FoxO1 對牛骨骼肌細胞增殖、凋亡和分化的調控

姜超，張久盤，宋雅萍，宋小雨，吳昊，魏大為?

1 寧夏大學動物科技學院/寧夏反芻動物分子細胞育種重點實驗室，銀川 750021；2 寧夏農林科學院動物科學研究所，銀川 750021

0 引言

【研究意義】隨著人們消費水平以及對優質肉類消費需求的提高，牛肉消費量逐漸增加，但我國牛肉供給量不足，導致牛肉的供需不平衡，需依靠大量進口牛肉來維持牛肉市場穩定。胴體重是衡量產肉動物產肉性能的重要指標，骨骼肌是胴體的主要組成部分[1]，與動物產肉密切相關，骨骼肌的生長發育依賴于肌細胞的增殖和分化，而該過程受到基因的嚴格調控。因此，篩選與骨骼肌生長發育相關基因并驗證其功能是提高牛肉產量的重要遺傳改良舉措。【前人研究進展】家畜骨骼肌組織從發生到成熟是成肌細胞增殖分化，然后不斷融合形成成熟肌纖維的結果[2]。成肌細胞起源于間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）[3]，MSCs 激活后，肌源性分化形成成肌祖細胞，祖細胞分化形成成肌細胞。成肌細胞在生肌因子作用下分化形成肌細胞，肌細胞彼此間融合形成肌管。此外，祖細胞還分化形成肌衛星細胞，其具有增殖與分化能力，并在正常情況下處于靜止狀態，而在肌損傷時被激活，以完成骨骼肌的再生與修復[4]。骨骼肌的生長發育受到多種調控因子及信號通路的共同調控，其中配對盒Pax3/Pax7 和生肌調節因子（myogenic regulatory factors，MRFs）家族起到重要作用[5-6]。MRFs 家族由MYF5、MYOD、MYF6 和MYOG 構成，是成肌分化過程的核心調控因子，在成肌細胞分化各階段中起到重要調控作用[7-8]；Pax3 和Pax7 是成肌祖細胞分化的重要依靠，Pax3/Pax7 通過激活MYOD來促使肌衛星細胞分化，而抑制Pax3/Pax7 會降低MYF5、MYOD和Desmin基因的表達，使細胞肌源性分化能力喪失，并且Pax7 缺失可導致細胞死亡[9-10]。因此，常把MRFs 作為研究骨骼肌細胞分化的重要標志基因[11]，而其他調控因子可以通過調控MRFs的表達來影響骨骼肌細胞的分化過程。FoxO1作為Forkhead box O（FoxO）轉錄因子家族的一員，可以精準調控細胞凋亡、細胞周期、氧化應激、細胞分化及細胞代謝等過程中靶基因的表達，從而調控細胞生命活動[12-13]。有研究表明，FoxO1是骨骼肌分化早期的負調控因子，其可以通過影響mTOR 通路、Notch 通路、肌生長抑制素等多種信號通路來抑制成肌細胞的早期分化。過表達FoxO1的轉基因小鼠會發生肌肉萎縮，并且在相同的飼養管理條件下飼養到30 月齡，其體重始終低于正常小鼠。在發生肌損傷時，過表達FoxO1轉基因小鼠的骨骼肌損傷程度更高，肌肉再生速度變慢，從而抑制肌肉再生[14]，并且在C2C12 細胞中過表達FoxO1會上調細胞周期抑制因子p57 和Gadd45α，從而抑制細胞增殖。此外，某些microRNA 和分子化學物質可以直接或間接地調控FoxO1的表達，進而影響骨骼肌細胞的生長狀態[15-16]，例如miR-183/96/182可以直接靶向抑制FoxO1，也可以促進牛成肌細胞分化標志基因MYOD、MYOG和MYF5的表達，說明FoxO1在骨骼肌細胞分化過程中存在信號調控作用[17]。因此，無論是在個體水平還是細胞水平上，FoxO1在骨骼肌的生長發育上均發揮著重要作用。FoxO1 轉錄因子功能主要是通過翻譯后修飾（posttranslational modifications，PTM）來實現的，經過磷酸化、乙酰化、甲基化或泛素化修飾后，FoxO1的亞細胞分布和DNA 結合親和力發生改變，這將引起FoxO1活性變化，影響其與下游靶基因的啟動子區域的直接結合，從而調控靶基因的表達[18]。【本研究切入點】盡管有許多研究已經證實FoxO1在骨骼肌生長發育中的作用，但都集中于人和小鼠上，而在肉牛上的研究較少。本試驗利用實時熒光定量PCR 技術檢測FoxO1在牛不同組織中的表達，利用免疫熒光技術定位細胞中FoxO1 蛋白，利用EdU和流式細胞術檢測過表達FoxO1對骨骼肌細胞增殖能力的影響，利用qPCR 檢測過表達FoxO1對增殖、凋亡及分化相關基因表達的影響。【擬解決的關鍵問題】這些結果將初步闡明FoxO1在牛骨骼肌細胞生長發育中的作用機制，為肉牛遺傳改良提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2022 年5 月至2023 年5 月在寧夏大學寧夏反芻動物分子細胞育種重點實驗室完成。

