基于主成分分析的冰溫氣調包裝對松露的品質指標及相關性影響

戴 雅，譚興怡，李 翔,2,*，伍一有，黃 博，吳新源，王建輝,2，劉達玉,2,*

（1.成都大學食品與生物工程學院，四川 成都 610106；2.成都大學國家食物營養教育示范基地，四川 成都 610106；3.成都運荔枝科技有限公司，四川 成都 610041）

松露（Tuber melanosporum）是屬于塊菌屬的真菌，是盤菌目Pezizales家族的外生菌根子囊菌之一，生長于地下，與樹木和灌木的根密切相關[1]。據報道，即使將其放在4 ℃條件下貯藏，松露的品質也會迅速下降[2]。許多研究表明冷凍[3]、冷凍干燥[4]、太陽能干燥法[5]、低壓結合冷藏[6]、輻照、涂膜[7]或氣調包裝[8]等方法可以在一定程度上有效延緩松露的貯藏期限。

冰溫貯藏是指在0 ℃至果蔬冰點之間的窄溫區貯存，并且可以在不損傷組織細胞的情況下有效保存營養物質和風味物質，同時還能抑制自我代謝，延長貯藏壽命，是提高果實品質的一種貯藏保鮮技術。氣調貯藏是通過調控采后果實貯藏環境中O2、CO2和N2等氣體比例，達到延緩果實衰老、延長貯藏期的目的，是在采后儲存期間保持即食水果和蔬菜質量的常用方法[9]。氣調保鮮技術包括減壓貯藏、氣調貯藏和自發氣調貯藏3 種。

許多研究表明氣調與冷藏相結合可用作一種溫和的貯藏技術，以確保最低限度加工的水果和蔬菜的安全[10]。雖然氣調保鮮技術和冰溫貯藏技術都已經成為延長果蔬保鮮期及提高貯藏品質的有效措施，但冰溫結合氣調處理對松露的貯藏品質的影響尚不明確。長期以來，松露的產量較低、價格昂貴，因其營養價值高、風味獨特而廣受歡迎，但新鮮松露極易腐爛，不耐貯藏，保質期在一周左右[11]。其采后貯藏保鮮問題限制了產業的快速發展，因此，通過把冰溫與氣調保鮮技術相結合的措施延長松露保鮮時間，將具有重要意義。本實驗在-（4.4±0.2）℃冰溫條件下結合40% O2+60% CO2氣調處理，在貯藏過程中觀察松露多項生理指標的變化及其相關性，探討冰溫氣調處理對其品質的影響，以期為采后松露的貯藏保鮮技術提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試樣品購自四川品高農產有限公司（產自攀枝花會理縣），挑選大小均勻、無病蟲害、無機械損傷、成熟度相近的個體，使用超純水搽洗后放置層流空氣中干燥。所用試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設備

YH-101S手持探針式數字溫度計 江蘇浩源科技公司；TA.XT Plus質構儀 英國Stable Micro Systems公司；AUCMA頂開式轉換型冷藏冷凍柜 澳柯瑪股份有限公司；CS-410彩譜便攜式色差儀 東莞市科聯電子有限公司；MAP-450氣調包裝機 浙江瑞寶包裝機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理與實驗分組設計

將篩選后的松露分為冰溫貯藏對照組（CK組）、冰溫貯藏結合CA保鮮技術實驗組（冰溫貯藏，40% O2+60% CO2）（A組）。CK組和A組分別分裝5 組樣品在氣調包裝盒中（質量為（200±20）g）。將所有組放入冷藏柜中-（4.4±0.2）℃貯藏20 d。分別在5、10、15、20 d時取樣。

1.3.2 冰點的測定

將便攜式數顯溫度計的探桿插入松露樣品的體積中心，并放置于0 ℃的冰水混合物中，于-20 ℃冰箱，記錄數據，并作松露中心溫度隨時間變化的曲線圖[12]。當松露中心溫度開始快速下降至0 ℃以下后，溫度出現輕微回升的現象，隨后溫度趨于平緩，最后出現緩慢下降，此拐點溫度作為松露的冰點溫度。

