自噬相關基因FpAtg3參與假禾谷鐮孢的生長和致病

董在芳，丁騰騰，單藝軒，李洪連，陳琳琳，邢小萍

河南農業大學植物保護學院/小麥玉米作物學國家重點實驗室，鄭州 450002

0 引言

【 研究意義】 假禾谷鐮孢（Fusarium pseudograminearum）引起的小麥莖基腐病在世界范圍內廣泛發生，對全球糧食生產安全造成嚴重威脅[1-2]。在中國，該病作為一種新發病害，蔓延迅速，逐年加重，目前在黃淮麥區、西北麥區及長江中下游麥區均有發生，病害導致小麥年平均減產9%—35%，發生較重區域小麥減產可達70%以上[3-5]。2022 年中國科協將“小麥莖基腐病近年為什么會在我國小麥主產區暴發成災，如何進行科學有效地防控？”列為10 個產業技術問題之一[6]，說明解決小麥莖基腐病在小麥生產中的發生危害已迫在眉睫。對假禾谷鐮孢致病分子機制認識不足制約了小麥莖基腐病防控策略的制定，因此解析假禾谷鐮孢致病機制對小麥莖基腐病的科學防控具有實踐意義。【前人研究進展】自噬是生物體非常保守的一種降解途徑，蛋白、質膜和細胞器等有機物質包裹在雙層膜的自噬體中，與溶酶體或內質網融合后降解，并為新大分子合成提供原料和能量，進而維持細胞代謝平衡和度過不良環境[7-8]。細胞自噬由一系列保守的自噬相關蛋白（autophagy-related protein，Atg）調控發生。以模式植物病原真菌稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）為例，當真菌暴露在逆境環境（營養匱乏和氧化脅迫等）或雷帕霉素處理后，Atg13去磷酸化，與 Atg17 結合，激活 Atg1，并形成Atg1-Atg13-Atg17 復合體調控自噬的起始。PI3K 激酶復合體（包括Atg6、Atg14、Vps34 和Vps15）誘導細胞自噬的合成以及下游Atg 的招募[9-11]。Atg8-磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）泛素系統和Atg12-Atg5-Atg16 泛素系統在自噬體形成和擴張中起關鍵作用，泛素活化酶（E1）Atg7 和泛素結合酶（E2）Atg3 參與調控Atg8-PE 共軛的形成[12-13]。自噬與植物病原真菌的生長、發育、侵染及對脅迫環境的響應密切相關[14-15]。在稻瘟病菌中，MoAtg8、MoAtg9和MoVast1等自噬相關基因在附著胞的形成中起關鍵作用，進而影響病原菌的致病性[16-19]。利用遺傳轉化方法對禾谷鐮孢（Fusariumgraminearum）的28 個Atg分別進行敲除，發現?Fgatg1和?Fgatg3等18 個Atg突變體的菌絲生長減慢，?Fgatg1和?Fgatg5等11 個突變體的孢子產生具有明顯缺陷，除?Fgatg17，其他所有突變體引起小麥赤霉病的能力明顯減弱[20]。【本研究切入點】前期在假禾谷鐮孢中鑒定到29 個保守的Atg，轉錄組數據分析發現多個基因在侵染階段誘導表達[21]，但自噬在假禾谷鐮孢中的功能尚不明確。近期研究發現假禾谷鐮孢菌絲融合關鍵調控因子FpHam-2和FpHam-3 與FpAtg3 直接互作，FpHam-2缺失突變體自噬的發生明顯受阻[22]，猜測FpAtg3 可能在自噬調控的菌絲融合中起作用。Atg3 在真核生物中非常保守，且只有一種類型，能與Atg7、Atg8、Atg12 和磷脂膜相互作用，調控自噬體的形成[23-24]。雖然在Atg系列敲除突變體中測定了?Fgatg3在禾谷鐮孢生長、產孢和致病性中的表型[20]，但對植物病原鐮孢菌Atg3的功能缺乏系統的分析。自噬相關基因FpAtg3在假禾谷鐮孢中的功能有待明確。【擬解決的關鍵問題】通過遺傳轉化和生物學表型分析，探討FpAtg3 的功能，為進一步揭示細胞自噬在假禾谷鐮孢致病過程中的作用和調控機制提供參考。

