副結(jié)核分枝桿菌免疫原蛋白的篩選及免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)

陳凡若，張嘉俊，鹿萍，崔寧，崔瑩瑩，崔子寅，黨光輝，劉思國(guó)

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/動(dòng)物疫病防控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150069

0 引言

【研究意義】副結(jié)核病（paratuberculosis，PTB）是一種由副結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis，MAP）引起的反芻動(dòng)物慢性消耗性疾病，能夠引起患病動(dòng)物持續(xù)性腹瀉和肉芽腫性腸炎[1]。近年來(lái)，由于養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模的擴(kuò)增，PTB 的發(fā)病率也隨之增加，在內(nèi)蒙古等多個(gè)地區(qū)發(fā)現(xiàn)[2]。由于動(dòng)物患上PTB 后會(huì)導(dǎo)致其生產(chǎn)性能下降、飼料轉(zhuǎn)化效率降低、產(chǎn)奶量下降、對(duì)其他疾病的易感性增加以及過(guò)早淘汰導(dǎo)致的飼養(yǎng)成本增加，養(yǎng)殖業(yè)遭受極大的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。目前，由于商用的PTB 滅活疫苗存在干擾牛結(jié)核病的檢測(cè)、導(dǎo)致注射部位損傷、保護(hù)率低等弊端，因此迫切需要開(kāi)發(fā)PTB 新型疫苗[6-7]。【前人研究進(jìn)展】目前，已經(jīng)有一些關(guān)于MAP 的免疫原性蛋白的研究報(bào)道，如 P22、MAP1272c、Ag85C（MAP3531c）、MAP3783 和MAP3701c，這些蛋白均具有作為候選亞單位疫苗的潛力。P22 是MAP 分泌的一種脂蛋白，與油包水佐劑混合，經(jīng)皮下免疫綿羊可誘導(dǎo)良好的IFN-γ 和抗體反應(yīng)[8-9]。MAP1272c 是一種細(xì)胞壁相關(guān)的水解酶，用MAP1272c 與MAP1087、MAP1204、MAP2077c 混合制成的抗原雞尾酒免疫犢牛，能夠降低新生犢牛的MAP 感染率和糞便中MAP的脫落[10]。Ag85C 屬于Ag85 蛋白家族，是高度保守的蛋白質(zhì)[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，牛群和小鼠經(jīng)口感染MAP的過(guò)程中，Ag85 是免疫優(yōu)勢(shì)T 細(xì)胞抗原，可以誘導(dǎo)快速?gòu)?qiáng)烈的T 細(xì)胞增殖和IFN-γ 的分泌[11]。MAP3783是一種保守的假定ESAT-6 樣蛋白，MAP3701c 是一種熱休克蛋白。用MAP3701c、MAP3783 和MAP1508混合制成的抗原雞尾酒免疫牛，促進(jìn)IFN-γ 和抗體的釋放分泌水平上升，且免疫效果穩(wěn)定，不受年齡的增長(zhǎng)而變化[12]。【本研究切入點(diǎn)】多種融合蛋白能夠增加對(duì)MAP 的保護(hù)效果。常用的方法是在單一疫苗中使用多種蛋白抗原形成抗原雞尾酒，以及將多種抗原相互連接，形成融合蛋白。據(jù)報(bào)道，MAP3527 和MAP1519 構(gòu)建的融合蛋白74F，以及MAP3527 和Ag85B 構(gòu)建的重組蛋白66NC，均對(duì)MAP 感染有著良好的保護(hù)作用[13-14]。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究擬對(duì)MAP 的p22、map1272c、map3531c、map3783、map3701c以及map3527這6 個(gè)基因，表達(dá)5 種融合蛋白58F、62F、69F、46F 和52F，通過(guò)IFN-γ ELISPOT實(shí)驗(yàn)篩選出最佳免疫原；隨后將最佳候選免疫原和已報(bào)道的66NC 混合，通過(guò)IFN-γ ELISPOT 試驗(yàn)、監(jiān)測(cè)抗體滴度、血清細(xì)胞因子，以及檢測(cè)感染后免疫小鼠的體重變化、病理學(xué)和組織病理學(xué)觀察以及組織荷菌數(shù)，綜合評(píng)價(jià)候選亞單位疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)效果，從而篩選出效果較好的候選亞單位疫苗，為PTB的有效防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2022 年5 月至 2023 年2 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所完成。

