干旱條件下玉米轉座子插入關聯的表觀調控分析

高晨曦，郝陸洋，胡悅，李永祥，張登峰，李春輝，宋燕春，石云素，王天宇，黎裕，劉旭洋

中國農業科學院作物科學研究所/作物基因資源與育種全國重點實驗室，北京 100081

0 引言

【研究意義】全球人口數量在2050 年預計將增長至97 億，需要穩定增長糧食產量來養活不斷增長的人口[1]。然而，隨著全球氣候的不斷變化，作物生產越來越受到環境脅迫的限制，其中，干旱是最嚴重的脅迫因素之一[2-3]。玉米（ZeamaysL.）是世界范圍最主要的糧食作物之一，也是我國種植面積最大、總產量最高的糧食作物，其生產高度依賴于充足的水肥。隨著不斷高產育種的改良，在過去的二十年間玉米的單產增加了大約50%[4]，然而，其對干旱的敏感程度也隨之顯著增加[5]。因此，提高抗旱性是玉米育種的重要目標。【前人研究進展】在玉米中，許多復雜性狀的遺傳變異是由順式調控元件或表觀遺傳調控等調控變異控制[6]。Teosintebranched1（tb1）是一個典型的順式調控變異控制玉米馴化表型的例子，tb1上游60 kb 的一個轉座子插入能夠增強其基因的表達并抑制分蘗的產生[7-8]。ZmCCT是水稻Ghd7的同源基因，ZmCCT順式調控變異影響玉米在不同日照條件下的開花期[9-10]。一個Harbinger轉座子插入能夠抑制另一個CCT 基因ZmCCT9的表達，并且這個轉座子插入在玉米對高緯度的適應及改良過程中受到顯著的選擇[11]。在玉米抗旱性方面，已克隆的ZmNAC111和ZmVPP1也均是通過基因表達變異調控玉米的抗旱性。MAO 等[12]通過全基因組關聯分析挖掘出候選基因ZmNAC111，進一步分析發現在ZmNAC111啟動子區域的一個微型倒置重復轉座元件（miniature inverted-repeat transposable element，MITE）通過RNA介導的DNA 甲基化抑制了該基因的表達，從而調控玉米的苗期抗旱性。而在ZmVPP1啟動子區域一個360 bp 的插入序列攜帶有3 個MYB 轉錄因子順式調控元件，該元件賦予了ZmVPP1的干旱誘導表達能力并提高了玉米的抗旱性[13]。SUN 等[14]利用玉米關聯群體在不同水分處理下開展了大規模干旱響應sRNA 鑒定，通過eGWAS 獲得了29 個eQTL 熱點，并克隆了位于第8 染色體的干旱特異性超級熱點DRESH8，進一步分析發現DRESH8由一個Gypsy轉座子組成，DRESH8的存在缺失變異調控了不同環境下玉米抗旱與產量的平衡。在真核生物中，轉座子主要分為反轉錄轉座子（retrotransposon）和DNA 轉座子（DNA transposon）[15]。反轉錄轉座子由3 個家族組成，即長末端重復（long terminal repeat，LTR）反轉錄轉座子、長散在重復元件（long interspersed nuclear element，LINE）和短散在重復元件（short interspersed nuclear element，SINE），主要通過“復制-粘貼”機制進行復制。而DNA 轉座子通過“剪切-粘貼”機制復制，包括2 個家族，即末端反向重復（terminal inverted repeat，TIR）轉座子和Helitron。基因組Illumina 重測序是識別不同基因型間轉座子插入缺失變異的一種經濟有效的方法，盡管較小的測序讀長在重復序列比對上具有一定的挑戰。目前，利用Illumina 測序序列鑒定基因組轉座子插入缺失變異主要有2 種策略。第一種策略是將測序序列比對至參考基因組，根據參考基因組的轉座子注釋信息鑒定轉座子插入缺失，這類分析方法主要包括Jitterbug[16]、BreakDancer[17]和TEMP[18]等。第二種策略是首先將原始的測序數據比對至轉座子序列篩選潛在的包含轉座子的測序序列，然后將篩選后的序列比對至參考基因組鑒定轉座子的插入位置，這類方法主要包括RelocaTE[19]、ITIS[20]和TRACKPOSON[21]等。DNA 甲基化是主要的表觀遺傳修飾方式之一[22]。在植物基因組中，轉座子插入區域往往呈現CG 和CHG（H 代表A、T 或C 堿基）位點高度的DNA 甲基化水平[23]。其中Methyltransferase1（MET1）主要催化CG 中的5-甲基胞嘧啶，Chromomethylase3（CMT3）催化CHG位點的DNA 甲基化[24-25]。而CHH 的甲基化主要有2種途徑，一是通過Domains Rearranged Methylase 2（DRM2）參與的RNA 介導的DNA 甲基化；二是CMT2 與Decreased DNA Methylation1（DDM1）共同控制的不依賴RNA 途徑[26-27]。甲基化變異影響的基因表達變化是調控玉米表型變異的重要方式。TIAN等[28]利用抗旱玉米自交系CIMBL55 和B73、Mo17 等開展全基因組DNA 甲基化分析，在轉錄因子基因ZmNAC075對的啟動子區域檢測到差異的DNA 甲基化水平，在該基因B73 等位上游的2 個插入變異導致該等位基因比CIMBL55 的等位基因具有更高的CG、CHG 和CHH 甲基化水平，而在干旱脅迫下CIMBL55等位ZmNAC075的表達量顯著高于攜帶B73 等位的種質。此外，DNA 甲基化變異在玉米重要性狀形成和選擇馴化中的作用也得到進一步闡明[28-31]。【本研究切入點】轉座子介導的DNA 甲基化等表觀修飾變異是調控表型變異的重要方式，并且在玉米的馴化和改良中得到有效利用，玉米抗旱性相關的全基因組轉座子變異關聯的DNA 甲基化和基因表達機制還有待進一步的深入解析。【擬解決的關鍵問題】本研究利用抗旱性極端差異的玉米自交系，開展全基因組的轉座子插入缺失變異檢測和田間不同水分處理下全基因組DNA 甲基化和轉錄組分析，解析轉座子介導的DNA甲基化在玉米抗旱中的調控作用，為玉米抗旱種質改良和品種培育提供理論支撐和基因資源。

