit蛋白表達 取各組各觀察時點大鼠胃組織樣本，加入相應裂解液，使用低溫冷凍離心機，4 ℃、離心半徑12 cm、12 000 r/min，離心10 min，分離上清得到蛋白質抽提物，配置BCA工作液，酶標儀測定蛋白濃度，制備蛋白上樣液，后行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫搖床封閉2 h，加入TRPV1 一抗（稀釋度為1∶500），4 ℃孵育過夜。次日，用Western洗滌液（TBST）對樣本進行洗膜10 min×3 次，用山羊抗兔的二抗（稀釋度為1∶2000）室溫孵育2 h，再次用TBST洗膜10 min×3 次，最 后 用ECL發光液使其發光、顯影。使用Quantity One軟件對樣本數據進行灰度等相關分析，在進行目的蛋白的相對含量測定時，使用同一目的蛋白與內參照的灰度比值來表示其相對表達量。

2.6 統計學方法 采用SPSS 27.0 軟件對數據進行統計學分析。本研究所有計量資料均符合正態分布、方差齊性，用均值±標準差（）表示，2 組數據比較用兩獨立樣本t檢驗，多組數據比較用單因素方差分析LSD檢驗。以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠胃組織病理形態比較 正常組及假手術組大鼠胃組織均未見明顯炎性細胞浸潤及水腫，黏膜層、黏膜下層、肌層、漿膜層均正常。假手術組大鼠偶可見黏膜下層、黏膜層充血。模型組大鼠胃組織可見大量的炎性細胞浸潤，黏膜血管可見顯著充血、出血、水腫，大量紅細胞聚集，上皮細胞大面積脫落，腺體結構被破壞，層次紊亂，細胞組織間隙增大，多處缺損，出現潰瘍性病變。黃連解毒湯組、莫沙必利組大鼠胃黏膜層炎性細胞數目較模型組明顯減少，偶見血管擴張，黏膜水腫不明顯，黏膜層連續完整，胃腺排列、腺管構造均正常，未見黏膜潰瘍。見圖1、圖2、圖3。

圖1 各組大鼠給藥24 h胃組織病理形態（HE染色，×200）

圖2 各組大鼠給藥4 d胃組織病理形態（HE染色，×200）

圖3 各組大鼠給藥7 d胃組織病理形態（HE染色，×200）

3.2 各組各觀察時點大鼠胃黏膜損傷病理評分比較 模型組大鼠各觀察時點胃黏膜損傷病理評分均明顯高于同期正常組、假手術組（P＜0.01），其中給藥4 d時評分明顯高于給藥24 h時（P＜0.01），給藥7 d時評分明顯低于給藥4 d時（P＜0.01）。各給藥組各觀察時點胃黏膜損傷病理評分均明顯低于同期模型組（P＜0.01），給藥4 d時評分均明顯高于同組給藥24 h時（P＜0.01），給藥7 d時評分均明顯低于同組給藥24 h、4 d時（P＜0.05，P＜0.01）；黃連解毒湯組大鼠各觀察時點胃黏膜病理評分均明顯低于同期莫沙必利組（P＜0.01）。見表2。

表2 各組各觀察時點大鼠胃黏膜損傷病理評分比較（） 單位：分

表2 各組各觀察時點大鼠胃黏膜損傷病理評分比較（） 單位：分

注： 與同期正常組比較，**P＜0.01；與同期假手術組比較，##P＜0.01；與同期模型組比較，△△P＜0.01；與同期莫沙必利組比較，★★P＜0.01；與本組給藥24 h比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與本組給藥4 d比較，◆◆P＜0.01。