1.3.3 質量損失率、水分質量分數、腐爛率的測定

采用稱重法測定松露質量損失率[13]，按式（1）計算：

式中：m1為松露貯藏前質量/g；m2為松露貯藏后質量/g。

水分質量分數的測定參考GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》，按式（2）計算：

式中：m1為玻璃皿和樣品的質量/g；m2為玻璃皿和樣品干燥至恒質量后的質量/g；m3為玻璃皿的質量/g。

參照蔣方國等[14]方法，將軟化、霉變、發黏及異味等現象作為松露腐爛的指示標準，腐爛率按式（3）計算：

式中：X1為腐爛個數；X2為處理總數。

1.3.4 多糖、總多酚、總黃酮含量的測定

多糖含量的測定參照倪旭東[15]的方法略作修改，取樣液2 mL，加8 mL無水乙醇，4000 r/min離心10 min后，傾去上清液，再加10 mL 80%乙醇，同樣條件離心5 min，重復2 次，將沉淀用蒸餾水溶解并轉移至100 mL容量瓶中定容。取樣品溶液2 mL于試管中，加入現配的5%苯酚試液并振蕩，混勻后迅速加入5 mL的濃硫酸，放置5 min后置于沸水浴中再保持60 min，利用不同濃度的蔗糖溶液制作標準曲線，樣液于490 nm波長處測定吸光度并根據標準曲線計算多糖含量。

總多酚含量測定參考Popescu等[16]的方法略作修改。吸取配制好的沒食子酸母溶液1 mL，進行稀釋定容至100 mL，稀釋后的沒食子酸標準溶液質量濃度為10 μg/mL，然后準確吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL上述沒食子酸標準溶液于96 孔板中，分別加入蒸餾水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL，再各加入福林-酚試劑0.5 mL，充分振蕩后靜置3 min，分別加入1 mL 10% Na2CO3溶液，搖勻，室溫避光反應30 min。

總黃酮含量的測定參照GB/T 20574—2006《蜂膠中總黃酮含量的測定方法 分光光度比色法》。

1.3.5 粗蛋白含量的測定

參考GB/T 15673—2009《食用菌中粗蛋白含量的測定》，采用考馬斯亮藍法測定食用菌的粗蛋白含量。

1.3.6 鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）的測定

樣液的制備參考相啟森等[17]的方法，FRAP測定參考Benzie等[18]的方法。

1.3.7 質構特性的測定

選擇大小一致的松露，將其赤道面的兩個相對部位朝上放置于TA.XT plus質構儀。選用直徑2 mm的圓柱形P/2探頭做全質構分析實驗[19]。檢測的主要參數如下：測前速率1 mm/s，測試速率1 mm/s，測后速率1 mm/s，位移為5 mm，兩次壓縮停頓時間為5 s，觸發力值0.5 N。系統自動計算得到以下6 種表征樣品質構特性的評價參數：硬度、彈性、黏附性、內聚性、咀嚼度、回復性。

1.3.8 總色差值ΔE的測定

隨機選取CK組和A組松露樣品，測量前將樣品對半切開，采用松露子實體剖面的中間部分進行測試。在CIE顏色系統中的顏色參數包括L*（亮度）、a*（紅綠值）和b*（黃藍值），以標準白色板為參照，計算樣品與標準白色版的ΔE值[20]。樣品的ΔE按式（4）計算：

式中：L*、a*、b*為樣品的測定值；為標準白色板的測定值。

1.4 數據處理與分析

本實驗中的每個檢測指標均進行3 次平行實驗最后計算平均值以及標準偏差，以±s形式表示。采用Excel 2021軟件對樣品的各指標進行基本數據處理；采用IBM SPSS Statistics 27.0軟件中的LSD、Tukey s-b(k)以及沃勒-鄧肯法進行顯著性分析（P＜0.05）；采用Origin 2021進行繪圖；利用SIMCA 14.1軟件在主成分分析（principal component analysis，PCA）的基礎上建立正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）模型。