1 材料與方法

試驗于2022 年5 月至2023 年9 月在河南農業大學植物保護學院糧食作物病蟲害監測與防控創新實驗室完成。

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 假禾谷鐮孢野生型菌株Wz2-8 由河南農業大學植物保護學院糧食作物病蟲害監測與防控創新團隊分離并保存[4]。

1.1.2 供試植物 高感假禾谷鐮孢Wz2-8 的小麥品種矮抗58 由國家小麥工程技術研究中心提供種子，并由河南農業大學植物保護學院糧食作物病蟲害監測與防控創新團隊擴繁、留種，啤酒大麥種子購于河北興農富民種子銷售有限公司。

1.2 方法

1.2.1 真菌Atg3 同源蛋白進化樹的構建 在NCBI網站下載真菌釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、構巢曲霉（Aspergillusnidulans）、粗糙脈孢菌（Neurosporacrassa）、稻瘟病菌、禾谷鐮孢、尖鐮孢（Fusariumoxysporum）、灰霉菌（Botrytiscinerea）、膠孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）的Atg3氨基酸序列，與假禾谷鐮孢的 FpAtg3，利用MEGA5.05 軟件的鄰接法構建系統發育樹，bootstrap值設置為1 000。

1.2.2FpAtg3基因缺失及回補突變體的獲得 參考趙靜雅等[25]的方法，用Split-PCR 的方法構建FpAtg3基因敲除盒，所用引物列于表1。整個過程包括3 輪PCR 擴增，簡述如下：第1 輪PCR 擴增將獲得目標基因FpAtg3的上游（A1）和下游（A2）約1 000 bp 的DNA 序列，該過程以假禾谷鐮孢Wz2-8 菌絲體的基因組DNA 為模板，分別以F1+R1 和F2+R2 為引物，另外，以包含潮霉素抗性基因的pKOV21 質粒為模板，以HYG/F+HYG/R 為引物經PCR 擴增獲得潮霉素基因（H）。第2 輪PCR 擴增將獲得A1-H-A2 的融合片段，用作第3 輪PCR 的模板，該步驟的PCR 反應體系包括模板（A1∶A2∶H=1∶1∶3 質量比）、10×LA Taq buffer 5 μL、dNTPs 2 μL、LA Taq 0.2 μL、ddH2O補足50 μL，不加任何引物，PCR 反應條件為94 ℃ 5 min 預變性，94 ℃ 30 s 和58 ℃ 30 s，15 個循環，72 ℃3.5 min 再延伸。第3 輪PCR 擴增將獲得A1 和潮霉素上游融合的片段及潮霉素下游與A2 的融合片段，以第2 輪PCR 擴增的產物為模板，分別以F1+HY/R 和YG/F+R1 為引物。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers used in this study

參考WANG 等[26]的方法，利用PEG 介導的假禾谷鐮孢原生質體轉化方法，將A1H1 和H2A2 同時導入假禾谷鐮孢Wz2-8 的原生質體中，并利用含有潮霉素的PDA 平板篩選陽性轉化子。利用PCR 檢測含有潮霉素基因、FpAtg3上游和潮霉素的融合片段、FpAtg3下游和潮霉素的融合片段，同時不含FpAtg3的轉化子為FpAtg3被潮霉素替換的菌株。利用PCR擴增FpAtg3基因全長及其上游約1.5 kb 的啟動子序列，全長2 900 bp，使用諾唯贊一步克隆試劑盒將其構建到pKNTG 載體上。所用引物列于表1。利用PEG介導的原生質體轉化將pKNTG-FpAtg3重組質粒導入FpAtg3缺失突變體（ΔFpAtg3）中，經G418 抗性篩選和PCR 檢測獲得FpAtg3回補（FpAtg3-C）菌株。