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3.3 各組各觀察時點大鼠胃組織SCF、C-kit mRNA表達比較 模型組大鼠各觀察時點胃組織SCF、C-kit mRNA表達均明顯低于同期正常組、假手術組（P＜0.01），其中給藥4 d時上述指標表達明顯低于給藥24 h時（P＜0.01），給藥7 d時上述指標表達明顯高于給藥4 d時（P＜0.01）。各給藥組大鼠各觀察時點上述指標表達均明顯高于模型組（P＜0.01）；各給藥組組內比較，給藥4 d時各指標表達最低（P＜0.01），而給藥7 d時各指標表達最高（P＜0.01）。黃連解毒湯組大鼠各觀察時點上述指標表達均明顯高于莫沙必利組（P＜0.01）。見表3。

表3 各組各觀察時點大鼠胃組織SCF、C-kit mRNA相對表達量比較（）

表3 各組各觀察時點大鼠胃組織SCF、C-kit mRNA相對表達量比較（）

注： 與同期正常組比較，**P＜0.01；與同期假手術組比較，##P＜0.01；與同期模型組比較，△△P＜0.01；與同期莫沙必利組比較，★★P＜0.01；與本組給藥24 h比較，▲▲P＜0.01；與本組給藥4 d比較，◆◆P＜0.01。

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3.4 各組各觀察時點大鼠胃組織SCF、C-kit蛋白表達比較 模型組大鼠各觀察時點胃組織SCF、C-kit蛋白表達均明顯低于同期正常組、假手術組（P＜0.01），其中給藥4 d時上述指標表達明顯低于給藥24 h時（P＜0.01），給藥7 d時上述指標表達明顯高于給藥4 d時（P＜0.01）。各給藥組大鼠各觀察時點上述指標表達均明顯高于模型組（P＜0.01）；各給藥組組內比較，給藥4 d時各指標表達最低（P＜0.01），而給藥7 d時各指標表達最高（P＜0.05，P＜0.01）。黃連解毒湯組大鼠各觀察時點上述指標表達均明顯高于莫沙必利組（P＜0.01）。見表4、圖4、圖5、圖6。

圖4 各組大鼠給藥24 h SCF、C-kit蛋白電泳圖

圖5 各組大鼠給藥4 d SCF、C-kit蛋白電泳圖

圖6 各組大鼠給藥7 d SCF、C-kit蛋白電泳圖

表4 各組各觀察時點大鼠胃組織SCF、C-Kit蛋白相對表達量比較（）

表4 各組各觀察時點大鼠胃組織SCF、C-Kit蛋白相對表達量比較（）

注： 與同期正常組比較，**P＜0.01；與同期假手術組比較，##P＜0.01；與同期模型組比較，△△P＜0.01；與同期莫沙必利組比較，★★P＜0.01；與本組給藥24 h比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與本組給藥4 d比較，◆◆P＜0.01。

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4 討論

中醫認為出血性中風病因病機復雜，營衛失和、毒損腦絡是其重要病機。余學杰等[10]認為火毒貫穿于中風急性期，火熱毒邪猛烈，容易加重臟腑的損害，因此以清熱解毒為本病的治療原則已逐步被臨床認可。黃連解毒湯作為清熱解毒的代表方，始載于晉代葛洪所著的《肘后備急方》，后在王燾的《外臺秘要》中被命名為黃連解毒湯，主治三焦熱盛及各種實熱火毒之證。方中以大苦大寒之黃連為君，瀉中焦火熱；輔以黃芩瀉上焦火熱，黃柏瀉下焦火熱，梔子通瀉三焦火熱從膀胱而出，使三焦熱邪得清。諸藥合用，共奏清熱解毒之功。有研究表明，黃連解毒湯對腦出血急性期或者胃黏膜損傷的患者均有一定的治療效果。如王革生等[11]研究表明，中風發生后，急性腦出血的患者發生了嚴重的炎性反應，而以黃連解毒湯為代表的清熱解毒法對急性腦出血的火毒證具有明顯的臨床改善作用。又如張建平[12]運用黃連解毒湯治療急性腦血管病患者50例，其中49例患者未發生急性腦血管病常見的應激性潰瘍，從而猜想黃連解毒湯有保護胃黏膜的作用。