2 結果與分析

2.1 松露冰點的確定

當樣品溫度初次降至冰點溫度并未立即發生凍結，而是繼續降低至某一點后出現輕微回升，然后慢慢下降至終溫，拐點溫度為冰點溫度，回升前的最低溫度為過冷點溫度[21]。松露子實體冰點測定曲線見圖1。從將樣品放入-20 ℃的環境中開始，松露出現兩次溫度波動，其中第一次波動出現在60 s，樣品溫度先隨時間的變化快速下降至冰點以下，溫度達到-5 ℃左右為過冷點溫度。隨后，由于樣品發生相變釋放出潛熱，溫度開始略微回升至-4.4 ℃，持續約5 min后繼續下降。因此冰點溫度為-4.4 ℃。在后續實驗中，將松露放入該溫度下的低溫冷藏庫中并未發生凍結，所以測定結果可靠。

圖1 松露冰溫曲線Fig.1 Determination of superchilling temperature for truffle samples

2.2 不同處理對松露采后貯藏期間生理及貯藏品質的影響

2.2.1 質量損失率、水分質量分數、腐爛率的變化

由圖2可見，A組能很好地維持松露的品質，而CK組松露總體感官品質下降很快，第5天就開始皺縮，貯藏至第15天時，大部分已開始腐敗變質、表面長出霉菌，失去其商品價值。

圖2 不同處理對松露貯藏期間感官特性的影響Fig.2 Effect of different treatments on sensory properties during truffle storage

質量損失率是評價水果貯藏保鮮效果的重要指標。質量損失在一定程度上反映了水果水分和營養成分含量的下降，質量減輕主要與水分或水分損失有關[22]。如圖3A所示，貯藏期間CK組和A組的實驗組中均出現了質量損失率升高的現象。在整個貯藏期間（0～20 d），A組質量損失率顯著低于CK組（P＜0.05）。隨著貯藏時間的延長，A組的樣品的質量損失率則是緩慢升高，在第20天時仍只有1.02%左右。

圖3 松露貯藏過程中的生理生化品質指標Fig.3 Changes in physiological and biochemical quality indexes of truffle samples during storage

由圖3B可知，CK組和A組松露的水分含量均逐漸降低，但在整個貯藏過程中A組的水分含量始終極顯著高于CK組（P＜0.05）。貯藏至20 d時，CK組的水分質量分數為59.63%，低于貯藏初期（78.66%）。而A組的水分質量分數則僅從貯藏初期的78.66%下降至63.62%，下降程度整體顯著低于CK組。

腐爛率是判斷松露子實體在貯藏期間品質的最直觀指標，一旦出現肉眼可見的霉菌菌落便可直接判定為腐爛[23]。從圖3C可看出，CK組與A組均在第5天出現發軟、腐爛現象。A組的腐爛率顯著低于CK組，且在貯藏15、20 d時，A組的腐爛率分別僅為3.89%、6.94%。

2.2.2 多糖、總多酚、總黃酮含量的變化

圖3D為CK組和A組松露多糖含量的變化，多糖的含量隨著貯藏時間延長而逐漸減少。在貯藏的前5 d，A組松露的多糖含量減少量明顯低于對照組，貯藏第15天，A組松露的多糖含量顯著高于CK組（P＜0.05）。

由于酚類物質和類黃酮的存在，蘑菇表現出抗氧化活性[24]。總酚、總黃酮等非酶抗氧化劑不僅可以保持氧化還原代謝平衡，還可以提高水果的營養價值[25]，如圖3E、F所示，松露的總多酚和總黃酮含量都隨貯藏時間的延長而出現而先增后降的趨勢。貯藏第5天時，A組松露的總多酚含量顯著高于冰溫CK組（P＜0.05），而從貯藏第15天開始，相較于A組，CK組的總多酚含量開始迅速下降。

