WIN55212-2通過調控mTOR/HIF-1α/PFKFB3信號通路抑制糖酵解并減輕膿毒癥小鼠急性肺損傷*

段倩雯， 董旭鵬， 馬 源， 劉 澈， 張 銘， 馬玉清

（1蘭州大學第一臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000；2蘭州大學第一醫院麻醉科，甘肅 蘭州 730000）

膿毒癥（sepsis）是一種由宿主反應失調導致的危及生命的器官功能障礙［1］。在膿毒癥發展過程中，急性肺損傷（acute lung injury， ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome， ARDS）是最常見的器官損傷，ALI/ARDS 患者預后較差，死亡率高達35%～45%［2］，目前仍然是一個醫療危機。

巨噬細胞活化是膿毒癥的主要特征，巨噬細胞活化通過Warburg效應（也稱為有氧糖酵解或代謝重編程）誘導過度增殖和炎癥反應［3］。6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-雙磷酸酶3（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-biphosphatase 3， PFKFB3）是PFKFB 家族的同工酶，被稱為糖酵解調節劑，是糖酵解關鍵酶磷酸果糖激酶1 的有效變構調節因子，可維持高糖酵解速率［4］。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）作為一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是巨噬細胞活化的重要位點［5］。mTOR 激活促進缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的轉錄及翻譯，調控促炎因子并驅動多種糖酵解酶的表達，促進糖代謝從氧化磷酸化轉變為糖酵解，為細胞增殖提供能量［6］。研究證實，在巨噬細胞中敲除mTOR相關基因，轉錄因子HIF-1α 表達降低，從而減少葡萄糖攝取，抑制糖酵解［7］。

WIN55212-2（WIN）是一種非選擇性具有抗炎特性的大麻素受體1 和大麻素受體2 激動劑。研究表明，WIN 可以激活大麻素受體2，減少巨噬細胞TNFα 和活性氧的生成產生抗炎和抗氧化作用［8］。Feng等［9］證實，WIN可以通過調節p38MAPK信號通路，降低結腸炎小鼠血漿TNF-α、白細胞介素6（interleukin-6， IL-6）及腸組織MPO 活性，并上調claudin-1 表達，改善腸道屏障功能，減輕腸道炎癥反應。WIN 可否通過抑制糖酵解，減輕膿毒癥ALI 及其與mTOR/HIF-1α/PFKFB3 信號通路之間的關系，尚未有研究報道。因此，本研究擬建立脂多糖（lipopolysaccha‐ride， LPS）誘導的小鼠膿毒癥模型，探討WIN 是否通過調控mTOR/HIF-1α/PFKFB3 信號通路，抑制糖酵解，緩解膿毒癥小鼠ALI。

材料和方法

1 動物

6～8 周齡SP F 級雄性C57BL/6J 小鼠24 只，體重18～22 g，購自蘭州大學醫學院動物實驗中心，動物許可證號：SCXK（甘）2018-0002。遵循實驗動物3R 原則。小鼠正常進食，自由進水，人工光照和黑暗時間12 h 交替。本實驗符合相關動物倫理法規，獲得蘭州大學第一醫院動物倫理委員會批準，審批號：LDYYLL2023-319。

2 主要試劑與儀器

LPS（Sigma）； WIN55212-2（Cayman）；mTOR 激動劑MHY1485（MCE）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、4%多聚甲醛固定液（Wabcan）；乳酸、乳酸脫氫酶A（lac‐tate dehydrogenase A， LDHA）、IL-1β 和IL-10 ELISA試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）；磷酸化mTOR（p-mTOR）抗體和β-actin 抗體（北京博奧森生物科技有限公司）；HIF-1α 抗體和PFKFB3 抗體（Abcam）；RIPA 蛋白裂解液（北京索萊寶公司）；二甲基亞砜（DMSO）、蛋白Marker和ECL發光液（Biosharp）。

