小鼠甲狀腺原代細(xì)胞的快速培養(yǎng)和鑒定*

譚秋嬋， 林嘉偉， 陽小雅， 潘 麗， 姚丹丹， 王立偉， 陳麗新， 巫株華

（1廣州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510450；2佛山市第一人民醫(yī)院乳腺外一科，廣東 佛山 528000；3暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632；4廣東省結(jié)核病控制中心，廣東 廣州 510630）

甲狀腺功能亢進(jìn)和減退與甲狀腺細(xì)胞的異常增殖和凋亡以及激素合成過程障礙相關(guān)［1-2］。甲狀腺原代細(xì)胞無疑是研究甲狀腺內(nèi)分泌課題的重要手段。國內(nèi)外較多文獻(xiàn)報(bào)道人甲狀腺細(xì)胞的原代培養(yǎng)，而正常甲狀腺人體組織較難獲得，多來源于甲狀腺腫瘤旁的正常組織［3-6］，難以滿足研究需求。小鼠因繁殖方便又易于進(jìn)行基因操作，成為了實(shí)驗(yàn)室最佳的模式生物。但小鼠甲狀腺小，細(xì)胞不易分離，目前關(guān)于小鼠甲狀腺原代細(xì)胞培養(yǎng)的報(bào)道較少［7］，方法較難復(fù)制。因此，本項(xiàng)工作擬報(bào)道一種能快速成功培育具備良好內(nèi)分泌功能的小鼠甲狀腺原代細(xì)胞的方法，為甲狀腺疾病研究奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

SPF 級(jí)FVB 小鼠20只，雌雄不限，6～8周齡，18 ～20 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK（粵）2020-0002（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作符合《赫爾辛基宣言》的原則）。二型膠原酶（Invitrogen）；兔Anti-Thyroglobulin（Abcam）；小鼠總?cè)饧谞钕僭彼幔╰otal triiodothyronine，TT3）和小鼠總甲狀腺素（total thyroxine，TT4）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒（Bio-Swamp）；PrimeScript TM RT reagent Kit 和 2 X Tap PCR Master Mix 試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］。

甲狀腺原代細(xì)胞培養(yǎng)液［8］：由DMEM：F-12（GIB‐CO）配制而成，內(nèi)含5%胎牛血清（Gibco）、促甲狀腺激素10 IU/L（Sigma）、轉(zhuǎn)鐵蛋白5 g/mL（Sigma）、生長(zhǎng)抑素10 g/L（Sigma）、氫化可的松3.6 g/L（Sigma）、氨酞一組胺酞一賴氨酞醋酸鹽10 g/L（SANTA CRUZ）、胰島素1 g/mL（中國藥品生物制品檢定所）、青霉素（10 kU/mL）/鏈霉素（10 g/L）1%（北京百奧萊博科技有限公司）。

2 方法

2.1 甲狀腺原代細(xì)胞培養(yǎng) （1）摘取組織：摘取20只小鼠甲狀腺（與甲狀軟骨及其上下氣管一并摘取以保證甲狀腺的完整性，見圖1），迅速將組織放入含無菌磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline， PBS）的EP 管中；（2）機(jī)械性消化：在體視顯微鏡下觀察并剝離甲狀腺，除去表面筋膜，用1 mL 無菌注射器針頭將組織切成1 mm×1 mm×1 mm 小塊；（3）化學(xué)性消化：將組織均分轉(zhuǎn)入4 支1.5 mL EP 管中，分別加入400 mL 1 g/ L 二型膠原酶（用含10% 胎牛血清的DMEM：F-12 配制）；37 ℃孵箱消化，每5 min 用手搖晃一次；4 組消化時(shí)間分別為15、25、35 和45 min。終止消化后，用1 mL 移液槍吹打組織10～15 次，200目篩網(wǎng)過濾消化液；157 ×g 離心5 min ；加入PBS 重懸，再離心；（4）無菌培養(yǎng)：棄上清，加入1 mL 培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L并接種到6孔板中，每孔加入1 mL 細(xì)胞懸液和1 mL 培養(yǎng)液，觀察后在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日半量換液。

Figure 1. Schematic diagram of mouse thyroid gland extraction.A： pre-thyroidectomy photograph； B： extraction of tra‐chea and thyroid gland.圖1 摘取小鼠氣管及甲狀腺示意圖

2.2 免疫熒光檢測(cè)TG 將消化好的甲狀腺原代細(xì)胞接種于直徑22 mm的圓形玻片上。在培養(yǎng)第3天，根據(jù)免疫熒光的步驟檢測(cè)甲狀腺原代細(xì)胞TG 的表達(dá)。