1 材料與方法

1.1 田間抗旱性鑒定

共選取實驗室前期鑒定的抗旱性具有表型差異的8 個代表性自交系H082183、GM517、GH065、CN165、CML103、K12、昌7-2 和旅28 開展田間抗旱性鑒定，在中國農業科學院作物科學研究所昌平實驗站利用自動雨棚開展田間試驗。采取隨機區組試驗設計，設干旱和正常水分2 個處理和6 個重復，每個小區為兩行區，行長3 m，行距0.6 m，每行種植11 個單株。干旱和正常水分處理均使用滴灌系統控制灌溉量，干旱處理在播種后灌溉一次，水量為450 m3·hm-2，此后停止澆水至試驗結束；正常水分處理在播種后灌溉一次，此后每2 周灌溉一次，水量為600 m3·hm-2，有降雨時，2 種處理均使用旱棚設施進行遮雨。播種后5 周，當干旱處理下部分材料開始呈現明顯的葉片卷曲時，取葉片測量葉片相對含水量，測量方法參考ZHANG 等[32]。同時取葉片和根系樣品，每個重復5個單株混樣，使用液氮迅速冷凍，并保存至-80 ℃備用。在開花期記錄散粉期和吐絲期，在每行有超過一半植株散粉或吐絲當日記錄為散粉期或吐絲期，并計算散粉-吐絲間隔。根據表型鑒定的結果，選取抗旱自交系H082183 和干旱敏感自交系旅28 進行下一步的組學分析。

