原料乳冷藏過程中差異表達蛋白的表征與比較分析

莊 姣，劇 檸，朱曉雪，李亞鳳，丁雨紅，高 巖，陳彥輝，齊 瑾，楊秉坤

（寧夏大學食品科學與工程學院，寧夏 銀川 750021）

乳制品的質量與加工前原料乳品質密切相關[1-2]。原料乳在加工之前，為減緩腐敗變質，通常會將原料乳置于4 ℃冷藏1～4 d[3-4]。在此過程中，乳中的內源酶與微生物產生的外源酶會共同作用不斷分解原料乳的營養物質，造成乳中蛋白質被降解為肽段和氨基酸，脂肪被分解為各類脂肪酸，乳糖作為乳中主要的碳水化合物也隨之降解。物質的變化宏觀上造成了牛乳的色澤、口感、風味及組織狀態劣變[5-6]。

近年來，組學技術在食品研究中得到廣泛應用，蛋白質組學是其中重要的組成部分[7-9]。蛋白質組學是系統研究某一基因組所表達的全部蛋白質，包括組成蛋白質一級結構的氨基酸序列、蛋白質的豐度、蛋白質修飾以及蛋白質之間相互作用的一門技術[10-11]?；跀祿蕾嚥杉╠ata dependent acquisition，DDA）模式的高通量蛋白質組學技術已被廣泛應用于乳與乳制品研究中。例如，采用Label-Free非標記蛋白質組學技術，李墨翰等[12]分析了驢初乳與常乳中乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MGFM）蛋白的組成差異，為不同泌乳時期驢乳MGFM的營養功能研究提供了參考；Sun Yuxue等[13]利用同位素標記相對和絕對定量（isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術分析了關中山羊乳和荷斯坦牛乳的差異表達乳清蛋白，發現2 個物種牛乳中的差異表達乳清蛋白具有豐富的免疫功能；再如，采用串聯質量標簽（tandem mass tag，TMT）蛋白質組學方法，Li Shanshan等[14]分析了來自3 個不同海拔地區水牛乳的MFGM蛋白組成及活性，為開發水牛乳相關的功能性乳制品提供了理論依據。然而，這種以Label-Free、iTRAQ和TMT為主的DDA模式檢測技術通常只檢測一級質譜中信號強度排名前n（一般是前20）的離子，當檢測牛乳這種肽段組成復雜的樣品時，數據采集的隨機性[15]會導致許多低豐度蛋白無法被準確鑒定。數據獨立采集（data independent acquisition，DIA）技術具有更高的重現性、靈敏度和檢測范圍，可在不考慮母離子信號的情況下，獲得更完整的質譜數據，從而最大限度地檢測牛乳中的低豐度蛋白[16-18]。冷藏過程既是原料乳中無生物活性的蛋白質的變化，更是具有生物活性的一系列酶（蛋白質）的變化，采用DIA技術為挖掘乳體系中具有生物活性的低豐度蛋白提供了可能性。

因此，本研究采用DIA技術探究原料乳4 ℃冷藏6 d過程中蛋白質的變化，分析差異蛋白質組成，并對不同冷藏階段的蛋白質的生物學功能進行表征，從而為原料乳冷藏及乳制品的加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳樣采集于2022年秋季寧夏銀川某乳品企業，其轄下牧場存欄奶牛3.4萬頭。經測定，該牧場的原料乳體細胞數17.60萬 個/mL，菌落總數為5.89×103CFU/mL，蛋白質量濃度為3.64 g/100 mL，脂肪質量濃度為4.14 g/100 mL，乳糖質量濃度為4.98 g/100 mL。從該牧場中的原料乳大型乳罐中采集新鮮樣本，放入裝有冰袋的密封泡沫箱中，2h內運回實驗室，分裝后放置于4 ℃冰箱冷藏待檢測。采樣容器準備、采樣過程均遵循無菌要求。分別選取冷藏2h（d0）、3d（d3）、6d（d6）3 個時間點樣本轉移到-80 ℃冰箱，以供下一步分析，每組做3 個重復。

碳酸氫銨（HCOONH4）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、碳酸鈉 美國Sigma-Aldrich公司；尿素、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）美國Bio-Rad公司；乙腈 美國J.T.Baker公司；胰蛋白酶美國Promega公司；所有化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TGL-16M高速冷凍臺式離心機 湘儀離心機儀器有限公司；1260 Infinity II高效液相色譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司；納升流速EasynLC1200色譜系統、Q-Exactive HF-X質譜儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質提取與酶解

