GGA2在囊泡轉運和相關疾病中作用的研究進展*

陶逸豪， 拜爾娜·木太力甫▲， 祁正芳， 劉昶吾， 田 園， 韓洋洋，2，3△

（1新疆醫科大學基礎醫學院生物學教研室，新疆 烏魯木齊 830017；2新疆地方病分子生物學重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830017；3西安交通大學醫學部基礎醫學院人體解剖與組織胚胎學系，陜西 西安 710061）

囊泡轉運（vesicle transport）是大分子及顆粒性物質在細胞器間的跨膜轉運方式，參與細胞多項重要的生命活動，如激素分泌、神經遞質的釋放及信息傳遞、天然免疫等，反式高爾基體網絡（trans-Golgi network， TGN）-內體（endosome）運輸作為其中一條途徑，參與跨膜蛋白回收和重復利用［1］。TGN-內體運輸缺陷引起的蛋白平衡紊亂和細胞功能紊亂，與惡性腫瘤、神經退行性疾病及糖尿病等多種疾病聯系密切［2］，如膠質瘤細胞中轉接蛋白（adaptor pro‐tein， AP）復合物1σ3 的減少可抑制腫瘤增殖、侵襲和遷移［3］；高爾基體相關、含γ-銜接蛋白耳（gammaadaptin ear， GAE）的ADP 核糖基化因子（ADP-ribo‐sylation factor， ARF）結合蛋白3（Golgi-associated GAE-containing ARF-binding protein 3， GGA3）功能喪失引起β-分泌酶1（β-secretase 1）軸突積聚導致阿爾茨海默病早期病變［4］。因此明確TGN-內體運輸關鍵蛋白功能及機制對揭示其調控囊泡運輸障礙引起的疾病機理以及尋找治療靶點具有重要意義。

GGA 是一類定位于高爾基體、含有γ-銜接蛋白及ARF 結合特性的單體網格接頭蛋白家族，包含GGA1、GGA2 和GGA3 三個成員［5］。GGA 蛋白以ARF 依賴的方式定位于TGN 和內體中，屬于TGN-內體運輸關鍵蛋白，對網格蛋白包被小泡（clathrincoated vesicles， CCVs）的形成及運輸至關重要［6］。由于GGA 結構具有相似性，過去人們認為GGA 在體內的作用和功能是冗余的，但后來發現在分子內自我抑制機制、泛素結合特性、CCVs 組裝和基因敲除小鼠表型等方面存在差異。本文綜述了GGA2 的結構、GGA2 調控網格蛋白介導的TGN-內體轉運，以及GGA2 的研究進展，如與腫瘤、阿爾茨海默病、2 型糖尿病等疾病的關系。

1 GGA2的分子結構

GGA2基因位于16 號染色體短臂（16p12.2），其蛋白分子量為67 kD。外顯子跳躍導致GGA2 有兩種亞型：GGA2-X1 和GGA2-X2。與GGA2-X1 相比，GGA2-X2 在N 端缺少50 個氨基酸，但保持了C 端兩個異構體的同源性。GGA 蛋白具有4 個結構域：VHS ［Vps27/Hrs/STAM （signal transducing adaptor molecule）］結構域、鉸鏈（hinge）結構域、GAT （GGA and Tom1）結構域和GAE結構域（圖1）［7］。

Figure 1. Domains of GGA2 and vesicle-associated binding molecules. The GGA2 protein is composed of VHS ［Vps27/Hrs/STAM（signal transducing adaptor molecule）］ domain， GAT（ GGA and Tom1） domain， GAE（ gamma-adaptin ear） domain and hinge domain. The VHS domain consists of eight α-helices， recognizing cargo protein classification signals. The GAT do‐main contains four elongated helices， interacting with ADP-ribosylation factor（ ARF）-GTPase. The GAE domain is a sand‐wich structure formed by multiple β chains through hydrophobic bonds， which binds auxiliary proteins to regulate the cohe‐sion function of GGA2. The hinge domain binding clathrin is the structural basis of GGA2 binding. MPR： mannose 6-phos‐phate receptor； GLUT4： glucose transporter 4； SorLA： sorting protein-related receptor A； EGFR： epidermal growth factor receptor.圖1 GGA2結構域及囊泡相關結合分子