1.2 基因組DNA 測序與轉座子插入鑒定

取自交系H082183 和旅28 的幼苗樣品，采用CTAB 法提取DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的降解和污染情況，使用NanoPhotometer 分光光度計（IMPLEN）檢測DNA 純度，滿足標準OD260/280＞1.8 和OD260/230＞2.0 的DNA 樣品用于下一步測序文庫的制備。利用NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina 試劑盒（NEB）制備DNA 測序文庫，并使用Illumina NovaSeq 平臺開展測序分析。利用fastp軟件[33]進行測序數據質量控制獲得clean reads。基因組測序數據已上傳至NCBI 數據庫（PRJNA1017638）。采用TRACKPOSON 軟件進行全基因組轉座子插入鑒定，首先將clean reads 比對至已知的玉米轉座子序列獲取候選的包含有轉座子序列的reads，比對利用Bowtie2 軟件[33]進行，玉米轉座子序列下載自TREP數據庫（http://botserv2.uzh.ch/kelldata/trep-db）、PGSBREdat 數據庫（https://pgsb.helmholtz-muenchen.de/plant/recat）和Maize TE Annotations 數據庫（https://mcstitzer.github.io/maizeTEs）。將含有轉座子序列的reads 比對至玉米 B73_V4 參考基因組[34]（www.maizegdb.org），獲取轉座子的插入位置。

1.3 全基因組甲基化測序

針對玉米自交系H082183 和旅28，在田間試驗的6 個重復中隨機挑選2 個重復的葉片和根系樣品，利用全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（whole genome bisulfite sequencing，WGBS）技術開展基因組甲基化分析。采用CTAB 法提取基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 樣品的降解和污染情況，使用NanoPhotometer 分光光度計（IMPLEN）檢測DNA 純度，滿足標準OD260/280＞1.8 和OD260/230＞2.0 的DNA樣品用于下一步測序文庫的制備。使用Covaris S220（Covaris）將DNA 樣品切割為平均長度為200—300 bp 的片段并進行3′端腺苷化處理，將胞嘧啶甲基化barcode 連接到DNA 片段上，并使用EZ DNA 甲基化金試劑盒（ZYMO RESEARCH, USA）進行亞硫酸氫鹽轉化處理，將未甲基化的胞嘧啶（C）轉化為尿嘧啶（U）。隨后使用KAPA HiFi HotStart Uracil+ Kit試劑盒（Roche, SUI）構建測序文庫，并使用Illumina Hiseq X TEN 平臺進行測序分析。甲基化測序數據已上傳至NCBI 數據庫（PRJNA688754）。采用Bismark軟件[35]開展測序序列的比對分析，參考基因組為V4版B73 參考基因組。利用DSS 軟件[36]和R 語言的methylKit 包[37]開展差異甲基化區域分析，顯著差異的標準為甲基化差異＞20%并且FDR＜0.05。

1.4 轉錄組測序

利用以上甲基化測序使用的相同葉片和根系組織開展轉錄組測序分析。采用TRIzol 法提取樣品的總RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳和NanoPhotometer 分光光度計（IMPLEN）檢測RNA 樣品的完整度和純度，利用滿足標準OD260/280＞2.0、OD260/230＞2.0 和RIN＞6.5的RNA 樣品用于下一步的建庫測序。采用NEBNext UltraTMRNA Library Prep Kit for Illumina（NEB）試劑盒進行測序文庫的構建，并使用Illumina Hiseq X 平臺開展測序分析。轉錄組測序數據已上傳至NCBI 數據庫（PRJNA1017679）。質控過濾得到的clean reads通過Hisat2 軟件[38]比對至玉米B73_V4 參考基因組。利用featureCounts 軟件[39]計算基因的reads count 和FPMK 值，采用DESeq2 軟件[40]鑒定差異表達基因，差異表達基因的鑒定標準為log2(fold change)＞1 或＜-1 以及FDR＜0.05。基因共表達網絡分析根據WGCNA 軟件[41]開展，其中soft-threshold power 設為9，cut-off threshold 設為0.9，minimal module size設為30。利用GOseq 軟件[42]開展GO 注釋和富集分析。