各乳樣中加入SDT裂解液（4% SDS、100 mmol/L DTT、pH 8.0100 mmol/L Tris-HCl），煮沸3 min，然后超聲2 min，冷卻至室溫后，4 ℃、16000×g離心20 min，取上清液。采用BCA蛋白質定量法測定蛋白質含量。根據filter aided sample preparation（FASP）方法[19]對蛋白質樣品（每組200 μg）進行處理后，向溶液中加入胰蛋白酶溶液，37 ℃靜置過夜。轉移到新的離心管中，12000×g離心10 min，收集溶液，加入0.1%三氟乙酸，使用C18柱進行肽段脫鹽，真空凍干保存。最終用0.1%甲酸溶液復溶，以備質譜分析。

1.3.2 肽段分級

電子電離離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度275 ℃；離子源溫度200 ℃；母離子m/z285；激活電壓1.5 V；質量掃描范圍m/z35～500。

1.3.3 DDA數據庫構建

各肽段組分取9 μL加入1 μL 10×的iRT肽液，混勻，通過納升流速EasynLC1200色譜系統進行色譜分離。緩沖液：A液（0.1%甲酸-水溶液）、B液（0.1%甲酸-乙腈-水溶液，其中乙腈體積分數為85%）。色譜柱以95%的A液平衡。肽段分離后，使用Q-Exactive HF-X質譜儀進行DDA質譜分析。所有混合樣本進行DDA質譜數據采集后，使用軟件Spectronaut Pulsar搜庫鑒定，數據庫為uniprot-Bostaurus（Bovine）[9913]-47138-20221222.fasta，來源于Uniprot蛋白質數據庫，該數據庫蛋白條目為47168。最終，基于該研究牛乳樣本建立的數據庫（Spectral Library）共2138 個蛋白質條目。

1.3.4 DIA質譜分析

每例樣品各取9 μL肽段與1 μL 10×的iRT肽段混合，混勻后進樣2 μg，使用納升流速EasynLC1200色譜系統進行色譜分離。緩沖液：A液（0.1%甲酸-水溶液）、B液（0.1%甲酸-乙腈-水溶液，其中乙腈體積分數為85%）。色譜柱以95%的A液平衡。肽段分離后用Q-Exactive HF-X質譜儀進行DIA質譜分析。所得到的DIA數據導入Spectronaut進行分析，以Q-value≤0.01作為篩選參數。差異蛋白的篩選標準：同時滿足P＜0.05、倍數變化（fold change，FC）＞1.5或＜1/1.5。

1.4 數據處理

通過Perseus軟件、Microsoft Excel進行數據分析和圖表繪制。利用R統計計算軟件對不同樣本進行主成分分析（principal component analysis，PCA）并可視化。采用Fisher精確檢驗進行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，并進行錯誤發現率（false discovery rate，FDR）校正。富集的GO功能和KEGG通路在P＜0.05水平上具有統計學意義。通過STRING在線搜索數據庫和Cytoscape軟件構建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡。

2 結果與分析

2.1 原料乳冷藏過程中的蛋白質鑒定及差異分析

2.1.1 蛋白質鑒定及定量

對3 個時間點樣本的質譜數據進行平行樣本數據合并和數據庫檢索，共鑒定得到902 種可信蛋白。利用PCA對冷藏d0、d3、d6期間原料乳中可信蛋白的表達量進行分析并繪制PCA得分圖。如圖1所示，橫坐標為樣本的第1主成分得分值，縱坐標為樣本的第2主成分得分值。由圖1可知，同一時間點的3 個平行樣本的聚合度良好，不同時間點樣本間距離較遠且區分明顯，表明冷藏d0、d3、d6的原料乳中的蛋白質組成存在顯著差異。

圖1 原料乳冷藏過程中蛋白質的PCA得分圖Fig.1 Score plots of principal component analysis for variations in the protein composition during raw milk refrigeration

2.1.2 不同冷藏階段的差異表達蛋白分析

基于可信蛋白，以FC＞1.5或＜1/1.5，且P＜0.05為標準，在兩比較組中共篩選到141 種差異表達蛋白。冷藏前期（d 0 vs d 3）共檢出70 種差異蛋白，冷藏后期（d 3 vs d 6）共檢出71 種差異蛋白。兩比較組的Venn圖見圖2a，可知兩個比較組中僅存在23 種（占比19.5%）共同表達的差異蛋白?？梢?，雖然兩個比較組的差異蛋白數量相近，但是蛋白質種類差別很大。為了探究原料乳冷藏過程中差異蛋白的分布情況，以log2FC為橫坐標、-lgP為縱坐標繪制冷藏前期（d 0 vs d 3）（圖2b）、冷藏后期（d 3 vs d 6）（圖2c）的火山圖，2 種紅色圓點均表示上調蛋白，2 種藍色圓點均表示下調蛋白；灰色圓點為差異不顯著蛋白，顏色越深，表明此蛋白變化越顯著。