光學顯微鏡（Olympus）；離心機（Beckman）；酶標儀（Thermo）。

3 實驗方法

3.1 動物分組及造模 將24 只小鼠隨機分為對照（control）組、LPS 組、LPS+WIN 組 和LPS+WIN+MHY1485 組，每組6 只。造模前禁食12 h，自由進水，腹腔注射LPS（10 mg/kg［10］）制備膿毒癥小鼠模型，LPS+WIN 組造模前30 min 腹腔注射1 mg/kg WIN［11］，LPS+WIN+MHY1485 組造模前1 d 腹腔注射10 mg/kg MHY1485［12］，并在造模前30 min 腹腔注射1 mg/kg WIN 和10 mg/kg MHY1485，control 組和LPS組在上述相同時點腹腔注射等體積DMSO 及生理鹽水。造模24 h 后觀察小鼠毛發、活動和精神等一般狀況，有無豎毛及眼角分泌物；攝食、進水及攀爬打斗等行為的活躍程度；對聲音、觸碰等刺激的行為反應；呼吸頻率等判斷造模是否成功。水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠后，之后將其仰臥于固定板上；剪去心前區毛發并消毒，以食指指腹定位小鼠心臟搏動區；手持1 mL 注射器穿刺心搏最強處，收集足量血液標本。靜置30 min 后以3 000 r/min 離心15 min，取上清液于?80 ℃冰箱儲存。心臟取血后處死小鼠。常規剪去毛發、消毒，暴露胸腔；取肺組織，PBS沖洗3遍，取右肺下葉固定于4%多聚甲醛溶液，用于病理學觀察；分裝剩余標本，?80 ℃冰箱儲存，用于后續檢測。

3.2 肺指數檢測 取肺臟吸干表面水分后稱重，計算肺指數［13］。肺指數=肺濕質量（mg）/小鼠體質量（g）×100%。

3.3 觀察肺組織病理結構 取肺組織，置于4%的多聚甲醛中固定48 h，脫水后進行石蠟包埋、切片、染色、顯微鏡下觀察肺組織結構變化，肺組織Smith評分［14］按照肺水腫、炎癥細胞浸潤、肺不張、出血、壞死和透明膜形成進行0～4分的半定量分析。

3.4 ELISA 法檢測肺組織炎癥因子IL-1β、IL-10 及血清乳酸、LDHA 表達水平 肺組織稱重量，按照1 g加入5 mL PBS 的比例加入PBS，在冰水浴中盡量剪碎組織，隨后按照每20 mg 肺組織加入150～200 μL RIPA 裂解液的比例加入裂解液，在冰上使用勻漿機制備成10%肺組織勻漿。將制備好的組織勻漿于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，離心后的勻漿取上清液進行分裝，?80 ℃放置保存。按照ELISA 試劑盒說明檢測肺勻漿IL-1β 和IL-10 表達水平。取血清上清液，按照ELISA 試劑盒說明檢測血清乳酸和LDHA水平。

3.5 Western blot 檢測mTOR/HIF-1α/PFKFB3 信號蛋白的表達水平 取?80 ℃肺組織勻漿，加入RIPA組織裂解液1 mL，裂解30 min，在4 ℃、12 000 r/min離心10 min，轉移上清至新的離心管提取組織蛋白。加熱變性10 min，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳100 min，轉移至聚偏二氟乙烯膜上，洗膜后加入Ⅰ抗（p-mTOR、HIF-1α、PFKFB3和β-actin抗體，1∶2 000 稀釋），4 ℃孵育過夜。次日洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔Ⅱ抗（1∶100 000 稀釋）37 ℃搖床孵育2 h，TBST 充分洗膜。增強化學發光法顯色曝光，采集圖像后用ImageJ 軟件分析各組條帶灰度值，用目標蛋白與內參照蛋白的灰度值比值反映目標蛋白表達量。

4 統計學處理

所有數據采用Graphpad Prism 9.5 軟件進行統計學分析并作圖，所有數據均以均數±標準差（mean±SD）表示，本研究實驗數據均為計量資料且符合正態分布，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 小鼠一般狀態

LPS造模24 h后，control組小鼠精神狀態、活動、飲食、呼吸及對刺激的反應較造模前無明顯改變，LPS 組小鼠精神萎靡，進食進水減少、寒戰、呼吸急促，眼角分泌物增多，豎毛，LPS+WIN 組與LPS+WIN+MHY1485 組較LPS 組小鼠上述表現輕微，而LPS+WIN+MHY1485組相較于LPS+WIN 組小鼠上述表現加重。