1.2 組織樣品采集

隨機選取3 只健康的成年（30 月齡，650 kg 左右）固原黃牛公牛，屠宰后采集其心、肝、脾、肺、腎、背最長肌、后腿肌、皮下脂肪和睪丸組織（于2022年5 月在固原富民農業科技有限公司采集），將各種組織用PBS 緩沖液清洗后轉入無酶凍存管中，置于液氮中保存，用于組織表達譜構建。

1.3 牛原代骨骼肌細胞分離、培養與誘導分化

本研究采用酶消化法分離牛原代骨骼肌細胞，組織樣品來自3 頭新生固原黃牛犢牛（1 周齡）的背最長肌組織。在處死犢牛后，使用無菌手術器械分離其背最長肌組織，用75%酒精和含1%青霉素/鏈霉素的PBS 溶液先后沖洗，再移入無菌細胞室中。用無菌手術器械分割背最長肌組織，并剔除結締組織和血管，在含1%青霉素和鏈霉素的PBS 中清洗3 次，再剪切為肉糜，放入離心管中，并加入適量II 型膠原酶，在37℃、180 r/min 條件下消化1.5 h，再加入等體積的細胞完全培養基（15% FBS+1%雙抗+84% DMEM）終止消化。用100 目和200 目的不銹鋼篩網進行過濾，將濾液以1 000 r/min 離心10 min，棄上清液，得到細胞沉淀。將細胞沉淀用DMEM 培養基重懸，并以1 000 r/min 離心10 min，獲得洗滌后細胞。將細胞重懸后接種到培養皿中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養，隔天觀察細胞生長狀況。待細胞匯合度達到90%，進行傳代培養或更換為分化培養基（含2% HS）進行誘導分化。細胞鑒定通過觀察誘導分化后細胞的表型和檢測其分化標志基因表達的方式進行。

1.4 亞細胞定位

將牛骨骼肌細胞接種于12 孔板中，首先用4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS 清洗3 次；加入0.5% TritonX-100 對細胞通透 10 min，隨后加入5% BSA 的封閉液孵育30 min 后，加入一抗（1∶200稀釋）在4℃條件下孵育過夜。PBS 清洗細胞3 次后加入二抗（1∶200 稀釋），室溫條件下孵育1 h。用終濃度為1 μg·mL-1的DAPI 孵育細胞15 min，PBS 清洗3 次，加入抗熒光衰減封片劑。在倒置熒光顯微鏡下觀察染色情況，并進行拍照。

1.5 RNA 提取及反轉錄

用TRIzol 法提取牛組織樣品或骨骼肌細胞的RNA。利用RNA 反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （Takara，日本）將RNA反轉錄為cDNA。反轉錄程序為：第一步42 ℃，2 min；第二步37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。將cDNA 放置于-20 ℃保存。

1.6 實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）

以cDNA 為模板，利用2X M5 HiPer SYBR Premix EsTaq（with Tli RNaseH）（北京，聚合美）進行實時熒光定量檢測。反應體系（15 μL）：2X M5 Hiper SYBR Premix EsTaq 7.5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）0.3 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 5.9 μL。PCR 反應在CFX96 Real-Time PCR Detection System 儀器上進行，反應程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃1 min，40個循環。以GAPDH（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）為內參，用2-ΔΔCT法分析基因的相對表達量。定量引物利用Primer Premier 6 軟件設計，由通用生物技術有限公司（安徽）進行合成，引物序列如表1 所示。

表1 定量引物Table 1 Primers for real-time quantitative PCR (qPCR)