圖2 原料乳冷藏過程中差異表達蛋白的Venn圖（a）和火山圖（b、c）Fig.2 Venn diagram (a) and volcanic maps (b and c) of differentially expressed proteins during raw milk refrigeration

根據火山圖（圖2b、c），各階段差異蛋白比較表明，冷藏前期下調蛋白數量（49 種）明顯高于上調蛋白（21 種）。冷藏后期，上調蛋白質的數量較前期明顯增加，有33 種；下調的蛋白質較前期有所減少，為38 種。

結合GO富集、KEGG富集及PPI分析，將具有重要生物學功能的差異蛋白列于表1。由表1可知，與冷藏前期相比，冷藏后期的差異蛋白質中具有生物活性的酶類明顯增多。

表1 原料乳冷藏過程中差異表達蛋白的變化Table 1 Changes in differentially expressed proteins during raw milk refrigeration

2.2 差異表達蛋白的GO富集分析

GO數據庫是進行基因功能注釋的重要數據庫。基于Fisher精確檢驗，在d 0 vs d 3比較組中，共有43 種差異蛋白被注釋到了94 條顯著富集的GO功能條目中（P＜0.05）；d 3 vs d 6比較組中共有40 種差異蛋白被注釋到，其顯著富集的基因功能條目高達215 條（P＜0.05）?？梢?，同一個差異蛋白質注釋到了多個GO功能中，參與多種生物功能，且冷藏后期較冷藏前期的差異蛋白具有更豐富的功能表達。

基于生物過程、細胞組分和分子功能的GO功能分類方法，對冷藏前期和冷藏后期的差異蛋白分別進行GO功能富集分析，對于功能富集條目較多的生物過程、細胞組分，主要展示前10的功能條目。如圖3、4所示，橫坐標為P值的負對數轉化，縱坐標為GO術語，圓圈為差異蛋白數量。

圖3 d 0 vs d 3比較組差異表達蛋白的GO功能富集圖Fig.3 GO enrichment analysis of differentially expressed proteins in milk samples on day 0 vs day 3

圖3表明冷藏前期最顯著富集的生物過程有對神經生長因子的反應、細胞對神經生長因子刺激的反應、細胞分化的正向調節和細胞成分組織的負調控；顯著富集的細胞組分有片狀偽足、細胞前緣和膜皺褶；顯著富集的分子功能有蛋白質結合、泛素-蛋白轉移酶活性和G蛋白活性。圖4中，顯著富集的生物過程有碳水化合物代謝過程的調節，RNA代謝過程，轉錄、DNA模板以及葡萄糖代謝過程調節等；與前期顯著富集的細胞組分功能相似，冷藏后期的差異蛋白主要富集于片狀偽足、細胞前緣和有絲分裂紡錘體；后期顯著富集的分子功能有RNA結合、核酸結合、DNA結合轉錄因子結合和肌球蛋白結合等。

圖4 d 3 vs d 6比較組中差異表達蛋白功能顯著富集圖Fig.4 GO enrichment analysis of differentially expressed proteins in milk samples on day 3 vs day 6

2.3 差異表達蛋白的KEGG富集分析

利用KEGG數據庫對兩個比較組中的差異蛋白進行代謝通路富集分析，分別富集到24 條和26 條代謝通路（P＜0.05）。圖5主要展示了排名前10的代謝通路條形圖。

圖5 差異表達蛋白參與的KEGG通路富集條形圖Fig.5 KEGG pathway enrichment of differentially expressed proteins

由圖5a可知，吞噬體是冷藏前期（d 0vsd3）富集程度最高的途徑（富集因子為8.40），BoLA、RAC1、COLEC12、CTSL、CGN1、SEC61B和CORO1A共7 種差異蛋白被注釋到這一途徑中。此外，冷藏前期的差異蛋白還參與了病毒致癌作用、Rap1信號通路、內質網蛋白質加工、膽固醇代謝、溶酶體、流體剪切應力和動脈粥樣硬化及沙門氏菌感染等途徑。