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6 周齡C57BL/6 雌性小鼠購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 載體與菌株

pET28a-3527N-3527C 和pET28a-3527N-Ag85B-3527C 載體由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物疫病防控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。MAP K-10 菌株也是由該實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物

參考GenBank中MAP的p22、map1272c、map3531c、map3783以及map3701c的基因序列，利用Snapgene軟件設(shè)計(jì)特異性引物 p22-F/R、map1272c-F/R、map3531c-F/R、map3783-F/R 以及map3701c-F/R。根據(jù)參照文獻(xiàn)[15]合成MAP K-10 的熒光定量PCR 所用引物和探針。引物由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司和美國(guó)ABI 公司合成（表1）。

表1 特異性引物和探針Table 1 Specific primers and probes

1.4 主要試劑

PrimerSTAR Max 聚合酶、Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）購(gòu)自日本Takara 公司；小鼠IL-17A/ IFN-γ/TNF-α ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow 購(gòu)自美國(guó)GE 公司；MONTANIDE ISA 61 VG 佐劑購(gòu)自法國(guó)賽比克公司；小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液試劑盒購(gòu)自天津?yàn)笊镏破酚邢薰荆籑ouse IFN-γ Precoated ELISPOT Kit 購(gòu)自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；Goat pAb to Mouse IgG/IgM/IgG1/IgG2a 購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；Middlebrook 7H9 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.5 融合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)與制備

以提取的MAP K-10 參考株基因組DNA 為模板，分別用 p22-F/R、map1272c-F/R、map3531c-F/R、map3783-F/R 以及map3701c-F/R 引物擴(kuò)增5 種基因，將其分別克隆于pET28a-3527N-3527C 載體，構(gòu)建5種重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化E.coliBL21 誘導(dǎo)表達(dá)，根據(jù)蛋白分子量大小將重組蛋白分別命名為58F、62F、69F、46F 和52F。以可溶形式表達(dá)的58F、62F 和52F 經(jīng)Ni 柱親和層析純化；以包涵體形式表達(dá)的69F 和46F進(jìn)行變性與復(fù)性，經(jīng)Ni 柱親和層析純化。將pET28a-3527N-Ag85B-3527C 轉(zhuǎn)化E.coliBL21 誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)Ni 柱親和層析純化，獲得66NC。測(cè)定蛋白濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 動(dòng)物免疫與感染

1.6.1 疫苗制備 重組蛋白免疫組：重組蛋白分別與MONTANIDE ISA 61 VG 佐劑以1∶1.5 的比例乳化；61 VG 對(duì)照組：取與蛋白等體積的無(wú)菌 PBS 與MONTANIDE ISA 61 VG 佐劑以1∶1.5 的比例乳化；MAP K-10 滅活疫苗對(duì)照組：取適量MAP K-10，用滅菌水洗滌并重懸后，轉(zhuǎn)移至EP 管中，置于80℃水浴鍋中滅活30 min。在超凈臺(tái)中風(fēng)干MAP K-10，待菌液完全風(fēng)干后，對(duì)MAP K-10 粉末進(jìn)行稱重，室溫保存?zhèn)溆谩Ｈ∵m量無(wú)菌PBS 重懸熱滅活風(fēng)干后的MAP K-10 粉末，使其終濃度為5 mg·mL-1，與MONTANIDE ISA 61 VG 以1∶1.5 的比例進(jìn)行乳化。室溫置于高通量組織研磨儀中進(jìn)行乳化。高通量組織研磨儀的程序設(shè)置為：頻率20 次/s，工作時(shí)間20 min。吸取乳化后的液體滴至水面，液滴不立即彌散即為乳化成功。

1.6.2 動(dòng)物分組 候選亞單位疫苗的篩選試驗(yàn)：21 只雌性C57BL/6 小鼠分為7 組，每組3 只，分別為61 VG 對(duì)照組、66NC 對(duì)照組、58F 免疫組、62F 免疫組、69F 免疫組、46F 免疫組和52F 免疫組；候選亞單位疫苗的免疫原性與保護(hù)效果評(píng)價(jià)試驗(yàn)：68 只雌性C57BL/6 小鼠分為4 組，分別為61 VG對(duì)照組（16 只）、MAP K-10 滅活疫苗對(duì)照組（16只）、58F 免疫組（18 只）和66NC+58F 免疫組（18只）。