1.2.3 菌絲生長和產孢測定 將待測假禾谷鐮孢菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）上活化，用直徑5 mm 的打孔器在菌落邊緣取菌餅，分別轉接到含有15 mL PDA、完全培養基（CM）和基礎培養基（MM）的平板（直徑9 cm）上，25 ℃避光培養3 d，測量菌落直徑、觀察菌落形態并拍照。在無菌試管中倒入3 mL PDA 培養基，將新鮮的假禾谷鐮孢菌絲塊接種到試管中，25 ℃避光培養3 d，觀察氣生菌絲量并拍照。假禾谷鐮孢菌絲塊轉接到PDA 平板上，并在菌餅兩側放置兩個無菌蓋玻片，25 ℃避光培養，當菌絲長至蓋玻片2/3 處時取出蓋玻片，放置在載玻片上，用顯微鏡觀察菌絲形態并拍照。

在250 mL 三角瓶中加入50 mL 無菌的CMC 培養液，放入用打孔器（直徑5 mm）在菌落邊緣取的兩塊菌餅，放置在搖床內，25 ℃、150 r/min 培養5 d。用單層miracloth 濾布過濾并收集分生孢子，顯微鏡觀察分生孢子的形態及分隔數，血球計數板計數并計算孢子濃度。試驗至少重復3 次，每次試驗每組樣品設置3 個技術重復。

1.2.4 菌絲融合率和孢子融合芽管率測定 無菌的載玻片蘸取融化好的PDA 培養基，將菌絲塊接種在載玻片上，放置在培養皿中保濕。約培養24 h，至菌絲在載玻片上蔓延，在顯微鏡下觀察菌絲形態及菌絲融合。每組數20 根菌絲，記錄發生融合的菌絲數，每菌株數5 組，試驗重復3 次。

參照VANGALIS 等[27]的方法計算孢子融合芽管調控的融合率。在直徑6 cm 的培養皿底部放蓋玻片，倒入5 mL 皮氏培養基，凝固成平板。收集的分生孢子調節濃度至106個孢子/mL，隨后轉移到皮氏培養基平板上，25 ℃、黑暗培養12 h。在顯微鏡下觀察孢子融合芽管，每組數50 個融合芽管，每菌株數5 組，試驗重復3 次。

1.2.5 致病力測定 小麥胚芽鞘接種：矮抗58 小麥種子在保濕的培養皿中，25 ℃避光培養2 d，隨后將催芽后的小麥轉移到帶土培養缽中，在溫室環境下（25℃、16 h 光照∶8 h 黑暗）生長3 d，將小麥苗拔出、備用。用直徑5 mm 的打孔器取活化的待測假禾谷鐮孢的菌絲塊，接種到小麥胚芽鞘中間部位，25 ℃、避光、保濕培養24 h，去掉菌餅并將接種的小麥轉移到溫室條件下繼續培養2 d，觀察小麥發病、測量病斑長度并拍照。

大麥葉片接種：啤酒大麥在25 ℃、黑暗條件下催芽2 d，隨后種在帶土的培養砵中，溫室環境下培養4 d，取葉片備用。用直徑5 mm 的打孔器取活化的待測假禾谷鐮孢的菌絲塊，每個葉片接兩個菌餅，25 ℃、避光、保濕培養24 h 后，去掉菌餅，并將接種的大麥葉片轉移到溫室條件下繼續培養2 d，測量病斑長度并拍照。試驗至少重復3 次，每次試驗每組樣品設置5個重復。