1.7 腺病毒介導的FoxO1 過表達載體的構建與包裝

根據GenBank 中牛FoxO1基因序列（登錄號：XM_025000053.1），設計帶有HindIII 和KpnI 雙酶切位點的引物（表2），以牛肌肉組織cDNA 為模板，進行FoxO1基因CDS 區擴增。擴增產物連接同樣酶切位點的pAd-Track 載體，將獲得的陽性克隆質粒（命名為pAd-Track-FoxO1）使用PmeI 酶切完全線性化后轉化到含有骨架 pAdEasy-1 骨架載體的BJ5183 感受態細胞中進行同源重組。重組質粒pAd-FoxO1經PacI 限制性內切酶酶切后，將酶切產物轉染至HEK-293A 細胞中進行腺病毒的包裝和擴繁。本研究將FoxO1重組過表達腺病毒命名為OE-FoxO1；陰性對照病毒為實驗室保存，命名為OE-NC。腺病毒介導的FoxO1過表達載體的表達效率用qPCR 鑒定。

表2 擴增引物信息Table 2 Primer information

1.8 流式細胞術檢測細胞周期

將牛骨骼肌細胞接種到6 孔細胞培養板中。待成肌細胞生長至密度為60%時，分別用OE-FoxO1和OE-NC 處理，48 h 后收集細胞。將收集的細胞懸液以1 000×g離心5 min，棄上清液，加入1 mL 預冷PBS重懸，并再次離心后加入1 mL 預冷的70%冰乙醇，吹打混勻，4 ℃固定30 min 以上，離心獲取沉淀，再用PBS 清洗離心。用Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit（上海，碧云天）試劑盒處理細胞，37 ℃避光溫浴30 min。用流式細胞儀進行檢測，細胞計數通量為20 000 個。

1.9 EdU 染色

將牛骨骼肌細胞接種于6 孔細胞培養板中，待細胞密度為60%時，用OE-FoxO1和OE-NC 分別感染牛骨骼肌細胞。48 h 后，利用BeyoClick EdU-594細胞增殖檢測試劑盒（上海，碧云天）進行EdU 染色。先將細胞培養基換成含有10 μmol·L-1EdU 的生長培養基并繼續培養2 h。棄培養基，加入固定液，室溫固定細胞15 min；棄固定液，洗滌液清洗3 次，加入通透液，室溫孵育10 min；棄通透液，洗滌液清洗3 次，加入配置好的Click 反應液，室溫避光孵育30 min；棄Click 反應液，洗滌液清洗3 次，加入1×Hoechst 33342 溶液，室溫避光孵育10 min，孵育完用洗滌液清洗后，于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況并拍照。

1.10 數據分析

EdU 染色結果由Image J 軟件進行分析，細胞周期結果由FlowJo_v10.6.2 軟件進行分析。使用GraphPad Prism 8.0（San Diego, California, USA）進行單因素方差（one-way ANOVA）分析（或t檢驗分析）顯著性并繪圖，**表示極顯著差異（P＜0.01），*表示顯著差異（P＜0.05），ns 表示差異不顯著（P＞0.05）。

2 結果

2.1 牛FoxO1 的組織表達譜分析

組織表達譜結果顯示，FoxO1在成年牛的背最長肌和后腿肌組織中的表達量較低，而在背脂中表達量最高（圖1-A），并且在背最長肌組織中，犢牛的FoxO1表達量顯著高于成年牛的（圖1-B）。這一結果說明，FoxO1在牛不同組織中均有表達，且在肌肉組織中表達量較低，尤其是成年后FoxO1在肌肉中的表達量下降，因此探究其在骨骼肌組織生長發育過程中的基因功能顯得尤為重要。

圖1 FoxO1 組織表達譜Fig. 1 Tissue expression profile of FoxO1

2.2 牛骨骼肌細胞的分離、培養與誘導分化

利用酶消化法成功分離得到牛骨骼肌細胞（圖2-A），當細胞生長密度達到80%以上，進行傳代培養（圖2-B），此時牛骨骼細胞形態良好，生長活力較高。在誘導分化4 d 時發現，骨骼肌細胞形成大量肌管（圖2-C），且細胞融合度較高。進一步檢測分化標志基因發現，分化早期表達基因MYOD和MYF5表達量顯著下調（圖3-A），分化中后期表達基因MYF6和MYHC表達量顯著上調（P＜0.05），MYOG雖未達到顯著水平，但其表達量呈上升趨勢（圖3-B，P>0.05）。以上結果說明此次分離的牛骨骼肌細胞純度高，且有很強的分化潛能，可用于后續試驗。