2 各組小鼠肺指數比較

Control 組、LPS 組、LPS+WIN 組 及LPS+WIN+MHY1485 組小鼠體質量比較差異均無統計學意義。與control 組相比，LPS 組濕肺質量及肺指數增加（P<0.05）；與LPS 組相比，LPS+WIN 組相較于LPS 組濕肺質量及肺指數明顯降低（P<0.05）；LPS+WIN+MHY1485 組相比于LPS+WIN 組濕肺質量及肺指數增加（P<0.05），見表1。

表1 各組小鼠肺指數比較Table 1. Comparative analysis of lung index in mice of different groups （Mean±SD. n=6）

3 各組小鼠肺組織病理結構改變

光鏡下，control 組肺組織結構完整，肺泡及間質未見水腫及明顯炎癥浸潤，LPS 組肺間質水腫，肺泡明顯萎陷，壞死組織出現，肺泡和間質可見大量炎癥細胞浸潤，肺泡腔可見出血及透明膜形成；LPS+WIN組肺泡充血、出血、炎癥滲出、肺泡壁增厚和透明膜形成等損傷有所減輕；LPS+WIN+MHY1485 組肺水腫和肺不張較LPS+WIN 組加重，肺泡及間質炎癥細胞浸潤增多，肺泡出血增加。與control 組相比，LPS組Smith 評分顯著增加（P<0.05）；與LPS 組相比，LPS+WIN 組Smith 評分顯著降低（P<0.05） ；LPS+WIN+MHY1485 組較LPS+WIN 組相比Smith 評分增加（P<0.05），見圖1。

Figure 1. Pathological alterations and Smith score of lung tissues in mice of different groups（ HE staining， scale bar=100 or 20 μm）.Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs LPS group； ▲P<0.05 vs LPS+WIN group.圖1 各組小鼠肺組織病理學變化及Smith評分

4 各組小鼠肺組織IL-1β和IL-10水平

ELISA 檢測各組小鼠肺組織勻漿炎癥因子IL-1β和IL-10的表達情況，結果顯示：與control組相比，LPS 組中IL-1β 表達升高，IL-10 表達下降（P<0.05）；與LPS 組相比，LPS+WIN 組在WIN 預處理后IL-1β表達相對下降而IL-10 表達升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。此外，LPS+WIN+MHY1485 組與LPS+WIN 組相比，IL-1β 表達升高，而IL-10 表達下降（P<0.05），見圖2。

Figure 2. Levels of IL-1β and IL-10 in lung tissues， and lactic acid and LDHA in the serum of mice in each group. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs LPS group； ▲P<0.05 vs LPS+WIN group.圖2 各組小鼠肺組織IL-1β、IL-10及血清乳酸、LDHA水平

5 各組小鼠血清乳酸和LDHA水平

ELISA 檢測各組小鼠血清中糖酵解關鍵指標表達，結果顯示：與control 組相比，LPS 組中乳酸、LDHA 表達顯著增加（P<0.05）；而LPS+WIN 組與LPS 組相比，乳酸、LDHA 表達均下降（P<0.05）。LPS+WIN+MHY1485 組 與LPS+WIN 組相比，乳 酸、LDHA表達增加（P<0.05），見圖2。

6 各組小鼠肺組織mTOR/HIF-1α/PFKFB3 信號通路蛋白變化

Western blot檢測各組小鼠肺組織p-mTOR、HIF-1α、PFKFB3 表達水平，結果顯示：與control 組相比，LPS 組小鼠肺組織p-mTOR、HIF-1α、PFKFB3 蛋白表達顯著增加（P<0.05）； LPS+WIN 組與LPS 組相比，p-mTOR、HIF-1α、PFKFB3 蛋白表達均下降（P<0.05）；LPS+WIN+MHY1485 組與LPS+WIN 組相比，p-mTOR、HIF-1α、PFKFB3 蛋白表達增加（P<0.05）。見圖3。

Figure 3. The protein levels of p-mTOR， HIF-1α and PFKFB3 in the lung tissues of mice in each group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs LPS group； ▲P<0.05 vs LPS+WIN group.圖3 各組小鼠肺組織p-mTOR、HIF-1α和PFKFB3蛋白水平

討 論

在本研究中，我們采用腹腔注射LPS 建立小鼠膿毒癥ALI 模型，造模24 h 后，LPS 組小鼠進食進水量減少，出現精神萎靡、寒戰、呼吸急促、眼角分泌物增多、豎毛等癥狀，肺組織病理學變化出現間質水腫，肺泡明顯萎陷，壞死組織出現，肺泡和間質可見大量炎癥細胞浸潤，肺泡腔可見出血及透明膜形成，肺指數增加，表明小鼠膿毒癥ALI模型制備成功。