現代研究表明，ICC是消化道縱行肌和環形肌之間的一種特殊細胞，可產生并且傳播慢波，控制胃平滑肌的運動；C-kit是ICC的特異性標志物，每1個C-kit單體與1個SCF分子結合，SCF二聚化會觸發C-kit單體的結構改變，導致細胞內酪氨酸自動磷酸化，而SCF作用的發揮依賴于特定的受體與C-kit形成配基受體二聚體復合物，啟動SCF/C-kit信號通路，對ICC的發育、分化及表型維持至關重要[13]。正常情況下，中樞神經系統、胃神經系統及胃激素對胃部肌層組織起控制、調節作用。腦出血急性期患者處于應激狀態下，中樞神經系統、胃神經系統被激活，C-kit及SCF表達發生異常，SCF/C-kit信號通路改變，導致胃Cajal間質細胞的數目減少，結構發生變化，胃電信號傳遞受阻，胃調節功能紊亂，胃黏膜受損，引起胃功能障礙[14]。因此，SCF/C-kit信號通路可能是腦出血急性期胃損傷發生的關鍵因素。

本研究結果顯示，模型組大鼠的胃黏膜損傷病理評分明顯高于正常組及假手術組，且不同觀察時點評分差異較大，由此可以猜想在急性腦出血發生后24 h胃黏膜損傷就已經出現，并且呈進行性加重，在第4日時達到高峰，到第7日胃黏膜損傷程度減輕，這與臨床上腦出血急性期出現顱內血腫的高峰的時間一致[15-16]。黃連解毒湯組及莫沙必利組大鼠給藥24 h、4 d、7 d時胃黏膜病理損傷評分均明顯低于模型組，且在給藥7 d時，2組評分均明顯低于本組給藥4 d時，提示黃連解毒湯與枸櫞酸莫沙必利對腦出血急性期模型大鼠的胃黏膜均能起到一定的保護作用。模型組大鼠胃組織SCF、C-kit mRNA及蛋白表達均明顯低于正常組、假手術組，說明腦出血急性期繼發胃損傷可能是由于在應激狀態下胃組織SCF、C-kit表達下降，SCF/C-kit信號通路發生異常改變所致。黃連解毒湯組及莫沙必利組大鼠各觀察時點SCF、C-kit mRNA及蛋白表達均明顯高于模型組，其中黃連解毒湯組上述指標表達均明顯高于莫沙必利組，說明黃連解毒湯及枸櫞酸莫沙必利均可通過增加胃組織SCF、C-kit mRNA及蛋白的表達量，啟動SCF/C-kit信號通路，促進ICC的分化和發育，進一步調節胃神經信號的傳遞，從而保護胃黏膜，減輕胃損傷，且黃連解毒湯效果更佳。本研究也發現，黃連解毒湯、枸櫞酸莫沙必利連續給藥7 d時，大鼠胃黏膜病理評分降至最低水平，胃組織SCF、C-kit mRNA及蛋白表達水平達到最高，但仍低于假手術組及正常組，說明藥物雖然可以通過上調SCF/C-kit信號通路，改善胃損傷，但在7 d內仍無法恢復至正常水平。

綜上所述，黃連解毒湯對腦出血急性期繼發胃損傷有明確的治療作用，其可能的作用機制為調控SCF/C-kit信號通路，增加SCF、C-kit mRNA及蛋白的表達。但由于本研究為動物實驗，樣本較少，觀察時間較短，下一步課題組擬加大動物實驗樣本量，酌情增加療程，動態觀察黃連解毒湯不同劑量對腦出血急性期繼發胃損傷大鼠SCF/C-kit信號通路調控的差異性，同時課題組也擬進一步實施臨床研究，觀察不同劑量黃連解毒湯對腦出血急性期繼發胃損傷患者的臨床療效。