1.6.3 動(dòng)物免疫與感染 61 VG 對(duì)照組每只小鼠注射100 μL PBS；MAP K-10 對(duì)照組每只小鼠注射500 μg（100 μL）熱滅活的MAP K-10；58F、62F、69F、46F、52F、66NC、66NC+58F 免疫組每只小鼠注射50 μg（100 μL）相應(yīng)蛋白。接種途徑為背部皮下多點(diǎn)注射。小鼠共免疫兩次，間隔3 周。二免3 周時(shí)用MAP K-10 菌株通過(guò)腹腔注射感染除空白對(duì)照組以外的小鼠，MAP K-10 菌株用無(wú)菌PBST 重懸，濃度為1×109CFU/mL，每只小鼠注射100 μL。MAP K-10 菌株的感染方式和劑量參照文獻(xiàn)[14]。

1.7 IFN-γ ELISPOT 試驗(yàn)

小鼠二免3 周時(shí)，使用小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液試劑盒提取小鼠脾淋巴細(xì)胞，使用Mouse IFN-γ Precoated ELISPOT Kit 檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ 的細(xì)胞量，具體步驟參照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.8 ELISA 監(jiān)測(cè)血清特異性抗體

二免3 周、感染2 周和4 周時(shí)對(duì)各組小鼠采血，收集血清，進(jìn)行1∶20、1∶40 等作2 倍倍比稀釋，至1∶409 600，-20 ℃保存。取96 孔板，用相應(yīng)抗原包被后，每孔分別加入100 μL 不同稀釋度的血清樣本，室溫孵育并洗板后，用PBST 溶液對(duì)Goat anti mouse IgG、IgM、IgG1和IgG2a進(jìn)行1∶10 000 倍稀釋，每孔分別加入100 μL，室溫孵育并洗板后，在避光條件下每孔加入TMB 顯色液，孵育顯色后用2 mol·L-1硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在OD450處檢測(cè)光吸收值。IgG 和IgM 的滴度為陽(yáng)性O(shè)D450/陰性O(shè)D450值≥2.0時(shí)的最大血清稀釋度。

1.9 ELISA 監(jiān)測(cè)血清細(xì)胞因子水平

二免3 周、感染2 周與4 周時(shí)對(duì)各組小鼠采血，使用小鼠IL-17A/ IFN-γ/ TNF-α ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清細(xì)胞因子水平，具體步驟參照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.10 體重檢測(cè)

記錄小鼠感染前和感染2 周的體重，并計(jì)算感染2 周小鼠的體重增長(zhǎng)率。

1.11 病理學(xué)和組織病理學(xué)觀察

脫頸處死感染4 周小鼠，在超凈臺(tái)中解剖小鼠，分離小鼠肝臟，拍照記錄肝臟上結(jié)節(jié)和宏觀病變，并根據(jù)肝臟表面結(jié)節(jié)面積百分比做病理學(xué)打分。取感染4 周小鼠肝臟尾狀葉，于組織固定液中固定，送至中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所病理實(shí)驗(yàn)室制備病理切片進(jìn)行H·E 染色，觀察組織病理學(xué)變化，并根據(jù)肝臟肉芽腫面積百分比進(jìn)行組織病理學(xué)打分。病理學(xué)打分遵循以下原則，肝臟表面結(jié)節(jié)面積百分比打分如下：0=無(wú)，1=≤1%，2=＞1%和≤3%，3=＞3%和≤5%，4=＞5%和≤7%，5=＞7%和≤9%，6=＞9%和≤11%,，7=＞11%和≤13%，8=＞13%和≤15%，9=＞15%和≤17%，10=＞17%和≤19%，11=＞19%和≤21%，12=＞21%和≤23%，13=＞23%和≤25%，14=＞25%和≤27%，15=＞27%和≤29%。根據(jù)肉芽腫面積百分比對(duì)肝臟進(jìn)行組織病理學(xué)打分：0=無(wú)；1=≤10%；2=＞10%和≤15%；3=＞15%和≤20%；4=＞20%和≤30%；5=＞30%和≤40%；6=＞40%和≤50%。

1.12 qPCR 檢測(cè)組織荷菌數(shù)