由圖5b可知，冷藏后期（d3vsd6）磷酸戊糖途徑的富集程度最高（富集因子為28.82），涉及的差異蛋白質有4 種，即PGM1、FBP1、PGLS、TALDO1，均為具有生物活性的酶。此外，冷藏后期（d 3 vs d 6）的差異蛋白還參與了結核病、唾液分泌、軸突導向、碳代謝、冠狀病毒病-COVID-19、細菌侵入上皮細胞、核糖體、吞噬體和半乳糖代謝的代謝途徑。值得注意的是，該階段吞噬體途徑的富集程度明顯下降（富集因子為4.69），而與碳水化合物相關的碳代謝、半乳糖的代謝開始出現。

2.4 差異表達蛋白的PPI分析

通常情況下，蛋白質多以結合或相互作用的方式發揮生物活性功能，通過PPI分析能更好地了解蛋白質在生物系統中的相互作用關系。設置0.400為最低交互分數，繪制不同冷藏時期原料乳中的差異蛋白質的PPI圖。如圖6所示，圓圈為差異蛋白，根據該蛋白的相互作用degree值，中心向四周依次從大到小排列。蛋白質周圍的連接線越多，圓圈越大，代表該蛋白越重要。

圖6 d 0 vs d 3（a）與d 3 vs d 6（b）比較組中差異表達蛋白的PPI分析Fig.6 PPI analysis of differentially expressed proteins in milk samples on day 0 vs day 3 (a) and day 3 vs day 6 (b)

冷藏前期（d 0 vs d 3）的差異表達蛋白中有6 種中心節點蛋白（圖6a），包括CDC42、NME2、RAC1、PAEP、ORM1、APOA4。NME2通過與AKAP13/LBC相互作用對Rho活性進行負調節；RAC1是一種與質膜相關的小GTP酶，在活性GTP結合和非活性GDP結合狀態之間循環[20]。PAEP是乳清的主要成分，可以與視黃醇結合并參與其運輸，而視黃醇等維生素多為脂溶性，因此，PAEP對視黃醇的運輸作用可能是通過與脂肪結合[21]的形式實現的。ORM1是一種分子質量為37～54 kDa的蛋白，在血液中充當運輸蛋白，具有調節免疫系統活性等功能[22]?？梢?，冷藏前期的中心節點蛋白多與細胞過程有關。圖6b中，從冷藏后期（d 3 vs d 6）的差異表達蛋白中篩選獲得了7 種中心節點蛋白，即CDC42、TALDO1、NME2、RPL11、RHOA、CLTC、RPS3。其中，TALDO1與8 種蛋白質相互作用，主要參與了糖代謝過程。RPL11、RPS3都為核糖體蛋白，在冷藏后期相互作用，且都被顯著富集到了核糖體途徑，表明冷藏過程中的這些核糖體蛋白可能在生物學功能中發揮著重要作用。值得注意的是，CDC42是兩個冷藏階段共有的關鍵節點蛋白，在冷藏前期表現為上調、冷藏后期表現為下調。作為Rho GTP酶超家族的重要成員，CDC42能參與許多重要的細胞活動過程，如絲狀偽足的形成[23-24]、囊泡運輸和有絲分裂紡錘體的調節[25-26]等。

3 討論

隨著冷藏時間的延長，原料乳中具有生物活性的酶會改變原料乳的品質，進而影響后續乳制品的加工。大量研究表明4 ℃可有效減緩原料乳的品質劣變，但無法避免該過程的發生[27-28]。本研究對4 ℃冷藏前期（d 0 vs d 3）和冷藏后期（d 3 vs d 6）的原料乳采用蛋白質組學方法進行分析，從微觀角度探究原料乳品質劣變的原因。結果發現，不同冷藏階段乳中蛋白質變化復雜，且生物學功能存在較大差異，冷藏過程中的蛋白質主要行使細胞進程和代謝過程這兩種生物學功能。