1.5 RT-qPCR 分析

在李燕等[43]田間試驗中，在V12 期對不同水分處理下的H082183 和旅28 葉片和根系組織進行取樣，共3 個生物學重復，每個重復5 個單株混樣。總RNA提取采用RNA Easy Fast 植物組織RNA 快速提取試劑盒（天根），cDNA 文庫構建采用One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（全式金），使用 SYBR qPCR Master Mix（諾唯贊）和 ABI Quantstudio3 實時熒光定量PCR 儀（ThermoFisher）開展ZCN7的RT-qPCR 分析。ZCN7的RT-qPCR 引物為5′-CCACTGCATGGCTACACTATATAAT-3′和5′-CTTGGAGAATACTTTGTCTGATTAATCA-3′，內參基因GAPDH的引物為5′-CCCTTCATCACCACGG ACTAC-3′和5′-AACCTTCTTGGCACCACCCT-3′，采用2-??Ct法計算基因的表達量，每個樣品3 次重復。

2 結果

2.1 田間抗旱性表型分析

在田間干旱和正常水分處理下開展8 個代表性自交系的葉片相對含水量測定，結果表明，在正常水分處理下，所有材料的葉片相對含水量均在93%以上。而在干旱處理下，除H082183 外，其他自交系的葉片相對含水量均較正常處理顯著（P＜0.05）下降，其中，旅28 的葉片相對含水量僅為76.7%（圖1-A）。干旱會導致玉米雌雄花發育不協調，造成花期不遇授粉困難從而影響籽粒產量。對8 個自交系的散粉-吐絲間隔鑒定結果表明，H082183、GM571、K12 在干旱和正常水分處理下的散粉-吐絲間隔差異不顯著，而其他自交系在干旱下的散粉-吐絲間隔顯著大于正常水分環境。其中，H082183 在干旱下的散粉-吐絲間隔最小，平均僅為0.69 d，而旅28 的散粉-吐絲間隔最大，平均為6.20 d（圖1-B）。以上結果表明，H082183 的抗旱性較強，而旅28 在所有試驗材料中表現出最差的抗旱性。

圖1 田間抗旱表型分析及抗旱性差異自交系的基因組轉座子插入和DNA 甲基化水平分析Fig. 1 Drought tolerance-related phenotype and genomic distribution of variable transposable element insertions and DNA methylation levels

2.2 H082183 和旅28 的基因組轉座子插入缺失變異分析

選取抗旱自交系H082183 和干旱敏感自交系旅28，利用Illumina 測序平臺開展30X 深度的全基因組重測序，利用TRACKPOSON 算法分析2 個基因組中的轉座子插入缺失變異。在H082183 和旅28的基因組中分別鑒定到333 754 和333 296 個轉座子插入（表1）。其中數量最多的是Gypsy和Copia類的LTR 反轉錄轉座子，從基因組的分布情況來看，Copia轉座子在整個基因組區域均有分布，而Gypsy轉座子大多分布在富含重復序列的著絲粒區域（附圖1）。此外，通過H082183 和旅28 基因組的比較分析，共檢測到89 954 個轉座子插入缺失變異（圖1-C）。

表1 H082183 和旅28 基因組中轉座子插入數量Table 1 Transposable element insertions of each superfamily in H082183 and Lü28 genomes

2.3 H082183 和旅28 的全基因組DNA 甲基化分析

通過對2 個玉米自交系的全基因組甲基化測序共獲得50.4 億測序片段，平均每個測序樣本3.15 億測序片段。全基因組甲基化測序分別覆蓋了H082183和旅28 基因組49.0%和46.9%的胞嘧啶堿基位點。從甲基化位點分布情況來看，玉米基因組中的DNA甲基化主要為CG 和CHG 位點，而CHH 甲基化所占的比例較小（圖2-A）。CG 和CHG 位點在轉座子、內含子和基因啟動子區域有較高的甲基化水平，而在外顯子和非編碼區域的甲基化水平較低；CHH 位點在啟動子區域具有較高的甲基化水平，而在轉座子、基因編碼區和非編碼區的甲基化水平較低（圖2-B—D）。對轉座子的進一步分析發現，CG 和CHG甲基化水平在轉座子插入位點保持較高的水平，而隨著距離轉座子插入位點的增大而減小，在超過50 kb距離時快速衰減（圖3-A—B）。