如圖3F所示，在冰溫結合氣調貯藏條件下，松露總黃酮質量濃度在前10 d增加了4 mg/mL左右，而在后面10 d持續下降，第20天的黃酮質量濃度比貯藏第0天時的總黃酮質量濃度減少了約2 mg/mL。CK組松露黃酮含量的變化趨勢和A組相似，但總黃酮的含量均顯著低于A組（P＜0.05），在第20天時CK組松露的黃酮質量濃度很低，僅為5.9 mg/mL，顯著低于A組（13.3 mg/mL）（P＜0.05），比第0天時減少約10 mg/mL。

2.2.3 粗蛋白含量的變化

如圖3G所示，兩種貯藏條件下松露的蛋白質含量都隨著貯藏時間的延長而減少。對于CK組，松露的蛋白質量濃度在前5 d大幅度下降，減少了約25 μg/mL，且顯著低于A組（P＜0.05），此后一直處于一個較低的含量水平。而A組松露的蛋白質含量在前5 d的下降幅度較小，約為5 μg/mL，在貯藏至第10天時粗蛋白質量濃度開始大幅下降，減少量介于15～20 μg/mL，并且在第15天時的減少量也較多，相比第10天約下降了10 μg/mL。在第5天和第15天時A組的蛋白質含量顯著高于CK組（P＜0.05）。兩種貯藏條件下松露的蛋白質含量變化表明，冰溫氣調貯藏可以減少松露蛋白質含量的損失，在短時間（15 d）內貯藏的效果明顯。

2.2.4 FRAP的變化

FRAP是一種基于電子轉移的測定，其中鐵鹽Fe(TPTZ)2Cl3作為氧化劑。但是，食品中存在的許多金屬螯合劑，能夠與Fe3+結合并形成可以與抗氧化劑反應的復合物，會使之受到干擾，無論在冷藏還是在貨架條件下，隨著貯藏時間延長果實體內抗氧化能力逐漸下降，由于生成的大量活性氧自由基未被及時清除，造成膜脂質過氧化程度加劇，細胞衰老死亡[26]。如圖3H所示，兩種不同處理方式下的松露FRAP均出現下降趨勢，相較于A組，CK組的下降趨勢則更為陡峭，從貯藏第0天的3.55 g/100 g下降至第20天的2.68 g/100 g，下降幅度為24.5%。且在貯藏第15天時顯著下降（P＜0.05）。

2.2.5 質構特性的變化

不同處理對松露質構特性的影響見表1，兩種不同處理方式對松露貯藏期間的質構特性的各指標表現不同。與松露品質密切相關的硬度、彈性、內聚性等指標的變化幅度表現為A組小于CK組。在貯藏過程中，松露的硬度隨貯藏時間的延長而下降，CK組中第0天新鮮松露的硬度為1305.34 N，在第5天時顯著下降到1091.87 N（P＜0.05），而到了第20天時硬度下降幅度為27%，與第0天呈顯著差異（P＜0.05）。而相比于CK組，A組貯藏下的松露硬度則從1305.34 N下降至1010.34 N，下降幅度為22.60%。

表1 松露貯藏期間不同處理的質構特性Table 1 Texture properties of truffle samples subjected to different treatments during storage periods

在A組中新鮮松露的彈性為1.74 mm，貯藏期間呈現下降趨勢，在第10天時出現顯著差異（P＜0.05），在第20天達到最小值，為0.90 mm，相比于第0天而言，下降幅度為48.28%。而在CK組中，樣品的彈性在貯藏第5天時出現顯著差異（P＜0.05），為1.14 mm，在貯藏20 d時該組的樣品彈性下降幅度為58.62%。

從A組松露內聚性的變化過程中可看出，在貯藏第20天時才發生顯著差異（P＜0.05），由第0天的1.05下降至0.78，其下降幅度為25.71%。而CK組的下降幅度為44.76%。

在貯藏過程中，松露的內聚性、咀嚼度、回復性雖都處于下降趨勢，但其下降幅度均表現為CK組大于A組。本研究通過對松露進行較為全面的質構特性分析發現，其硬度與彈性、內聚性、咀嚼度、回復性呈正相關，與黏附性呈負相關，這與其他果蔬的相關研究中發現的規律[27-28]一致。