盆栽試驗：將100 g 小米在沸水中煮90 s，撈出、晾干后裝入100 mL 三角瓶中，在滅菌鍋中121 ℃、20 min 滅菌，分別接入3 塊活化的假禾谷鐮孢野生型、ΔFpAtg3和FpAtg3-C 菌株的菌絲塊，25 ℃、避光培養約5 d，期間每隔24 h 手動混勻小米培養基，至菌絲布滿小米粒，取出晾干，與無菌土混合制備質量比為0.5%的菌土，備用。不接菌的小米作為空白對照。在每個培養缽中底部放150 g 無菌土，每缽種6 粒催芽的小麥種子，上面覆50 g 菌土，澆足水后，置于25℃、16 h 光照∶8 h 黑暗條件下培養 9 d，觀察小麥生長、計算小麥莖基腐病病情指數，并拍照，每組處理設置4 個重復。

1.2.6 耐受性測定 將活化的假禾谷鐮孢待測菌株，用直徑5 mm 的打孔器取菌落邊緣菌絲塊，分別轉接到含0.2 g·L-1剛果紅（CR）、0.025% SDS 或10 mmol·L-1H2O2的PDA 平板上，無添加的PDA 平板為空白對照。試驗重復3 次，每次試驗每組樣品設置5 個重復。

1.3 數據處理與分析

采用T 測驗統計分析樣品間的顯著性差異，數據表示為平均值±標準差，Excel 軟件繪制柱形圖。

2 結果

2.1 FpAtg3 系統進化分析

在NCBI 網站上下載釀酒酵母等3 種模式真菌以及禾谷鐮孢等5種常見植物病原真菌的Atg3氨基酸序列，與假禾谷鐮孢FpAtg3 構建系統進化樹。如圖1顯示，Atg3 在絲狀真菌中比較保守，且Atg3 在進化上符合物種進化的方向，比如假禾谷鐮孢FpAtg3 與禾谷鐮孢FgAtg3 親緣關系最近，其次為尖鐮孢和其他絲狀真菌的Atg3，與單細胞真菌釀酒酵母的ScAtg3親緣關系較遠。

圖1 Atg3 蛋白進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Atg3 proteins

2.2 FpAtg3 缺失突變體的獲得

利用潮霉素抗性篩選陽性轉化子，經PCR 檢測獲得 3 株FpAtg3被潮霉素基因置換掉的菌株（ΔFpAtg3），如圖2-A 所示，在其基因組中能檢測到750 bp 的潮霉素抗性基因片段（H）、1 518 bp 的FpAtg3上游-潮霉素融合片段（F）以及1 368 bp 的潮霉素-FpAtg3下游融合片段（R），無FpAtg3，對照野生型菌株的基因組 DNA 中能檢測到 329 bp 的FpAtg3，無潮霉素抗性基因。利用PEG 介導的原生質體轉化將pKNTG-FpAtg3導入ΔFpAtg3-T1 菌株中，利用PCR 可檢測652 bp 的FpAtg3，由此獲得ΔFpAtg3的回補菌株（FpAtg3-C）（圖2-B）。

2.3 FpAtg3 參與假禾谷鐮孢的生長和產孢

將活化的假禾谷鐮孢野生型、ΔFpAtg3和FpAtg3-C 菌株，分別轉接到PDA、CM 和MM 培養基上，25 ℃避光培養3 d。與野生型和FpAtg3-C 菌株相比，ΔFpAtg3在3 種營養培養基上的生長均明顯減慢，色素積累和菌落形態無顯著差異（圖3-A、3-C），ΔFpAtg3在PDA 培養基上的氣生菌絲減少（圖3-B）。顯微觀察發現，在PDA 培養基上生長24 h，ΔFpAtg3與假禾谷鐮孢野生型和FpAtg3-C 菌株的菌絲形態也有明顯差異，ΔFpAtg3的菌絲呈波紋狀卷曲（圖4）。

圖3 假禾谷鐮孢菌絲生長測定Fig. 3 Hyphal growth assays of F. pseudograminearum

圖4 菌絲和孢子形態Fig. 4 Hyphal and conidial morphology

將活化的假禾谷鐮孢野生型、ΔFpAtg3和FpAtg3-C 菌株，轉接到CMC 培養液中誘導分生孢子的產生。結果顯示，與野生型和FpAtg3-C 菌株相比，ΔFpAtg3分生孢子的產量下降了約50%（表2），且分生孢子變短、分隔減少（圖4、表2）。綜上，FpAtg3參與假禾谷鐮孢的菌絲生長，影響菌絲形態、產孢及孢子形態。