圖2 牛骨骼肌細胞分離、培養及誘導分化Fig. 2 Isolation, culture and induced differentiation of bovine skeletal muscle cells

圖3 骨骼肌細胞分化標志基因表達水平檢測Fig. 3 Detection of expression level of differentiation marker genes in skeletal muscle cells

2.3 FoxO1 亞細胞定位

利用FoxO1 抗體快速并準確標記細胞內FoxO1蛋白，再與熒光二抗Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）CY3-conjugated 相結合，得到FoxO1 免疫熒光圖（圖4-A），再通過DAPI 染色標記細胞核（圖4-B），確定FoxO1 蛋白在細胞質與細胞核內均存在，且細胞核內熒光強度高于細胞質（圖4-C）。這一結果說明FoxO1在牛骨骼肌細胞細胞質和細胞核均高表達，發揮著重要的轉錄調控作用。

圖4 FoxO1 亞細胞定位Fig. 4 Subcellular localization of FoxO1

2.4 FoxO1 過表達腺病毒的包裝

進一步包裝FoxO1過表達腺病毒，探究其對牛骨骼肌細胞增殖分化的作用。構建重組pAd-FoxO1質粒，并經PacI 酶線性化酶切鑒定，純化回收正確的質粒，利用LipofiterTM將酶切產物轉染入293A 細胞后，每天通過熒光顯微鏡觀察熒光情況。轉染后第1天，293A 細胞開始表達綠色熒光蛋白，第7 天開始出現彗星狀聚集，第9 天綠色熒光蛋白鋪滿皿底并出現空斑，待細胞脫落度達50%時，收集第一代病毒（圖5）。再用第一代病毒反復感染293A 細胞，得到效果穩定第4 代腺病毒，用于后續試驗。

圖5 FoxO1 過表達病毒P1 代包裝過程Fig. 5 Packaging process of P1 generation of FoxO1 overexpression virus

2.5 過表達FoxO1 抑制牛骨骼肌細胞G1/S 期的轉化

EdU 染色可以準確快速標記S 期細胞，并檢測細胞增殖能力。EdU 染色結果顯示，過表達FoxO1明顯降低了EdU 標記細胞數（圖6-A），然后通過ImageJ 分別統計EdU 和Hoechst 33342 所標記的細胞數，進行統計分析發現，過表達FoxO1顯著降低牛骨骼肌細胞的增殖能力（圖6-B）。利用流式細胞術檢測過表達FoxO1對牛骨骼肌細胞增殖周期的影響（圖7-A），并結合各時期細胞數的統計分析，結果表明過表達FoxO1顯著提高G1 期細胞量，而S 期和G2 期細胞量顯著降低（圖7-B），這說明過表達FoxO1抑制了細胞G1/S 期的轉化，且影響G2期細胞的生成。

圖6 EdU 檢測過表達FoxO1 對牛骨骼肌細胞相對增殖率的影響Fig. 6 EdU detected the effect of FoxO1 overexpression on the relative proliferation rate of bovine skeletal muscle cells

圖7 流式細胞術檢測過表達FoxO1 對牛骨骼肌細胞周期分布的影響Fig. 7 Effect of FoxO1 overexpression on cell cycle distribution of bovine skeletal muscle cells detected by flow cytometry

2.6 過表達FoxO1 抑制增殖相關基因的表達和促進凋亡相關基因的表達

利用qPCR 檢測FoxO1表達水平發現，FoxO1表達效率上調了159.8 倍（圖8-A），說明所構建的過表達腺病毒可以極顯著上調FoxO1的表達。為進一步研究過表達FoxO1對細胞增殖的影響，檢測細胞增殖相關基因PCNA、CDK1、CDK2、CCNA2、CCNB1、CCND1、CCNE2的表達水平發現，增殖相關基因的表達水平均顯著下調（P＜0.01），說明過表達FoxO1會抑制增殖相關基因的表達（圖8-B）。此外，還檢測了過表達FoxO1對細胞凋亡相關基因的影響，其中促凋亡基因BAD和BAX表達量顯著上調，抑凋亡基因BCL2表達顯著下調（圖8-B，P＜0.05）。

圖8 qPCR 檢測相關基因表達水平Fig. 8 The expression level of related genes was detected by qPCR