圖2 不同基因組區域的DNA 甲基化水平Fig. 2 DNA methylation levels in different genomic regions

圖3 轉座子DNA 甲基化水平和差異甲基化分析Fig. 3 DNA methylation levels around transposable element and differentially methylated regions

通過干旱下2 個玉米自交系葉片和根系組織基因組甲基化水平的比較分析，共檢測到41 352個CG 和CHG 差異甲基化區域（圖3-B）。其中16.9%的CG 差異甲基化區域位于基因內部，22.5%的CG 差異甲基化區域位于基因啟動子；11.7%的CHG 差異甲基化區域位于基因內部，17.3%的CHG差異甲基化區域位于基因啟動子。此外，60.6%和70.9%的CG 和CHG 差異甲基化區域均位于基因間區（圖3-C）。對轉座子插入缺失變異和差異甲基化進行對比分析，發現60%的差異甲基化區域位于轉座子插入缺失變異的上下游 5 kb 范圍內（圖3-D）；如果將轉座子插入缺失變異的上下游范圍擴大至50 kb，95%的差異甲基化區域將位于此區間內（附圖2）。

2.4 H082183 和旅28 的轉錄組分析

利用甲基化測序的相同樣品開展轉錄組測序，并與全基因組甲基化結果進行比較分析。結果表明，基因表達水平與CG 和CHG 甲基化水平負相關，表達量較高的基因在基因區域及基因上下游區間均具有較低的CG 和CHG 甲基化水平，并且2 個自交系間的基因表達差異倍數與基因甲基化差異倍數顯著負相關（圖4-A—B）。通過差異表達分析共檢測到干旱條件下H082183 和旅28 在葉片和根系中的差異表達基因4 196和3 500個，其中821（19.5%）和690（19.7%）個差異表達基因與差異甲基化區域關聯（圖4-C）。對差異甲基化關聯的差異表達基因進行GO 注釋和富集分析，發現這些基因在質膜相關的GO 條目中顯著富集（圖4-D）。此外，一些DNA 甲基轉移酶和DNA 去甲基酶等相關基因在2 個自交系間的表達量具有差異，如，旅28 中ZmCMT2a和ZmDRM2a的表達量在不同水分處理和不同組織中均顯著高于H082183，而ZmRDDM3a在H082183 葉片中的表達量顯著高于旅28（圖5）。

圖4 差異甲基化和差異表達基因比較分析Fig. 4 Comparison analysis of differentially methylated regions and differentially expressed genes

圖5 DNA 甲基化酶和去甲基化酶的基因表達分析Fig. 5 Expression levels of DNA methyltransferase and demethylase genes

2.5 轉座子插入介導的ZCN7 基因表觀調控分析

實驗室前期利用H082183 和旅28 克隆了一個控制玉米花期抗旱性的關鍵基因ZCN7[43]，對2 個自交系中ZCN7附近的轉座子插入、DNA 甲基化和其基因表達進行分析。在ZCN7上下游基因組區域檢測到3個轉座子插入缺失變異，均在旅28 中存在而H082183基因組中缺失。3 個轉座子為LTR 類轉座子，其中一個轉座子位于ZCN7上游約33.2 kb 處，2 個轉座子位于ZCN7下游約5.2 和10.1 kb 處（ZCN7在參考基因組中的方向為從右至左，即上游序列在右側，下游序列在左側）。自交系旅28 中ZCN7周圍的轉座子插入導致其DNA 甲基化水平顯著高于H082183，其中，ZCN7上游35 kb 至下游11 kb 的區域在干旱和正常水分處理的葉片中均被鑒定為CG和CHG差異甲基化區域（圖6-A）。

圖6 轉座子插入介導的ZCN7 表觀調控分析Fig. 6 Transposable element insertion associated epigenetic regulation of ZCN7

轉錄組測序結果表明，在干旱和正常水分處理下ZCN7在H082183 葉片中的表達量均顯著高于旅28，根據以上結果推測其在旅28 較高DNA 甲基化水平抑制了ZCN7基因的表達（圖6-B）。為了驗證這一結果，利用前期田間抗旱試驗[43]中H082183 和旅28 的葉片和根系樣品開展ZCN7表達量的RT-qPCR分析，同樣，結果表明，不同水分處理下ZCN7在H082183 的表達量顯著高于旅28（圖6-C）。此外，轉錄組和RT-qPCR 結果均表明，ZCN7主要在葉片中表達，而在根系中的表達量較低。