2.3 檢測(cè)TT3、TT4 分別在第3、5、7、10 和14 天吸取6 孔板中的上清液檢測(cè)TT3 和TT4 的表達(dá)，檢測(cè)步驟參照Bio-Swamp的ELISA試劑盒的說明書。

2.4 檢測(cè)相關(guān)基因mRNA 的表達(dá) 分別在第3、7、10 和14 天，采用苯酚法收集甲狀腺細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR，檢測(cè)甲狀腺球蛋白（thyroglobu‐lin，TG）、甲狀腺過氧化物酶（thyroid peroxidase，TPO）、鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體（sodium-iodine isotransporter，NIS）、促甲狀腺激素釋放激素受體（thyrotropin-re‐leasing hormone receptor，TSH-R）等基因的mRNA 表達(dá)，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 消化最佳時(shí)間

消化即刻觀察顯示，在25 min 之前，組織消化不徹底，鏡下細(xì)胞少；25 min 之后消化雖徹底，但能看到較多單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞碎片，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞碎片更多；消化25 min 組則能看到較多的細(xì)胞團(tuán)和部分單個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h 后觀察，消化25 min 組的細(xì)胞狀態(tài)最好、密度最大（見圖2）。

Figure 2. Immediately observation of cells at different digestion time points and the observation after 24 h of culture. A： the 15 min digestion group； B： the 25 min digestion group； C： the 35 min digestion group； D： the 45 min digestion group. The cells digested for 25 min grew best after 24 h. Most cell masses and some individual cells were observed in this group after digest immediately.圖2 不同消化時(shí)間的細(xì)胞即刻觀察和培養(yǎng)24 h后觀察

2 甲狀腺原代細(xì)胞的觀察

培養(yǎng)第2 天，濾泡上皮細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞呈島狀生長(zhǎng)，具有一定的三維結(jié)構(gòu)；第3 天開始細(xì)胞迅速生長(zhǎng)，3～7 d 內(nèi)細(xì)胞分散生長(zhǎng)，形態(tài)多種多樣，多呈不規(guī)則；在第5～7 天出現(xiàn)次級(jí)濾泡結(jié)構(gòu)。隨后次級(jí)濾泡結(jié)構(gòu)逐漸消失，細(xì)胞密度越來越大，細(xì)胞形態(tài)逐漸拉長(zhǎng)（見圖3）。

Figure 3. Observation of primary thyroid cells in mice under microscope. A： day 3； B： day 5； C： day 7； D： day 10； E： day 14.圖3 小鼠甲狀腺原代細(xì)胞鏡下觀察

3 甲狀腺原代細(xì)胞鑒定

由圖4可見，培養(yǎng)第3～5天的甲狀腺細(xì)胞的胞質(zhì)中可觀察到TG 特異性熒光。所得的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞占原代培養(yǎng)細(xì)胞的95%以上。

Figure 4. Identification of mice primary thyroid cells. A： the nucleus were stained by Hoechst （blue）； B： TG was dyed with 488 green fluorescence； C： the merged image of nucleus and TG in primary thyroid cells.圖4 小鼠甲狀腺原代細(xì)胞鑒定

4 14 d 內(nèi)小鼠甲狀腺細(xì)胞分泌TT4 和TT3 的變化趨勢(shì)

由圖5 可知，小鼠甲狀腺原代細(xì)胞在培養(yǎng)14 d內(nèi)TT3 和TT4 的分泌水平有下降趨勢(shì)。培養(yǎng)第7 天分泌量仍能達(dá)到60%；第10 天分泌量降至50%以下（P<0.01）；第14天降至30%以下（P<0.01）。

Figure 5. The TT4（ A） and TT3（ B） secretion changes of mouse thyroid cells within 14 d. Mean±SEM. n=3. P<0.05 vs 3 d.圖5 小鼠甲狀腺原代細(xì)胞TT4和TT3分泌水平14 d內(nèi)的變化

5 甲狀腺原代細(xì)胞14 d內(nèi)特異基因的表達(dá)

RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，第7 天培養(yǎng)的甲狀腺原代細(xì)胞的TG、TPO、NIS和TSH-R等基因的表達(dá)能保持98%以上，培養(yǎng)第10 天的表達(dá)量均有下降（P<0.05），但能維持在50%以上，而上述基因在14 d 的表達(dá)量降低至40% 以下，甚至更低（P<0.01），見圖6。