（1）VHS結構域：由8個α螺旋組成，可識別貨物蛋白共有的酸性簇二亮氨酸（acidic cluster-dileu‐cine， ACLL）分類信號，并受到磷酸化的調控［8-9］。然而，GGA2 與分選蛋白受體A（sorting protein-related receptor A， SorLA）的相互關聯不限于ACLL 而依賴貨物蛋白中單一的酸性殘基和完整的雙亮氨酸（dileucine）［10］。同GGA1/3 相比，GGA2 在第6 和7 個α 螺旋之間的環中存在顯著差異［11］。VHS 結構域結合磷脂酰肌醇4-激酶β（phosphatidylinositol 4-kinase beta， PI4KB）后，加速CCVs 的形成［12］。（2）鉸鏈結構域：該結構域在GGA之間相似性較低，不同于GGA1/3，GGA2 鉸鏈結構域不含ACLL 序列，無法和自身VHS 結構域綁定實現分子內自我抑制［13］。鉸鏈結構域中2 個保守序列LIDLE 和LLDLL 識別網格蛋白后與之綁定，是GGA2 在TGN-內體轉運中紐帶作用的結構基礎［14］。（3）GAT 結構域：包含4 個螺旋，最長螺旋由N端螺旋-環-螺旋和C端三螺旋束組成［15］。N端亞區與ARF-GTP 酶作用，促使GGA2 由胞漿定位到TGN［16］。（4）GAE 結構域：由多條β 鏈通過疏水鍵形成的“三明治”結構，與AP 復合物1（AP complex-1，AP-1）的GAE 結構域和AP-2 的α 亞基同源。GAE 結構域與Rabaptin-5、epsin、γ-synergin、p56、p200 等輔助蛋白綁定以調節GGA2 的銜接功能，這些輔助蛋白含共同序列DFXX?（? 代表色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸）［17-18］。

2 GGA2調控網格蛋白介導的TGN-內體轉運

TGN 是細胞內囊泡運輸的主要交通樞紐，參與蛋白質的包裝與分類［19］。GGA2 主要調控網格蛋白介導的TGN-內體轉運，涉及的蛋白包括小G 蛋白、銜接蛋白、網格蛋白和輔助蛋白，其中銜接蛋白是囊泡形成和轉運的關鍵蛋白，包括異四聚體（銜接蛋白復合物AP 家族）和單體蛋白（GGA 家族）兩類。GGA2 通過以下機制調控TGN 與內體之間運輸：GGA2 的GAT 結構域與ARF-GTP 酶和磷脂酰肌醇4-磷酸（phosphatidylinositol 4-phosphate， PI4P）相互作用后，GGA2 被招募至TGN，然后VHS 結構域識別貨物蛋白ACLL分類信號，并通過鉸鏈結構域與網格蛋白相連，這些蛋白被裝配形成CCVs，出芽的CCVs 被錨定至內體并與之融合，輔助蛋白在此過程中調節GGA2 的銜接功能［20］。此外，GGA2 還調控質膜轉運，如調節皮質神經元質膜表面的α2B-腎上腺素受體（α2B-adrenergic receptor， α2B-AR）水平［21］。

2.1 GGA2與GGA1/3的不同點 GGA 蛋白在TGN-內體轉運中功能大部分冗余，但也有各自特異的功能，如在HeLa 細胞中過表達含DXXLL 分選信號的CD8嵌合體（一種GGA介導的貨物蛋白）編碼基因，3種GGA 在核周膜上的定位都顯著增加，但只有GGA2 降解減少，總體表達水平顯著提高［22］，說明CD8 嵌合體的TGN-內體轉運可能主要由GGA2介導。

2.1.1 GGA2 被單獨募集至TGN GGA 蛋白都介導甘露糖6-磷酸受體（mannose 6-phosphate receptor，MPR）的分揀。沉默GGA2不會改變GGA1/3、陽離子依賴型MPR 或陽離子非依賴型MPR 的細胞內總體分布，過表達GGA2 VHS-GAT 結構域的編碼基因不影響3 種GGA 在TGN 的定位，過表達GGA1/3 VHSGAT 結構域的編碼基因也不影響GGA2 在TGN 的定位，即GGA2單獨于GGA1/3定位至TGN［23］。