為了進一步解析ZCN7 的抗旱調控機制，利用H082183 和旅28 在不同水分處理下的轉錄組數據和WGCNA 算法構建基因共表達調控網絡，結果表明，與ZCN7共表達的基因包括有脫落酸合成關鍵限速酶基因CarotenoidCleavageDioxygenase4b（CCD4b）、液泡膜水通道蛋白基因TonoplastIntrinsicProtein4（TIP4）、環核苷酸門控通道蛋白基因CyclicNucleotide-Gated ChannelProtein15（CNGC15）、擴展蛋白基因α-Expansin11（EXPA11）、神經酰胺激酶基因AcceleratedCellDeath6（ACD6）、蛋白激酶基因ConstitutiveTripleResponse2（CTR2）、鋅指蛋白基因AZF2、轉錄因子基因bZIP15等。

3 討論

3.1 轉座子插入缺失變異是調控玉米性狀變異的重要方式

自MCCLINTOCK[44]在1950 年首次在玉米中發現轉座子以來，越來越多的研究表明，轉座子在不同物種的基因組中廣泛存在并在表型變異調控中發揮重要作用。玉米基因組中大多數序列是由轉座子組成的，并且呈現出高度多樣性的轉座子插入缺失變異，如ANDERSON 等[45]在4 個玉米基因組間共鑒定出超過40 萬個轉座子插入缺失變異，這些轉座子變異占玉米基因組的72%。本研究利用抗旱性具有顯著差異的玉米自交系H082183 和旅28，利用全基因組重測序方法在H082183 和旅28 的基因組中分別鑒定到333 754和333 296 個轉座子插入，2 個自交系間多樣性的轉座子占基因組的19.6%（圖1 和表1）。這一結果與ANDERSON 等[45]在玉米B73、W22、Mo17 和PH207基因組中檢測到的轉座子插入數量（分別為338 224、314 413、301 722 和238 826）較為一致，表明本研究所使用的轉座子插入檢測方法較為可靠。鑒于轉座子插入缺失變異在玉米基因組中的龐大數量和規模，其往往與重要的表型變異相關聯。例如ZmNAC111啟動子區域的一個MITE 轉座子插入能夠調控其基因表達并控制玉米苗期抗旱性[12]。Vegetativetogenerative transition1（Vgt1）中的一個MITE 轉座子插入缺失與玉米的開花期顯著關聯[46]。ZmCCT9上游57 kb 處的一個Harbinger轉座子插入在長日照條件下能夠促進開花[11]。此外，轉座子插入也是一種獲得突變的有效方式，在反向遺傳學和功能基因組研究中發揮了重要的作用，如Mutator（Mu）插入和Activator/Dissociation（Ac/Ds）插入是玉米常見的突變體庫構建方法[47-49]。