1）細胞進程。冷藏前期的差異蛋白主要參與了細胞的生物學過程。細胞過程離不開相關信號轉導通路的調節[29]。冷藏前期，Rap1信號通路被顯著富集。研究表明，Rap1信號通路處于活躍狀態時產生的下游效應分子RIAM（Rap1相互作用的銜接分子）有助于吞噬體作用[30-31]。本研究中，CDC42與RAP1A、RAC1、RHOA不僅具有相互作用，且均參與了Rap1信號通路。這些蛋白在活躍的GTP狀態和非活躍的GDP狀態之間不斷轉換[20]。當處于活躍狀態的GTP酶與Rap1結合時，會激活Rap1/RIAM通路，從而促進細胞的吞噬作用[31]。值得注意的是，CDC42在冷藏前期表達上調，表明此階段Rap1與GTP酶結合的頻率更高，使得Rap1/RIAM通路處于激活狀態，吞噬作用明顯。而冷藏后期，CDC42表達下調說明吞噬作用下降。Shrivastava等[32]指出，吞噬作用是一種重要的防御機制，可以吞噬細菌、真菌、病毒等病原體，從而對抗有害微生物的感染。Botelho等[33]指出，吞噬體可與溶酶體融合以獲得殺滅微生物的一系列蛋白，這些蛋白質（如CLTC）主要存在于溶酶體內，通過融合作用進入吞噬體內發揮吞噬作用。本研究中，CLTC被同時注釋到了吞噬體和溶酶體兩種顯著富集的代謝途徑，使得冷藏前期原料乳中微生物無法迅速生長。王媛媛[34]的研究表明4 ℃冷藏72 h，微生物生長緩慢，原料乳脂肪、蛋白質、乳糖等關鍵品質變化不顯著。冷藏后期，吞噬體途徑的富集程度顯著下降，吞噬體作用減弱，該階段嗜冷微生物迅速生長繁殖[35-36]。微生物的生長使得原料乳中的營養物質被消耗，造成乳蛋白、脂肪和乳糖等營養物質減少，并導致酸味、澀味和苦味等不良風味的形成，從而影響原料乳加工前的品質[37-38]。

2）代謝過程。隨著冷藏時間的延長，乳中具有生物活性的蛋白參與的主要代謝途徑為膽固醇代謝和糖代謝。膽固醇是哺乳動物體內合成的、能穩定細胞膜結構的重要脂質[39-40]。本研究中膽固醇代謝途徑僅在冷藏前期被顯著富集（P＜0.05），涉及NPC1、APOA4和APOC3共3 種差異蛋白，均表達下調，它們是膽固醇等脂類轉運的重要載體，其中載脂蛋白可通過運輸參與膽固醇的穩態調節[41]。上述差異蛋白表達的下調說明此階段膽固醇的穩態結構可能被打破。冷藏后期，膽固醇代謝不再顯著富集（P≥0.05）?？紤]到膽固醇是奶牛體內合成的，新鮮原料乳中應具有更高的膽固醇含量。結合本研究結果推測，乳中膽固醇的降低可能主要發生在冷藏的前期。冷藏后期，與碳水化合物代謝相關的磷酸戊糖途徑、碳代謝途徑、半乳糖代謝途徑被顯著富集（P＜0.05）。參與上述途徑的差異蛋白主要是PGM1、FBP1、TALDO1、LALBA等，其中，PGM1參與了葡萄糖的分解和合成；FBP1催化果糖-1,6-二磷酸水解為果糖-6-磷酸；TALDO1屬于糖酵解過程中的關鍵酶，參與糖酵解并促進葡萄糖代謝，對ATP的產生和磷酸-戊糖途徑中代謝物的平衡具有重要影響[42-44]。另外，LALBA是牛乳中常見的活性蛋白[45]。Viaene等[46]研究發現，LALBA具有酶活性，能夠調節半乳糖基轉移酶的底物特異性，從而促進乳糖的合成。本研究中，LALBA被注釋到了半乳糖代謝途徑中。然而，Li Hongqiang等[47]研究表明，原料乳4 ℃冷藏6 d的過程中，乳糖含量始終保持下降。同時，Zhang Lina等[48]的結果表明原料乳冷藏后期微生物生長迅速，并產生大量水解酶分解乳糖?？梢?，冷藏后期原料乳中糖代謝相關酶類的水解作用遠遠大于乳糖的合成作用。

4 結論

采用DIA蛋白組學揭示了4 ℃冷藏6 d原料乳蛋白質之間組成和功能的差異。冷藏過程中共檢測到蛋白質902 種，其中冷藏前期和冷藏后期分別篩選到70 種和71 種差異表達蛋白。兩個階段僅23 種共同的差異表達蛋白，說明不同冷藏時期的蛋白質表達存在顯著差異（P＜0.05）。冷藏前期的差異蛋白質主要與細胞生物學功能有關，吞噬作用明顯，抑制了原料乳中微生物的生長，原料乳品質較穩定；冷藏后期，差異蛋白質主要與碳水化合物的代謝有關，具體參與磷酸戊糖途徑、碳代謝途徑和半乳糖代謝途徑，造成后期原料乳品質的下降。因此，4 ℃冷藏3 d可有效保證原料乳的品質。