2.1.2 GGA2 參與PI4KB 介導的正反饋 GGA2 與PI4KB 的綁定促進GGA2 在TGN 的聚集，PI4KB 催化磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol， PI）合成PI4P，正反饋募集更多GGA2 定位至TGN。雖然GGA1/3 也有以上機制，但PI4KB 優先與GGA2 的VHS 結構域相互作用觸發正反饋機制，且只有抑制GGA2 會改變TGN中PI4KB水平［12］。

2.1.3 GGA2 無法發生分子內自我抑制 MPR 的TGN-內體轉運主要由GGA2 介導。這是由于GGA1/3 鉸鏈結構含ACLL 分子信號，該信號上游的絲氨酸被酪蛋白激酶2（casein kinase 2）磷酸化后，與自身的VHS 結構域綁定，形成一種阻止與MPR 結合的自我抑制狀態。而GGA2 鉸鏈區無ACLL 分子信號，不能發生這種自我抑制，GGA2 的VHS 結構域中暴露的ACLL 分類信號識別MPR 后啟始TGN-內體轉運［13，24］。以上可能也是GGA1/3 釋放貨物的一種機制。

2.1.4 GGA2 無法調控泛素化蛋白轉運 GGA2 與泛素親和力遠低于GGA1/3，無法調控泛素化蛋白轉運。GGA2 不參與主要尿蛋白（major urinary protein）泛素化后運往溶酶體降解［25］。β 位點淀粉樣前體蛋白裂解酶1（β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1， BACE1）泛素化后，在GGA3介導下移至溶酶體并被降解［26］。同種貨物蛋白也表現出泛素親和力的差異：表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）刺激后，GGA3 促進表皮生長因子受體（epider‐mal growth factor receptor， EGFR）泛素化，并被溶酶體降解，而GGA2 調控EGFR 逃避泛素化的質膜循環途徑，減少EGFR 降解［23］。以上結果也說明，GGA1/3與泛素的高親和力是其參與泛素化途徑降解貨物蛋白的前提。

2.2 GGA2 與AP-1 在功能上協同且互補 AP-1 蛋白同時調控TGN-內體和內體-TGN 轉運［7］，其GAE可與GGA2 相互關聯［27］，兩者在TGN-內體轉運的關系一直是研究熱點。GGA2 與AP-1 可在包裹MPR 的CCVs 共定位，如果GGA2 先與MPR 結合，共定位將很難發生，說明GGA2 和AP-1 相互作用完成MPR 的CCVs裝配［24］。Hirst等［28］得出了類似結論：敲除AP-1使GGA2意外缺失，GGA2與AP-1以相互依賴的方式裝配到CCVs 中。還有研究顯示GGA2 和AP-1 裝配至CCVs 的時間順序，GGA2 首先定位至TGN，誘導PI4KB 催化合成PI4P，隨后AP-1 被招募至TGN［29］。GGA2 與AP-1 雖含相同的銜接功能，但不會相互排斥而具有協同作用。Doray 等［30］也檢測到兩者在功能上互補，GGA 與AP-1 共同介導MPR 的分選，新合成的酸性水解酶含甘露糖6-磷酸（mannose 6-phos‐phate， M6P）標簽，與MPR 結合后在銜接蛋白幫助下運往溶酶體。沉默GGA2使組織蛋白酶D（cathepsin D， CTSD）的分選效率從97% 下降到73%，剩余CTSD的分選由AP-1介導。

2.3 GGA2 介導貨物蛋白轉運 Arn1 是酵母中的鐵色素轉運蛋白。沒有鐵色素刺激時，GGA2 介導Arn1的TGN-液泡轉運使之降解［31］。GGA2也介導酵母中雙堿基內肽酶（paired-basic endopeptidase）的TGN-液泡前體（prevacuolar compartments， PVCs）轉運。雙堿基內肽酶中第780 位絲氨酸磷酸化后識別GGA2起始TGN運往PVCs［32］。

G 蛋白偶聯受體α2B-AR 是迄今唯一觀察到的不與GGA2 典型分類信號結合的貨物蛋白，而與GAE結構域結合，形成一種獨特的運輸機制，觸發α2B-AR從TGN 運往質膜。GGA2 還調節α2B-AR 的功能，沉默GGA2會抑制α2B-AR 介導的細胞外信號調節激酶激活和環磷酸腺苷水平降低［21］。此外，GGA2還介導SorLA［10］、EGFR［33］等分子的TGN-內體轉運（表1）。