2.7 過表達FoxO1 抑制牛骨骼肌細胞肌管的形成

從細胞表型來看，肌管形成數量越多和肌細胞融合度越高意味著骨骼肌細胞的分化性能越強，而骨骼肌細胞的分化性能將影響骨骼肌的生長發育。本研究中，觀察誘導分化后的牛骨骼肌細胞發現，過表達FoxO1明顯抑制了骨骼肌細胞肌管的形成，導致肌管數量減少（圖9-A 和B），并且相較于對照組，其細胞融合度下降，肌管形態更加瘦縮（圖9-C 和D）。該結果說明過表達FoxO1將會抑制骨骼肌的發育。

圖9 對照組和試驗組牛骨骼肌細胞誘導分化后的細胞形態Fig. 9 Cell morphology of bovine skeletal muscle cells after induced differentiation in control group and experimental group

2.8 過表達FoxO1 抑制牛骨骼肌細胞分化標志基因的表達

過表達FoxO1抑制了牛骨骼肌細胞肌管的形成，所以本研究進一步對骨骼肌細胞分化標志基因的表達水平進行檢測。首先，檢測誘導分化4 d 后過表達處理組FoxO1表達水平，發現其顯著上調（圖10-A，P＜0.01）。然后，檢測分化標志基因MYOD、MYOG、MYF5、MYF6和MYHC的表達水平發現，過表達FoxO1導致其顯著下調（圖10-B，P＜0.05）。這說明FoxO1能通過調控分化標志基因的表達來影響骨骼肌細胞的分化過程。

圖10 過表達FoxO1 對牛骨骼肌細胞分化標志基因的影響Fig. 10 Effects of FoxO1 overexpression on differentiation marker genes of bovine skeletal muscle cells

3 討論

3.1 FoxO1 表達模式

FoxO1在機體多種組織中廣泛表達。在mRNA 水平上檢測成年人不同組織中FoxO1的表達發現，FoxO1在骨骼肌中表達量最高，在心臟、肝臟、脾臟、肺和睪丸中也具有較高的表達水平，但在腎臟中表達量極低。此外，在豬的不同組織中研究發現，FoxO1在仔豬的心臟、網膜脂肪組織、骨骼肌、肝臟和脾臟中表達水平較高，在腎臟、肺和腹膜脂肪組織中表達水平中等，在十二指腸和皮下脂肪組織中含量較低[19]，還有研究表明，在肝臟和脂肪組織中，成年豬的FoxO1表達水平顯著低于仔豬，而在肌肉組織中則沒有顯著差異，但仍低于仔豬[20]。在本研究中，檢測成年牛不同組織中FoxO1表達水平發現，背脂中表達水平極高，肝、腎、肺、腎周脂及脾中表達水平較高，睪丸和心臟中表達偏低，而在背最長肌和后腿肌中表達水平極低，說明在不同物種間FoxO1在不同組織中的表達存在一定差異，并且FoxO1在內臟組織中的表達可能較為穩定，對維持機體代謝穩定具有重要作用。此外，比較成年牛與犢牛的背最長肌組織中FoxO1表達水平發現，犢牛FoxO1表達水平顯著高于成年牛，說明FoxO1可能在犢牛骨骼肌生長發育過程中起到重要調控作用，而在骨骼肌發育成熟的成年牛中作用較小，從而推斷FoxO1會差異性調控不同時期骨骼肌的生長發育。

為探究FoxO1 在牛骨骼肌細胞中的表達模式，通過亞細胞定位，發現FoxO1 在細胞核與細胞質中均有表達，意味著FoxO1 可能在細胞核與細胞質中均發揮轉錄調控作用，而細胞核內的熒光強度高于細胞質，則說明FoxO1 主要在牛骨骼肌細胞的細胞核內發揮其生物學功能，從而調控其增殖、分化以及凋亡等細胞生命活動。其他研究發現，在前列腺癌細胞的細胞核內FoxO1 與FHL2相互作用，可促進FoxO1 的去乙酰化過程并抑制其轉錄活性，起到抑制細胞凋亡的作用；乙酰轉移酶相關因子PCAF能夠與磷酸化的FoxO1 相結合，誘使FoxO1 轉錄因子乙酰化并將其限制在細胞核內，調控FoxO1的表達[21]；在C2C12 細胞中研究發現細胞無論處于增殖狀態還是分化狀態，FoxO1 都首先定位在其細胞核中，而細胞質中FoxO1 轉錄因子的積累是其入核過程阻斷所導致的，并且這種阻斷有助于C2C12 細胞的分化[22]。因此，轉錄因子FoxO1在細胞質與細胞核之間存在活性差異，并對其在細胞生命過程中的調控作用具有重要影響，而且這種易位與FoxO1 翻譯后修飾密切相關[23-24]。因此，通過對FoxO1 進行核質定位，能夠用于判斷其是否發揮其調控細胞生命活動的作用。