Figure 6. The mRNA expression of specific genes in mouse thy‐roid primary cultured cells within 14 d of culture.Mean±SEM. n=3. P<0.05 vs 7 d.圖6 培養(yǎng)14 d 內(nèi)小鼠甲狀腺原代培養(yǎng)細(xì)胞特異性基因的mRNA表達(dá)

討 論

目前，常見的甲狀腺細(xì)胞株主要有大鼠細(xì)胞系FRTL5 以及人類細(xì)胞系Nthy-ori 3-1。Nthy-ori 3-1 在人甲狀腺疾病的研究中有種屬上的優(yōu)勢(shì)，但因其不具有分泌功能，不適用于甲狀腺分泌功能障礙的研究［9-10］；FRTL-5 雖具有良好的吸碘能力和分泌功能［11］，但其不死性證明其已經(jīng)失去了一些細(xì)胞周期的基本控制機(jī)制［12］。因而，原代細(xì)胞用于甲狀腺疾病研究有相對(duì)的優(yōu)勢(shì)。目前，人甲狀腺原代細(xì)胞多來源于甲狀腺腫瘤旁組織［13］，因此，這些細(xì)胞可能已失去了一些甲狀腺的特征。隨著細(xì)胞適應(yīng)體外生長(zhǎng)條件，其可能無法保持在正常甲狀腺功能和信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用的重要特征［14］。選擇小鼠甲狀腺原代細(xì)胞作為甲狀腺疾病的研究對(duì)象，既簡(jiǎn)便又利于開展轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［15］。本研究摸索了一種快速且簡(jiǎn)便易行的小鼠甲狀腺細(xì)胞的培養(yǎng)方法，成功培養(yǎng)了具有甲狀腺特性和分泌功能的原代細(xì)胞。

甲狀腺原代細(xì)胞培養(yǎng)的難點(diǎn)主要有兩方面。（1）無菌操作。整個(gè)分離過程涉及的步驟多，因而容易導(dǎo)致污染，每一步都需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，所有器械都是無菌器械，操作環(huán)境需提前紫外消毒30 min。（2）消化時(shí)間。此前有關(guān)小鼠甲狀腺細(xì)胞培養(yǎng)的研究所報(bào)道的消化時(shí)間基本在60～120 min［7，16-17］。本研究通過優(yōu)化取材方式及消化酶的配比，摸索出的最佳消化時(shí)間為25 min，大大縮短了消化時(shí)間，可降低研究人員的時(shí)間成本。當(dāng)甲狀腺消化成部分濾泡和部分單個(gè)或多個(gè)黏著細(xì)胞的消化狀態(tài)時(shí)，其細(xì)胞數(shù)量和活性最佳，細(xì)胞在第2 天均可貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞在培養(yǎng)第5～7 天左右出現(xiàn)了特殊的二維結(jié)構(gòu)－次級(jí)濾泡結(jié)構(gòu)，后續(xù)我們將對(duì)該結(jié)構(gòu)的功能進(jìn)一步探究。

甲狀腺原代細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)液的要求較高，為了能讓小鼠甲狀腺細(xì)胞的特性能保持更長(zhǎng)時(shí)間，我們?cè)谂囵B(yǎng)液中加入了6 種特殊的物質(zhì)。Ambesi-Impiombato 等［8］最早使用該培養(yǎng)液來進(jìn)行甲狀腺細(xì)胞的培養(yǎng)，稱為6H 物質(zhì)。Wang 等［18］通過此方法對(duì)人的甲狀腺細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)8 d內(nèi)大部分基因表達(dá)仍與正常組織一致，但少部分基因表達(dá)下降。在前人的基礎(chǔ)上，我們僅對(duì)原代細(xì)胞進(jìn)行14 d 內(nèi)的觀察，顯示7 d 內(nèi)細(xì)胞仍能正常分泌TG 蛋白和甲狀腺激素，提示7 d內(nèi)細(xì)胞分泌功能良好。觀察特異性基因的表達(dá)，顯示10 d 內(nèi)其表達(dá)量仍較高，14 d 之后下降較為明顯，這提示培養(yǎng)10 d 以內(nèi)的細(xì)胞用于基因的研究較為合適。

為了更好地保證細(xì)胞特性，我們并沒有對(duì)小鼠原代細(xì)胞進(jìn)行傳代和凍存。但后續(xù)將會(huì)考慮進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)技術(shù)，探索其傳代后特性和功能的變化規(guī)律，以期獲得可長(zhǎng)期培養(yǎng)且性能穩(wěn)定的小鼠原代甲狀腺細(xì)胞培養(yǎng)系。