表2 假禾谷鐮孢不同菌株的孢子量、隔膜數、菌絲融合率和孢子融合芽管率Table 2 Conidiation, septa per conidium, hyphal fusion rate and CAT-mediated fusion rate of different F. pseudograminearum strains

2.4 FpAtg3 參與假禾谷鐮孢的菌絲融合及孢子融合芽管調控的融合

活化后的假禾谷鐮孢野生型、ΔFpAtg3和FpAtg3-C 菌株在PDA 平板上培養24 h，顯微觀察發現，野生型和FpAtg3-C 菌株的菌絲融合非常普遍，與之相比ΔFpAtg3的菌絲融合率明顯降低。孢子融合芽管是另一種類型的細胞融合，與菌絲融合結果相一致，ΔFpAtg3孢子萌發芽管調控的融合與野生型相比也明顯減少，FpAtg3-C 的孢子融合芽管率可恢復到野生型的水平（表2）。綜上，FpAtg3 參與假禾谷鐮孢菌絲融合及孢子融合芽管調控的細胞融合。

2.5 FpAtg3 的缺失影響假禾谷鐮孢的致病力

假禾谷鐮孢野生型和FpAtg3-C 菌株表現強致病力，在大麥葉片和小麥胚芽鞘上均能侵染并形成明顯擴展的壞死病斑，而ΔFpAtg3在大麥葉片和小麥胚芽鞘上的病斑長度明顯變短（圖5-A、5-B）。

圖5 致病力測定Fig. 5 Pathogenicity determination

利用盆栽試驗進一步驗證接種各菌株在小麥苗期莖基腐病的發生情況。結果顯示，野生型和FpAtg3-C 菌株接種的小麥，植株生長減慢，根莖部變褐壞死（圖6-A、6-B），小麥莖基腐病病情指數達76.2（圖6-C）。在相同條件下，ΔFpAtg3接種的小麥，植株生長較空白對照（CK）略有減慢，小麥莖基腐病發生明顯減輕（圖6-A、6-B），病情指數為14.3（圖6-C）。以上結果說明FpAtg3參與假禾谷鐮孢對大麥葉片、小麥胚芽鞘和小麥根莖部的致病。

圖6 盆栽試驗Fig. 6 Pot-culture experiments

2.6 FpAtg3 的缺失影響假禾谷鐮孢對非生物脅迫的耐受力

植物病原真菌對非生物脅迫的敏感性會影響致病力，因此檢測了假禾谷鐮孢野生型、ΔFpAtg3和FpAtg3-C 菌株對細胞壁、細胞膜和氧化脅迫的耐受性。將活化的各菌株分別轉接至含有0.2 g·L-1剛果紅、0.025% SDS 或10 mmol·L-1H2O2的PDA 平板上，25℃、避光培養3 d。結果顯示，在上述非生物脅迫條件下，所有菌株的生長均受到明顯抑制，與野生型和FpAtg3-C 菌株相比，剛果紅、SDS 和H2O2對ΔFpAtg3菌絲生長的抑制率均明顯提高（圖7-A、7-B）。說明FpAtg3 參與假禾谷鐮孢對細胞壁、細胞膜和氧化脅迫的耐受性。

圖7 假禾谷鐮孢對非生物脅迫的耐受力測定Fig. 7 Abiotic stress response assays of F. pseudograminearum