研磨感染4 周的小鼠肝臟，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，測(cè)定細(xì)菌DNA 的濃度，將細(xì)菌基因組DNA 置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?biāo)準(zhǔn)品MAP 基因組DNA 進(jìn)行倍比稀釋，制成標(biāo)準(zhǔn)品模板。以DNA 酶處理過(guò)的滅菌水為陰性對(duì)照，進(jìn)行TaqMan熒光定量PCR。由QuanStudioTMDesign & Analysis Software v1.4.3 分析繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠肝臟荷菌數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 6 種融合蛋白的構(gòu)建與親和層析純化

用MAP 的p22、map1272c、map3531c、map3783、map3701c和map3527基因根據(jù)重組質(zhì)粒模式圖構(gòu)建5 種重組質(zhì)粒（圖1-a）。將鑒定正確的5 種重組質(zhì)粒和 pET28a-3527N-Ag85B-3527C 轉(zhuǎn)化E.coliBL21，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)、Ni 柱親和層析純化，獲得6種融合蛋白58F、62F、69F、46F、52F 和66NC（圖1-b）。

圖1 重組質(zhì)粒模式圖（a）與SDS-PAGE 檢測(cè)58F、62F、69F、46F 和52F 蛋白的純化情況（b）Fig. 1 Pattern of recombinant plasmid (a) and affinity chromatographic purification of 58F, 62F, 69F, 46F, and 52F proteins detected by SDS-PAGE (b)

2.2 IFN-γ ELISPOT 試驗(yàn)篩選候選免疫原

為了篩選能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)免疫應(yīng)答的抗原，分離二免3 周小鼠脾淋巴細(xì)胞，進(jìn)行IFN-γ ELISPOT 試驗(yàn)。結(jié)果顯示：與MONTANIDE ISA 61 VG（61 VG）對(duì)照組相比，58F 免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ的細(xì)胞量顯著高于61 VG 對(duì)照組與62F、69F、46F 和52F 免疫組（P＜0.001），并且與陽(yáng)性對(duì)照66NC 免疫組無(wú)顯著差異（圖2）。以上結(jié)果表明，5 種重組蛋白中，58F 能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的IFN-γ 免疫反應(yīng)，是免疫效果更好的候選抗原。

圖2 酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀檢測(cè)抗原刺激脾淋巴細(xì)胞后IFN-γ 表達(dá)情況Fig. 2 The expression of IFN-γ in spleen lymphocytes stimulated by antigen was detected by ELISPOT

2.3 融合蛋白58F 和66NC+58F 的免疫原性分析

為了比較融合蛋白58F 和66NC+58F 的免疫水平，分離二免3 周小鼠的脾淋巴細(xì)胞，進(jìn)行IFN-γ ELISPOT 試驗(yàn)，并收集二免3 周小鼠的血清，ELISA檢測(cè)血清細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α 和IL-17A 和IgG1、IgG2a抗體水平（圖3）。結(jié)果顯示：與61 VG 對(duì)照組和MAP K-10 對(duì)照組相比，66NC+58F 免疫組小鼠的脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ 的細(xì)胞量非常顯著增加（P＜0.01）；58F 免疫組小鼠的脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ 的細(xì)胞量高于對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；66NC+58F 免疫組高于58F 免疫組，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（圖3-a、圖3-b）。與兩個(gè)對(duì)照組和58F免疫組相比，66NC+58F 免疫組分泌的IFN-γ、TNF-α和IL-17A 顯著增加（P＜0.05）（圖3-c）。與61 VG對(duì)照組和MAP K-10 對(duì)照組相比，58F 和66NC+58F免疫組的IgG1和IgG2a水平均顯著增高（P＜0.05），但兩組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（圖3-d、圖3-e）。以上結(jié)果表明，融合蛋白66NC+58F 能夠誘導(dǎo)更高的Th1、Th17 型免疫反應(yīng)和抗體水平，是免疫效果更好的候選抗原。

圖3 二免3 周融合蛋白58F 和66NC+58F 的免疫原性分析Fig. 3 Immunogenicity analysis of fusion protein 58F and 66NC+58F at 3 weeks of secondary immunization