表1 GGA2與貨物蛋白的結合位點Table 1. Binding site of GGA2 to cargo proteins

3 GGA2與疾病的關系

3.1 GGA2與癌癥的關系

3.1.1 GGA2 在惡性腫瘤中的異常表達 GGA2 在一些腫瘤高表達或低表達。GGA2 在30.8%的肝細胞癌和23.3%的結直腸癌中表達上調，并可能支持肝癌和結直腸癌組織生長［33］。GGA2 在伴t（8；16）（p11；p13）易位的小兒急性髓系白血病（acute myeloid leukemia， AML）中高表達，其相對表達中位數高達其他小兒AML 患者的10.7 倍。在AML 細胞系敲除GGA2后，沒有觀察到細胞顯著增殖或凋亡，是否通過其他途徑影響白血病有待研究［42］。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白2A（cyclin-dependent kinase in‐hibitor 2A， CDKN2A）在胰腺癌腫瘤中表達上調，且是胰腺癌預后不良的危險因素，而CDKN2A基因拷貝數變異的胰腺癌中GGA2 表達水平顯著降低［43］。合并人乳頭瘤病毒感染的頭頸部鱗狀細胞癌中GGA2表達水平顯著高于普通頭頸部鱗狀細胞癌［44］。Yang 等［45］研究證明，GGA2的SNP rs2285521（T>C）位點突變致使肺癌風險顯著增加，尤其對于吸煙群體。該突變改變了GGA2的環-莖-環（loop-stem-loop）二級結構。根據GTEx數據庫（https：//www.gtexportal.org/home/）和TCGA 數據庫（https：//portal. gdc. cancer.gov/）中肺組織數據顯示，SNP rs2285521（T>C）位點突變降低GGA2 表達水平，且在肺鱗癌中尤為明顯。關于該突變的潛在分子剪接機制及功能有待探索。此外，根據UALCAN 數據庫（http：//ualcan.path.uab.edu/），GGA2 在肺腺癌（lung adenocarcinoma， LAC）和腎透明細胞癌中顯著低表達，均為預后不良的危險因素。GGA2在不同腫瘤中表達、預后及作用機制的總結見表2。GGA2 可能參與以上腫瘤的發生發展，其與癌癥的聯系尚未充分探討。

表2 GGA2在腫瘤中異常表達、預后情況及已知促癌機制Table 2. Abnormal expression of GGA2 in cancer， prognosis and known cancer promotion mechanism

3.1.2 GGA2對腫瘤惡性行為的調控作用 腫瘤異常增殖是腫瘤惡性行為之一。存在于Rab11a 陽性循環內體的AP-1和GGA2促進部分逃脫泛素化途徑的EGFR 通過回收利用回到質膜，維持細胞表面EG‐FR 水平，促進癌細胞的生長［46］。目前已知GGA2 結合AP-1 的EAR 結構域可間接識別EGFR［46］，但兩者在EGFR 循環途徑的關系仍不清楚。在LAC 細胞系中，GGA2與EGFR 具有協同效應：增加EGFR拷貝數激活GGA2轉錄和增強GGA2 活性；GGA2 通過增加EGFR 穩定性延長其活性，并促進LAC 細胞增殖［47］。酪氨酸激酶抑制劑治療EGFR 驅動的LAC 已在臨床上取得成效，抑制GGA2 使LAC 對酪氨酸激酶抑制劑治療增敏，是LAC 聯合治療策略的潛在治療靶點［46］。靶向AP-1/GGA2也可阻斷多個受體蛋白酪氨酸激酶（receptor protein tyrosine kinase）介導的腫瘤信號通路，GGA2缺失降低細胞中酪氨酸激酶間充質-上皮轉化因子（mesenchymal-epithelial transition fac‐tor， MET）和Erb-B2受體酪氨酸激酶4（Erb-B2 recep‐tor tyrosine kinase 4）水平，從而抑制非小細胞肺癌生長。MET 是一種肝細胞生長因子酪氨酸激酶受體，在肝癌中高表達，GGA2可能對肝細胞癌生長有重要影響［46］。