在膿毒癥ALI 發展過程中，炎癥反應失調是膿毒癥ALI 的主要特征［15］。WIN 是一種具有抗炎特性的大麻素受體激動劑，本研究發現，LPS+WIN組肺組織病理學結果顯示炎癥浸潤、出血及肺泡塌陷等損傷減輕，肺指數降低，表明WIN 對膿毒癥ALI 具有一定保護作用，激活大麻素受體2 可以緩解膿毒癥ALI［16］。也有研究報道，WIN可逆轉LPS刺激后TNFα、IL-1β 和IL-6的水平，抑制巨噬細胞的M1型活化，發揮抗炎作用［17］，這些研究與本研究結果相一致。

LDH 是糖酵解及糖異生的重要酶系之一，促進糖酵解可以上調Warburg 效應相關酶LDHA 及乳酸的表達，因此，LDHA 及乳酸被認為是糖酵解的關鍵生物標志物［18］。本研究觀察到，LPS 組乳酸和LDHA表達增加，肺水腫及肺組織病理損傷嚴重，表明膿毒癥ALI 伴隨糖酵解水平上升。WIN 處理后糖酵解相關標志物水平下降，同時肺損傷減輕。推測WIN 減輕膿毒癥ALI 的機理，可能是通過調控糖酵解，減輕炎癥反應。Endo 等［19］研究發現，抑制mTOR/HIF-1α信號軸可以降低CD4+T 細胞中TNF-α、IFN-γ 的產生和LDH的表達。Kong等［20］用LPS刺激小膠質細胞后發現，單羧酸轉運蛋白1（monocarboxylate transporter 1， MCT1）可通過HIF-1α/PFKFB3信號軸誘導炎癥因子IL-1β、IL-6 表達增加，敲減MCT1可抑制小膠質細胞極化和糖酵解速率，表明MCT1可能通過促進糖酵解來加速LPS 誘導的小膠質細胞M1 極化，產生促炎作用。本研究發現，LPS+WIN+MHY1485 組經過mTOR 激動劑MHY1485 預處理后，膿毒癥ALI 小鼠肺組織p-mTOR、HIF-1α 及PFKFB3 表達上升，而LPS+WIN 組上述蛋白的表達下調，推測WIN 可能通過mTOR/HIF-1α/PFKFB3信號通路抑制糖酵解。

糖酵解增加與膿毒癥過度炎癥反應密切相關，因此，糖酵解的調節成為膿毒癥干預的潛在策略［21］。Zhong 等［22］發現，在ALI 期間糖酵解增強，用2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG，糖酵解抑制劑）抑制糖酵解后，IL-1β及TNF-α表達降低，說明糖酵解增強后，炎癥因子表達升高，損傷加重。IL-1β 的產生和釋放依賴于炎癥小體的活化。研究發現，IL-1β 可以增加糖酵解速率和PFKFB3 表達，證明PFKFB3 與IL-1β 的產生呈正相關［23］。IL-10 是重要的抗炎因子，通過抑制炎癥反應在膿毒癥過程中發揮重要作用。本研究顯示，LPS+WIN組IL-1β表達下調，抗炎因子IL-10升高，肺組織損傷減輕，而LPS+WIN+MHY1485 組IL-1β 表達增加，而IL-10 水平下降，肺組織損傷加重，呈現出與LPS+WIN 組相反的趨勢，表明MHY1485逆轉了WIN抑制糖酵解和炎癥的作用。因此，推測WIN 可能通過抑制mTOR/HIF-1α/PFKFB3 信號通路，調控糖酵解速率，減少炎癥因子的表達，緩解膿毒癥ALI。

本實驗目前仍存在幾個局限性。首先，本實驗僅在動物實驗水平進行了探討，未在細胞水平進行驗證。其次，WIN 也可能通過其他信號通路發揮作用，仍需進一步深入研究。

綜上所述，在LPS 誘導的ALI 模型中，WIN 通過調控mTOR/HIF-1α/PFKFB3 信號通路，抑制糖酵解，降低炎癥因子的表達，減輕膿毒癥ALI。