2.4 ELISA 監(jiān)測(cè)血清特異性抗體

為了監(jiān)測(cè)融合蛋白58F 和66NC+58F 誘導(dǎo)的抗體水平，首免后每2 周對(duì)各組小鼠進(jìn)行采血，通過(guò)ELISA檢測(cè)免疫至感染期間IgG 和IgM 抗體水平（圖4）。結(jié)果顯示：與MAP K-10 對(duì)照組相比，58F 免疫組和66NC+58F 免疫組在整個(gè)監(jiān)測(cè)過(guò)程產(chǎn)生的IgG，以及首免2 周、4 周和感染4 周產(chǎn)生的IgM 極顯著增加（P＜0.001），66NC+58F 免疫組在感染2 周產(chǎn)生的IgM非常顯著增加（P＜0.01），但兩組產(chǎn)生的IgG 和IgM在整個(gè)監(jiān)測(cè)過(guò)程中始終無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（圖4-a、圖4-b）。以上結(jié)果表明，融合蛋白58F 和66NC+58F 均可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的抗體。

圖4 血清抗體監(jiān)測(cè)Fig. 4 The monitoring results of serum antibody

2.5 ELISA 檢測(cè)感染后小鼠血清細(xì)胞因子

為了比較融合蛋白58F 和66NC+58F 在小鼠感染后誘導(dǎo)的細(xì)胞因子水平的差異，在感染2 周和4 周對(duì)各組小鼠進(jìn)行采血，通過(guò)ELISA 檢測(cè)IFN-γ、TNF-α和IL-17A 水平（圖5）。結(jié)果顯示：感染2 周時(shí)，與61 VG 對(duì)照組、MAP K-10 對(duì)照組和58F 免疫組相比，66NC+58F 免疫組分泌的IFN-γ、TNF-α 和IL-17A 極顯著增加（P＜0.001）（圖5-a）。感染4 周時(shí)，與61 VG 對(duì)照組相比，58F 免疫組和66NC+58F 免疫組分泌的IFN-γ、TNF-α 和IL-17A 非常顯著增加（P＜0.001），但兩組與MAP K-10 對(duì)照組相比無(wú)差異（P＞0.05），兩個(gè)免疫組之間無(wú)差異（P＞0.05）（圖5-b）。以上結(jié)果表明，融合蛋白66NC+58F 刺激小鼠血清中IFN-γ、TNF-α 和IL-17A 的釋放，能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的Th1和Th17 型免疫反應(yīng)。

圖5 血清細(xì)胞因子檢測(cè)Fig. 5 Serum cytokine assay results

2.6 體重檢測(cè)

為了比較感染后各組小鼠增重差異，記錄感染前和感染2 周時(shí)小鼠的體重，計(jì)算小鼠體重增長(zhǎng)率（圖6）。與61 VG 對(duì)照組相比，58F 免疫組體重增長(zhǎng)率顯著增加（P＜0.05），66NC+58F 免疫組體重增長(zhǎng)率極顯著增加（P＜0.001），但58F 與66NC+58F 免疫組間無(wú)差異（P＞0.05）；與MAP K-10 對(duì)照組相比，66NC+58F 免疫組體重增長(zhǎng)率非常顯著增加（P＜0.01），58F 免疫組無(wú)差異（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，融合蛋白58F 和66NC+58F 均可抵抗MAP 感染造成的體重下降，66NC+58F 的抵抗效果較58F 更好。

圖6 感染2 周小鼠體重增長(zhǎng)率Fig. 6 Body weight growth rate of mouse at two weeks of infection