癌細胞的遷移和侵襲是導致腫瘤進展的重要因素。甘氨酸延伸型胃泌素（glycin-extended gastrin）通過促進GGA2介導的基質金屬蛋白酶1（matrix metal‐loproteinase-1， MMP-1）和MMP-3 分泌，提高結腸癌細胞侵襲性［51］。敲減GGA2抑制β1-整合素再循環至質膜，并降低局灶性黏附中β1-整合素活性，抑制癌細胞的遷移和侵襲能力［52］。

3.2 GGA2 對阿爾茨海默病的調控作用 淀粉樣β前體蛋白（amyloid-β precursor protein， APP）依次經β-和γ-分泌酶水解生成β-淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ），這兩種分泌酶被認為是阿爾茨海默病的主要治療靶點［53］。在海馬組織中，所有GGA 蛋白都在海馬神經元中表達，而只有GGA2 在星形膠質細胞中表達，GGA2在海馬星形膠質細胞的特殊作用有待研究［54］。雖然星形膠質細胞的數量是神經元的5 倍，并已在星形膠質細胞中觀察到APP 水解，但β-分泌酶水平較低，生成的Aβ 是否是阿爾茨海默病患者Aβ 的主要來源仍存爭議［40］。GGA2 介導SorLA 從TGN至內體或內體之間轉運，SorLA將APP從β-分泌酶活性最佳的早期內體分揀至再循環內體（endocytic recycling compartment），通過非淀粉途徑減少Aβ 生成，而GGA2缺失會誘導SorLA 進入降解途徑［55］。β-分泌酶ACLL 分類信號中絲氨酸殘基磷酸化識別GGA2，觸發β-分泌酶運至早期內體以水解APP［56］。GGA2 參與APP 轉運及水解，但2 條途徑最終作用相反，最終對阿爾茨海默病的影響仍需確定。

3.3 GGA2 參與2 型糖尿病發生 足細胞是唯一表達GGA2 的腎小球細胞，在胰島素刺激下，GGA2 與銜接蛋白CD2 相關蛋白（CD2-associated protein，CD2AP）共同綁定網格蛋白，將新合成或從質膜內化的葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporter 4， GLUT4）補充至GLUT4 儲存囊泡（GLUT4 storage vesicles，GSVs），GSVs 轉移到質膜維持血糖穩定。在肥胖相關性腎小球病進展中，代謝紊亂使足細胞損傷，糖代謝改變尤其是GGA2 介導的胰島素抵抗，與2 型糖尿病患者的糖尿病腎病發生有關［57］。

3.4GGA2是黃芩苷和茉莉苷治療腦缺血的關鍵驅動基因 腦缺血是一種常見的急性腦血管病，已在發展中國家成為繼心臟病和腫瘤的第三大致死病因［58］。Li 等［59］研究表明，黃芩苷和茉莉苷通過FoxO信號通路等多個通路在腦缺血治療發揮聯合作用，并確定GGA2作為其中一個關鍵驅動基因發揮作用，但在黃芩苷和茉莉苷聯合治療中的機制尚不清楚。

4 結語

GGA2 結構和囊泡運輸的研究主要集中在10 年前，然而GGA2 在TGN-內體轉運中的銜接功能是其主要的生物學特性，不可避免地需要對GGA2 與TGN-內體轉運的關系進行闡述。相較于GGA1/3，GGA2 在調控網格蛋白介導的TGN-內體轉運中發揮獨特和更重要的功能。GGA2 通過介導具重要生物意義的蛋白轉運調控許多病理過程，如腫瘤增殖、遷移和侵襲，阿爾茨海默病，2 型糖尿病，以及腦缺血。GGA2/AP-1 調控的EGFR 回收利用可作為一種潛在抗癌策略，但GGA2 在癌癥方面的研究不多，大多停留在GGA2 的表達異常，其與癌癥中的聯系尚未被充分探討。此外，在小鼠中敲除GGA2而不是GGA1/3導致胚胎或新生兒的高致死率，存活下來的小鼠出生時體重嚴重減輕，在成年后保持矮小的體型［33，60］，GGA2敲除致死機制仍有待研究。GGA2 介導其他具有重要生物意義的蛋白轉運和除囊泡運輸外的機制仍需深入探索，以期為臨床治療提供新的策略和靶點。