3.2 轉座子可以通過多種途徑調控基因功能

轉座子影響基因功能主要有以下幾種方式，其主要由轉座子的插入位置決定的。第一種是轉座子插入到基因內部能夠改變基因的轉錄本，從而產生基因的功能缺失突變。如玉米U6biogenesis-like1（UBL1）內含子區的一個Mutator轉座子插入影響其mRNA 的剪切，產生了ubl1功能缺失突變體并表現籽粒減小的表型性狀[50]。然而，轉座子插入產生的新轉錄本也有一定的概率會產生新的生物學功能。ZmACS7編碼一個乙烯合成途徑中的1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC）合酶，其外顯子區域的Mutator轉座子插入產生新轉錄本編碼的蛋白具有增強的蛋白穩定性而不影響其催化活性，從而增強了乙烯的合成并顯著降低玉米株高[51]。此外，近期研究表明轉座子插入也可以通過影響蛋白的翻譯效率調控蛋白的表達量，BTA（B73 active TE hAT）插入到糖轉運蛋白基因ZmSWEET4c的外顯子，通過產生uORF 及其自身的二級結構抑制了ZmSWEET4c的翻譯效率和蛋白豐度，從而導致玉米籽粒大小改變[52]。第二種是轉座子插入在基因上下游區域可以干擾基因的順式調控元件從而影響基因的表達。例如以上提到的開花期關鍵調控基因ZmCCT9，其上游57 kb的Harbinger轉座子插入就是通過長距離的順式調控抑制基因的表達[11]。此外轉座子插入也可能產生新的啟動子或增強子而增強基因的表達。玉米株型調控關鍵基因tb1上游的LTR 轉座子插入產生了新的增強子并顯著提高tb1的基因表達量[8]。第三種是轉座子插入往往與高度的DNA 甲基化關聯，從而通過表觀遺傳調控抑制了周圍基因的表達。一個經典的案例是Vgt1中的MITE 轉座子插入改變了其DNA甲基化水平，而Vgt1是花期抑制基因ZmRap2.7上游70 kb 的非編碼調控元件[46]。NOSHAY 等[23]利用4 個玉米基因組比較分析了轉座子插入缺失多樣性與DNA 甲基化水平差異，發現LTR 和TIR 家族的轉座子大多具有高度的CG 和CHG 甲基化水平，并且發現大多數插入至非甲基化區域的轉座子改變了其插入位置的甲基化水平。本研究結果表明，高達60%的差異甲基化區域位于轉座子插入缺失變異的上下游5 kb范圍內（圖3），此外約有20%的差異表達基因與差異甲基化區域重疊（圖4），這一結果說明轉座子插入缺失介導的DNA 甲基化變異在玉米表觀修飾調控中占重要地位。

3.3 轉座子插入缺失介導的ZCN7 表觀調控模式拓展了玉米抗旱性的分子機制

FlowerLocusT（FT）和TerminalFlower1（TFL1）是擬南芥中調控開花的核心節點基因，FT和TFL1為同源基因，均編碼磷脂酰乙醇胺結合蛋白（PEBP），但在調控擬南芥開花過程中具有拮抗作用[53-54]。在玉米基因組中有25 個FT/TFL1 的同源基因被命名為ZEA CENTRORADIALIS（ZCN），包括15 個FT 類基因、6 個TFL1 類基因和3 個MOTHER OF FT AND TFL1（MTL1）類基因[55]。其中報道較多的是ZCN8，該基因與indeterminate1（id1）和ZmMADS69的互作調控能夠控制玉米花期，并在玉米對高緯度的馴化過程中受到選擇[56-57]。玉米ZCN 基因家族中ZCN7與ZCN8具有最相似的蛋白序列和基因表達調控模式[58]。本試驗前期對ZCN7的研究發現，該基因主要在玉米葉片中表達，在V12 期的葉片中表現出表達峰值；通過ZCN7過表達轉基因玉米的抗旱表型鑒定發現，過表達ZCN7能夠顯著縮短干旱下的散粉-吐絲間隔并提高玉米籽粒產量[43]。本研究利用抗旱性差異自交系H082183 和旅28，對ZCN7和上下游區域的轉座子插入、DNA 甲基化變異以及基因表達網絡等進行了綜合分析，發現旅28 中ZCN7附近的3 個LTR 轉座子插入導致其DNA 甲基化程度顯著高于H082183，較高的DNA 甲基化水平抑制了旅28 中ZCN7的表達，在此基礎上提出了轉座子插入缺失變異介導的ZCN7表觀調控模式（圖6-E）。同時通過基因共表達分析獲得了一批不同水分處理下與ZCN7共表達的候選基因。這些結果為進一步闡明ZCN7調控玉米抗旱性的分子機制提供了理論支撐。

4 結論

田間抗旱性鑒定篩選出抗旱自交系H082183 和干旱敏感自交系旅28，在2 個自交系間共鑒定出89 954個轉座子插入缺失變異、41 352 個差異甲基化區域和4 196 個干旱下差異表達基因。抗旱自交系中抗旱基因ZCN7周圍的3 個轉座子缺失導致其較低的DNA 甲基化水平和較高的基因表達量。