2.7 融合蛋白58F 和66NC+58F 的保護(hù)效果分析

為了評(píng)價(jià)融合蛋白58F 和66NC+58F 免疫小鼠后的保護(hù)效果，筆者分離MAP K-10 感染4 周小鼠的肝臟進(jìn)行病理學(xué)和組織病理學(xué)分析，并通過(guò)熒光定量PCR 的方法檢測(cè)肝臟荷菌數(shù)（圖7）。結(jié)果顯示：感染4 周時(shí)，所有組的肝臟表面均有表面結(jié)節(jié)，但66N+58F 免疫組肝臟表面結(jié)節(jié)面積比61 VG 對(duì)照組和MAP K-10 對(duì)照組更少（圖7-a，紅色箭頭指示）。病理學(xué)打分顯示，與61 VG 對(duì)照組相比，兩個(gè)免疫組的各個(gè)臟器病變無(wú)差異（P＞0.05）；與MAP K-10 對(duì)照組相比，兩個(gè)免疫組的肝臟病變非常顯著下降（P＜0.01），但兩個(gè)免疫組各個(gè)臟器病變之間無(wú)差異（P＞0.05）（圖7-b）。感染4 周時(shí)，所有組的肝臟均有廣泛性的肝細(xì)胞壞死與多發(fā)性微型肉芽腫，但66N+58F免疫組肉芽腫面積比兩個(gè)對(duì)照組和58F 免疫組更少（圖7-c，紅色箭頭指示）。組織病理學(xué)打分顯示，66NC+58F免疫組肝臟肉芽腫面積顯著低于61 VG 對(duì)照組和MAP K-10 對(duì)照組（P＜0.05），且肝臟組織病理得分顯著低于58F 免疫組（P＜0.05）（圖7-d）。感染4 周時(shí)，58F免疫組肝臟的荷菌數(shù)顯著低于61 VG 對(duì)照組（P＜0.05）；66NC+58F 免疫組肝臟的荷菌數(shù)顯著低于61 VG對(duì)照組和MAP K-10 對(duì)照組（P＜0.05）；但兩個(gè)免疫組之間的荷菌數(shù)無(wú)差異（P＞0.05）（圖7-e）。以上結(jié)果表明，融合蛋白58F 和66NC+58F 能夠抵抗MAP 感染對(duì)小鼠造成的病理?yè)p傷，均可降低MAP 在小鼠肝臟中的定植水平，且66NC+58F 的抵抗效果優(yōu)于58F。

圖7 小鼠臟器病理學(xué)、組織病理學(xué)和菌落定植分析Fig. 7 Organ pathology and histopathological analysis of mouse

3 討論

3.1 重組亞單位候選疫苗的篩選

MAP 感染主要導(dǎo)致宿主的Th1 免疫反應(yīng)，其中IFN-γ 是最關(guān)鍵的細(xì)胞因子，它在T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活中有著重要作用，從而介導(dǎo)細(xì)胞免疫，抑制和殺傷MAP[16-17]。對(duì)MAP 感染的控制取決于宿主的Th1免疫反應(yīng)和Th1 細(xì)胞在獲得性免疫階段分泌的IFN-γ對(duì)巨噬細(xì)胞的激活[18]。因此，篩選出能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的Th1 免疫反應(yīng)和IFN-γ 水平的候選免疫原對(duì)于開(kāi)發(fā)MAP 亞單位疫苗至關(guān)重要。本研究在獲得6 種融合蛋白后，通過(guò)IFN-γ ELISPOT 試驗(yàn)評(píng)價(jià)融合蛋白免疫原性，確定了MAP 的最佳候選抗原58F。

在結(jié)核病和副結(jié)核病的亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，越來(lái)越多的研究采用了抗原雞尾酒或融合蛋白的策略，以增加亞單位疫苗的免疫效果，最終獲得的亞單位疫苗比起單一抗原可以引起更有效的免疫反應(yīng)[10,12,19]。本研究將用已報(bào)道的MAP3527 和Ag85B構(gòu)建的融合蛋白66NC 與篩選出的MAP 最佳候選免疫原58F 混合，制成的重組亞單位疫苗66NC+58F 免疫小鼠后，通過(guò)IFN-γ ELISPOT 試驗(yàn)評(píng)價(jià)其免疫原性，確定了MAP 的最佳候選抗原66NC+58F。

3.2 重組亞單位候選疫苗的免疫原性評(píng)價(jià)

MAP 感染主要導(dǎo)致宿主的Th1 免疫反應(yīng)，特點(diǎn)包括IgG2a抗體、IFN-γ 和TNF-α 的產(chǎn)生[18,20]。IFN-γ 和TNF-α 可以激活巨噬細(xì)胞的成熟和抗原特異性Th1 細(xì)胞的增殖，進(jìn)而協(xié)調(diào)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能，是遏制胞內(nèi)感染的必要條件。TNF-α 缺乏會(huì)導(dǎo)致MAP 傳播增強(qiáng)，并在感染部位表現(xiàn)出彌漫性肉芽腫病變[21]。IL-17與IFN-γ 等細(xì)胞因子構(gòu)成促炎細(xì)胞因子環(huán)境，共同控制疾病的早期發(fā)展[22]。本研究通過(guò)ELISA 檢測(cè)小鼠血清細(xì)胞因子，結(jié)果顯示，二免3 周時(shí)，66NC+58F 免疫組IFN-γ、TNF-α 和IL-17A 的分泌水平顯著高于61 VG 對(duì)照組和58F 免疫組，表明融合蛋白66NC+58F能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的Th1 和Th17 型免疫反應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)，在接種MAP 滅活疫苗的綿羊中，B細(xì)胞在保護(hù)動(dòng)物免受MAP 感染方面非常重要[23]。免疫產(chǎn)生的抗體可以提高動(dòng)物的存活率，減少細(xì)菌的傳播[24-25]。由于亞單位疫苗主要誘導(dǎo)宿主體液免疫反應(yīng)，因此抗體滴度也是評(píng)價(jià)候選亞單位疫苗的工具之一[17]。本研究通過(guò)ELISA 監(jiān)測(cè)小鼠血清抗體水平，結(jié)果表明，58F 和66NC+58F 免疫組在免疫過(guò)程中均誘導(dǎo)高滴度的IgG、IgM、IgG1和IgG2a。表明融合蛋白58F 和66NC+58F 能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。