2.2.6 ΔE值的變化

不同處理方式下松露的ΔE值變化情況如圖3I所示。兩組處理下的松露的ΔE值均呈上升趨勢，隨著貯藏時間的延長上升的趨勢越大。CK組和A組在貯藏前期（第15天以前）松露ΔE值變化相對平緩，但CK組的ΔE值上升趨勢都大于A組，在貯藏第15天時，CK組ΔE值變化顯著升高（P＜0.05），在第20天時更加明顯，從第5天的14.17上升至第20天的25.16。同樣，A組的ΔE值也在貯藏期第20天發生了較大幅度的變化，從第5天的13.87上升至第20天的20.93。通過對比，在不同處理方式下，冰溫結合氣調貯藏可以較好地抑制松露在貯藏期間ΔE值的變化，其貯藏時間不超過15 d效果最好。

2.3 PCA結果

2.3.1 相關性分析

對兩種不同貯藏方式下松露的各生理指標進行相關性分析，在相關系數圖中紅色代表正相關，藍色代表負相關，顏色越深相關性系數越大，反之則越小。結果如圖4所示，松露貯藏時間與黏附性呈顯著正相關（r＝0.41，P＜0.05），與質量損失率、腐爛率和ΔE值呈極顯著正相關（r＝0.53，r＝0.65，r＝0.88，P＜0.01），與總多酚、多糖、蛋白質、總黃酮、FRAP值、水分含量、硬度、彈性、內聚性、咀嚼度、回復性呈極顯著負相關（r＝-0.81，r＝-0.96，r＝-0.91，r＝-0.56，r＝-0.89，r＝-0.92，r＝-0.50，r＝-0.79，r＝-0.57，r＝-0.68，r＝-0.52，P＜0.01），說明這些各項指標均能反映貯藏期間松露的品質，且總酚含量、總黃酮含量與FRAP值呈極顯著正相關（r＝0.92，r＝0.67，P＜0.01），表明總酚等次生代謝產物含量越高，鐵離子的還原能力越強，更有利于清除松露子實體內由于貯藏時間的延長所生成的大量活性氧自由基，造成膜脂質過氧化程度加劇導致細胞衰老死亡的現象[29-30]。同時，由圖4也可看出松露的品質指標間均有一定的相關性，說明在貯藏期間理化指標對松露的品質存在一定的影響，但也有部分指標間是呈現一定的負相關，因此也表明在松露貯藏期間并不是各理化成分含量越高，其品質越好。

圖4 松露品質指標相關性分析Fig.4 Correlation analysis among truffle quality indicators

2.3.2 多元統計分析

通過OPLS-DA圖，可以實現對采用兩種不同處理方式的樣品有效區分。如圖5A所示，采用兩種不同處理貯藏方式的松露在得分散點圖的橫軸上實現了處理方式的區分，＝0.952，＝0.991，Q2＝0.941，R2和Q2超過0.5表示模型擬合結果可接受[31]。其中，CK組分布在橫軸的負半軸，A組分布在橫軸的正半軸。同一處理方式的松露重復性良好，說明在貯藏期間采用不同處理方式的松露的品質存在一定區別。

圖5 不同處理方式下松露的OPLS-DA（A）、模型交叉驗證結果（B）以及Biplot雙標圖（C）Fig.5 OPLS-DA plot (A),cross-validation plot of the OPLS-DA model (B),and correlation Biplot (C) of truffle samples subjected to different treatments