3.2 FoxO1 調控骨骼肌細胞增殖、凋亡與分化過程

FoxO1 轉錄因子可調控細胞的增殖、凋亡、分化和代謝過程[25]，對于細胞的生存與功能實現具有重要作用。細胞周期（包括G1、S、G2 和M 期）各階段受到細胞周期蛋白（cyclins，CCN）和細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent Kinases，CDK）的聯合調控[26]。CCN 主要有CCNA、CCNB、CCND 和CCNE 4 種類型，CDK 包括CDK1、CDK2、CDK4 和CDK6。CDK1 與CCNA、CCNB 形成復合物可促進G2/M 期轉化及M 期進展，而FoxO1 可與CDK1 結合形成復合物并抑制細胞G2/M期轉變；CDK2與CCNE、CCNA形成復合物從而促進G1/S 期轉化和S 期進展，且CDK2 能夠特異性磷酸化FoxO1，從而抑制FoxO1 的促細胞凋亡功能[27]。在牛顆粒細胞中過表達MicroRNA-183-96-182 通過抑制FoxO1的mRNA 和蛋白水平來促進細胞增殖，且G1 期細胞比例下降，S期細胞比例增加，這與利用小干擾RNA 敲低FoxO1的結果相一致[28]。在本研究中，利用OE-FoxO1感染牛骨骼肌細胞后成功地提高了FoxO1mRNA 的表達，檢測發現牛骨骼肌細胞增殖率降低，且細胞停滯在G1期，S 期細胞比例顯著減少，qPCR 檢測CDK 和CCN的表達水平發現均顯著下調，這與前人的研究結果相一致，說明在牛骨骼肌細胞中，FoxO1 基因表達水平提高將會抑制其細胞增殖。對于細胞的存活與凋亡，BAD、BAX 和BCL2 具有重要調控作用。BAD和BAX 與促凋亡活性相關，BCL2 則起到保護細胞、抑制其凋亡的作用，CIFARELLI 在小鼠內皮細胞中過表達FoxO1后發現，BCL2 的蛋白水平顯著降低，BAD 和BAX 的蛋白水平顯著上調[29]。在本試驗中，通過檢測過表達FoxO1的骨骼肌細胞中BAD、BAX和BCL2的mRNA 表達水平得到了相似的結果，說明牛骨骼肌細胞中FoxO1過表達會促進其細胞凋亡的發生。

MRFs 是調控干細胞成肌分化的主要轉錄因子，通過調節肌源性基因和非肌源性基因的表達來調節肌生成過程[8]。在動物出生后，肌肉基本發育成熟，肌生成依賴于肌衛星細胞來維持組織穩態，當肌損傷發生時，肌衛星細胞被激活，MRFs 表達上調，使肌衛星細胞迅速增殖并分化為成肌細胞。在調控成肌分化過程中，MYOD和MYF5在細胞未分化階段或分化早期便高度表達，參與細胞成肌分化的決定，而MYOG和MYF6則在細胞分化中期或晚期表達，是分化后期所必需的基因[30]。肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MYHC）是肌球蛋白的重要組成部分，在細胞分化終末期合成，是成肌分化的重要標記物[31]。為鑒定所分離細胞為牛骨骼肌細胞，對其進行誘導分化后，細胞形成大量肌管，通過檢測分化標志基因，發現分化早期標志基因MYOD和MYF5表達量下調，而終后期表達基因MYF6和MYHC上調，證明所分離細胞具有良好的成肌分化性能。在牛骨骼肌細胞中過表達FoxO1后，對其進行成肌誘導分化，其肌管的形成量減少，并且MYOD、MYOG、MYF5、MYF6和MYHC表達量均顯著下調，推測FoxO1可能是通過抑制分化早期基因的表達，進而阻斷骨骼肌細胞分化過程的進行，達到抑制其分化的目的。

4 結論

FoxO1在牛的不同組織中均發揮著調控作用，且在背最長肌組織生長發育不同階段差異性表達；FoxO1 可能主要在牛骨骼肌細胞的細胞核內發揮其轉錄調控作用；過表達FoxO1可能通過抑制細胞增殖相關基因和肌細胞分化標志基因的表達，進而抑制牛骨骼肌細胞的增殖與分化，并且可通過上調促凋亡基因的表達和下調抑凋亡基因的表達來促進細胞凋亡。