3.3 重組亞單位候選疫苗的免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)

目前已經(jīng)鑒定出多種能夠誘導(dǎo)Th1 免疫反應(yīng)的抗原，但由于牛、羊等反芻動(dòng)物進(jìn)入臨床階段前有較長(zhǎng)的潛伏期，因此只有少數(shù)候選免疫原在牛上進(jìn)行了保護(hù)效果評(píng)價(jià)[26-27]。小鼠是研究MAP 長(zhǎng)期感染最合適的替代模型，主要用來(lái)早期篩選候選疫苗，雖然反芻動(dòng)物的臨床特征如腹瀉和嚴(yán)重的腸道病變等癥狀無(wú)法在小鼠中復(fù)現(xiàn)，但小鼠在感染MAP 時(shí)的組織學(xué)和免疫學(xué)特征與反芻動(dòng)物相似[28-29]。對(duì)于小鼠模型，脾臟、肝臟和腸的細(xì)菌負(fù)荷量或細(xì)菌的糞便脫落可以作為疾病發(fā)展的標(biāo)志。

本研究通過(guò)ELISA 檢測(cè)小鼠抗體水平和血清細(xì)胞因子，結(jié)果顯示，感染2 周、4 周時(shí)，58F 和66NC+58F免疫組均誘導(dǎo)高滴度的IgG 和IgM，對(duì)抵抗MAP 感染具有一定的保護(hù)作用；66NC+58F 免疫組IFN-γ、TNF-α 和IL-17A 的分泌水平顯著高于61 VG 對(duì)照組和58F 免疫組，表明融合蛋白66NC+58F 能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的Th1 和Th17 型免疫反應(yīng)。本研究監(jiān)測(cè)了感染2周各組小鼠的增重差異，以評(píng)價(jià)融合蛋白對(duì)感染后小鼠體重的影響，結(jié)果顯示，66NC+58F 免疫組小鼠體重的增重效果高于61 VG 對(duì)照組和58F 免疫組，更能抵抗MAP 感染造成的體重下降。本研究通過(guò)病理學(xué)及組織病理學(xué)觀察評(píng)價(jià)融合蛋白58F 和66NC+58F 在感染過(guò)程中對(duì)小鼠的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，與61 VG對(duì)照組相比，58F 免疫組和66NC+58F 免疫組肝臟的病理?yè)p傷均明顯減輕，66NC+58F 免疫組較58F 免疫組更輕，表明融合蛋白66NC+58F 能夠抵抗MAP 感染對(duì)小鼠造成的病理?yè)p傷。本研究通過(guò)熒光定量PCR評(píng)價(jià)融合蛋白58F 和66NC+58F 在感染過(guò)程中對(duì)小鼠肝臟定植情況的影響，結(jié)果顯示，與61 VG 對(duì)照組相比，58F 免疫組和66NC+58F 免疫組的肝臟荷菌數(shù)均顯著下降，表明融合蛋白58F 和66NC+58F 均可降低MAP 在肝臟的定植水平。

4 結(jié)論

成功獲得5 種融合蛋白58F、62F、69F、46F 和52F，其中，58F 誘導(dǎo)強(qiáng)烈的特異性IFN-γ 反應(yīng)；融合蛋白66NC+58F 能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度的抗體以及Th1 和Th17 型免疫反應(yīng)，對(duì)MAP 感染有著一定的免疫保護(hù)作用，是PTB 重要的亞單位疫苗候選，為PTB新型亞單位疫苗的研究提供重要的科學(xué)依據(jù)。