如圖5B所示，經過200 次置換檢驗，Q2回歸線與縱軸的相交點小于0，說明模型不存在過擬合，模型驗證有效[32]，認為該結果可用于兩種處理方式對松露貯藏期間品質變化的鑒別分析。為更加直觀表現不同指標在不同主元得分下的表現以及與不同處理方式之間的相關性繪制Biplot雙標圖，如圖5C所示，不同指標與處理方式的位置越接近，表示其相關性越高，反之則低。從圖5C可看出，A組與黏附性、回復性、咀嚼度、內聚性、總多酚、FRAP值、水分含量、總黃酮相關性較高；而CK組除第0天外與ΔE值、質量損失率、腐爛率相關性較高，CK組在第15天開始與腐爛率、質量損失率、總色差值相聚較近，距離其他指標明顯分離，說明從第15天開始松露的品質指標在發生急劇變化。相較于CK組，A組在貯藏第20天時與黏附性距離相近，前15 d也都較緊密地聚集在0 d左右，與咀嚼度、內聚性、總多酚、FRAP值、總黃酮距離更近。說明A組在貯藏前15 d對松露質構以及總多酚、FRAP值、水分含量、多糖、總黃酮這些品質指標有著最佳的保持效果。

3 討論

松露的質構特性以及色澤的變化是在采后貯藏保鮮過程中最能直接表現其品質變化的現象，因為新鮮的松露具有堅硬而腫脹的果肉，隨著衰老的進展會出現質地變軟、彈性下降、色澤變差以及有內容物外溢等。劉帥等[33]發現，與冷藏相比，冰溫貯藏能夠更好地抑制雪蓮果失水以及軟化衰老，使糖類代謝速率較慢，能夠更有效地降低糖類的消耗，其各項生理指標值均優于冷藏儲藏，更加利于雪蓮果品質的保持。本實驗通過冰溫處理和冰溫結合氣調處理兩種方式對松露進行貯藏，在質量損失率和水分含量以及質構特性等方面的測定也得出了與Rivera等[34]研究相似的結果。

在貯藏過程中多糖的含量隨著貯藏時間延長而逐漸減少，這可能是由于低聚果糖分解成蔗糖，甚至還原成果糖和葡萄糖，高分子碳水化合物的水解，以及水果后熟作用，使之在貯藏期間仍然能進行較高水平的代謝，消耗了具有還原性質的單糖和雙糖。本研究中，兩種貯藏條件下松露多糖含量的變化也表明采用冰溫氣調保鮮可以降低松露多糖的損失。

從貯藏第15天開始，相較于A組，CK組的總多酚含量開始迅速下降，這可能是在貯藏初期由于松露子實體子為了通過誘導酚類化合物的合成，增強其抗性從而抵御冰溫環境以及氣體含量不足所帶來損傷。有研究表明許多酚類化合物來源于次級代謝，當生物面臨壓力時會激活次級代謝而合成了酚類物質[35]。從本實驗的貯藏后期可見，兩種不同處理方式下松露的總多酚含量相差較大，冰溫結合氣調貯藏能更大程度地降低貯藏期松露總多酚含量的損失。這與Zhao Handong等[36]采用冰溫貯藏油桃的結果一致。鐵離子與人體呼吸作用、一系列酶活性、氧轉運和氧化還原反應都有著密切聯系，鐵離子的活躍程度也與許多分子的氧化相關[37]。松露在貯藏過程中的FRAP與總多酚、總黃酮的含量有著密切聯系，在Awad等[38]的研究中也報道了FRAP與總酚、總黃酮和原花青素密切相關的結論，本實驗相關性分析中FRAP與總酚含量、總黃酮含量呈正相關的結果與之也有著相似之處。

本實驗選取的10 個松露品質指標都顯示，A組保鮮效果均優于CK組，并經多元統計分析再次驗證，在-（4.4±0.2）℃、40% O2+60% CO2的冰溫結合氣調條件下能夠有效延緩松露子實體在貯藏期間質構特性的劣變，特別是硬度和咀嚼度的下降，以及ΔE值的變化，且顯著延緩失水和腐敗速度，抑制多糖、總多酚、總黃酮、FRAP和粗蛋白含量的下降。在整個貯藏過程中，A組的多糖、總多酚、總黃酮、粗蛋白、FRAP分別降低了27.94%、32.51%、16.18%、68.58%、18.13%，降幅均低于CK組。表明冰溫結合氣調貯藏對延緩松露品質變化和延長其貨架期有一定效果，尤其貨架期超過15 d，效果更加明顯。