3 討論

3.1 自噬在植物病原真菌中的作用

自噬是細胞內一種重要的降解途徑，在真菌的生理和致病過程中均起重要作用。鐮孢菌包含多種動物和植物的病原菌，比如引起小麥赤霉病的禾谷鐮孢，利用遺傳學方法對其27 個Atg分別進行敲除，多個Atg缺失突變體的生長、產孢和致病性表現異常[20,28]。在輪枝鐮孢（Fusariumverticillioides）中，自噬相關蛋白FvAtg4 和FvAtg8 直接互作，基因缺失后病原菌不能發生細胞自噬，突變體的菌絲生長、色素沉著、產孢和致病性等表型具有明顯缺陷，伏馬毒素B1 的合成明顯降低[29]。假禾谷鐮孢與禾谷鐮孢在形態結構和遺傳進化等方面非常相似，曾被認為是同一種真菌，但隨著研究的深入，越來越多的證據表明兩者在多個方面表現差異，包括有性生殖方式、寄主組織偏好性和侵染特點等[2,30]。在前期研究中發現，STRIPAK 復合體的核心元件FpHam-2/-3/-4 是假禾谷鐮孢菌絲融合的關鍵作用因子，并參與病原菌的產孢和致病。通過酵母雙雜交篩選發現FpHam-2 和FpHam-3 與自噬相關蛋白FpAtg3、FpAtg28 和FpAtg33 均直接互作，且FpHam-2缺失突變體在饑餓條件下細胞自噬的發生明顯受阻[22]。菌絲融合是子囊類真菌中普遍存在的一種生理現象，包括細胞質、細胞器的融合，以及細胞核的降解[31-32]。在尖鐮孢中，自噬體形成的核心調控基因FoAtg8缺失后，細胞自噬缺陷除影響病原菌的生長、產孢和致病性以外，突變體的菌絲融合率降至野生型的10%[33]。由此，猜測除Atg8 還有其他自噬相關蛋白作用于自噬調控的菌絲融合。

3.2 自噬相關基因Atg3 的功能

Atg3 編碼E2 泛素結合酶，其同源蛋白在哺乳動物、昆蟲、植物和真菌中普遍存在，且只有一種類型，能與Atg7、Atg8、Atg12 和質膜等結合，對自噬體的形成起關鍵調控作用[34-35]。分別在哺乳動物小鼠和模式真菌釀酒酵母中敲除Atg3，均抑制機體細胞自噬的發生，并由此引發一系列依賴自噬調控的生理缺陷[22,35]。近期研究發現，Atg3 在不依賴細胞自噬的生理過程中也起重要調控作用，比如DNA 損傷誘導的有絲分裂[24,36]。在植物病原真菌中，對Atg3 的關注和研究報道相對較少。在稻瘟病菌中，發現MoAtg3 與組蛋白乙酰轉移酶MoHat1 直接互作，并且MoHat1乙酰化MoAtg3，進一步影響MoAtg3 與MoAtg8 之間的結合，從而抑制病原菌的細胞自噬及致病性[37]。在鐮孢菌中，雖有報道Atg3 與病原菌的產孢和致病有關，但缺乏對Atg3 功能的系統分析，尤其是Atg3 在絲狀真菌菌絲融合中的作用尚不明確。

本研究利用真菌遺傳轉化在假禾谷鐮孢中將FpAtg3敲除后，與野生型菌株相比，FpAtg3缺失突變體表現出菌絲生長減慢、形態異常、產孢量減少、孢子分隔減少、菌絲融合率和孢子融合芽管率明顯降低等一系列生理缺陷；此外FpAtg3缺失突變體的致病力及對非氧化脅迫的耐受力也明顯減弱。豐富了自噬在植物病原真菌中的功能研究，可為揭示基于自噬調控的假禾谷鐮孢的致病機理并進一步防控小麥莖基腐病提供理論依據。

4 結論

自噬相關基因FpAtg3在絲狀真菌中非常保守，遺傳分析表明FpAtg3 調控假禾谷鐮孢的菌絲生長、產孢、細胞融合、致病力以及對非生物脅迫的耐受性，研究結果可為探究細胞自噬在假禾谷鐮孢致病過程中的作用及調控機制提供參考。