高滲環境調控鈣黏蛋白表達并影響擬胚體分化*

許健宜， 吳引弟， 方麗君， 蔣虹婧， 孫盱衡， 劉 青， 肖 聰， 林展翼△

［1華南理工大學醫學院，廣東 廣州 510006，2南方醫科大學附屬廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院），廣東 廣州 510180］

誘導多能干細胞具有多功能的分化潛力和倫理優勢，已成為多種疾?。ㄈ缤诵行约膊?、心肌損傷、骨組織再生等）治療與研究的潛在種子細胞來源［1-3］。擬胚體（embryoid body， EB）是多能干細胞在懸浮培養中形成的三維細胞聚集體［4］，可以響應生物力學信號［4］，編程為特定細胞譜系，對心肌細胞［5］、神經細胞［6］和血管細胞［7］等依賴于初始EB 步驟的定向分化至關重要。然而，誘導多能干細胞廣泛臨床應用的挑戰之一是高效地引導其進入特定譜系，因為單純依賴EB 的自發分化常導致分化多樣性不可控［8］。越來越多的研究者開始關注EB 分化影響因素的研究，希望通過理清各種體外影響因素的規模化調控，實現EB的可擴展和可重復分化［9］。

細胞外環境中的物理信號，例如力學刺激［10］、幾何形狀和剛度等［4，9］，對于譜系規范有著重要影響。另外已有研究表明，細胞大小和細胞形態對細胞狀態和分化表型有著顯著影響［11-13］，由于滲透壓能夠直接影響細胞的大小和形態，因此，本研究考慮環境中滲透壓也是規范化調控過程中必不可少的因素之一。聚 乙 二 醇300（polhethylene glycol 300， PEG 300）是一種非離子型的水漿性聚合物，已被用于改變培養液滲透壓，GUO 等［14］研究者表明，添加2%的PEG 300后，細胞大小和力學在2 min內達到平衡，并且無明顯的細胞毒性。但對于培養液中的滲透壓對EB的分化影響尚不明確。

在細胞動態變化的過程中，細胞黏附分子提供了從細胞到細胞外環境、以及細胞之間的雙向信號通路［15］。物理信號能夠通過細胞黏附分子來激活細胞外基質和細胞間的相互作用，從而影響細胞的形成和分化。上皮鈣黏蛋白（E-cadherin， CDH1）和神經鈣黏蛋白（N-cadherin， CDH2）是兩種重要的細胞黏附分子，參與維持細胞之間的物理連接，并直接或間接地調節細胞狀態和細胞分化［16-17］。例如，在干細胞培養過程中，CDH1介導的細胞間黏附會改變細胞和細胞集落的形態，可能激活參與維持未分化狀態或致力于特定譜系的信號通路［18-19］。此外，研究還發現CDH1 和CDH2 分子與成骨分化［20］、神經分化和中胚層分化［21-22］等過程密切相關。

本研究旨在闡明高于常規培養液的滲透壓對EB 分化的影響，并探討其潛在的作用機制，以促進EB 直接分化為給定的細胞類型的穩定性和可重復性，從而提高其在疾病研究的應用潛力。在不同滲透壓力的培養液中，本研究觀察到EB 的分化行為與滲透壓之間存在一定的相關性兩組EB 中的細胞黏附因子CDH1 和CDH2 表達存在差異，特別是CDH2的差異表達更加顯著。這些差異影響了滲透壓導致的EB 分化方向變化，即在較高滲透壓條件下培養的EB 顯示出更強的中胚層譜系承諾趨勢和更低的外胚層譜系承諾趨勢。通過使用TGF-β 特異性抑制劑SB431542 改變CDH2 的表達水平，觀察到高滲透壓培養液中胚層標志物的高表達趨勢被抑制，同時外胚層標志物的表達上調。這提示高滲透壓可以通過調節CDH2來改變EB的分化方向。這些結果表明環境滲透壓是規范干細胞分化的一個關鍵因素，為干細胞在醫學研究中的應用提供了新的視角。

材料和方法

1 實驗對象的準備

1.1 人誘導多能干細胞（human induced pluripotent stem cells， hiPSCs）的培養與傳代 從賽貝公司（中國）購買源于人成纖維細胞的誘導多能干細胞，將其培養于37 ℃和5% CO2的環境中。在培養和傳代前，首先在培養皿上鋪減生長因子的Matrigel?（hESCqualified Matrix，1∶100 in DMEM/F12； Corning），使用mTeSR plus 培養液（STEMCELL Technologies）維持干細胞多能性。每培養4天傳代1次，傳代時盡量保證細胞團聚。

1.2 EB 的培養與形成 在hiPSCs 傳代當天，使用ReLeSR ?（STEMCELL Technologies）收獲并解離hiPSCs。將這些細胞傳代至超低懸浮培養板（Corning）中，培養于mTeSR plus培養液和EB培養液的混合溶液中以形成EB。此混合溶液按照mTeSR plus 和EB 培養液2∶0（傳代當天，第0 天）、2∶1、1∶1、1∶2 和0∶2 的比例每天更換，在第4 天以后只使用EB培養液培養EB。EB 培養液為高葡萄糖DMEM（Gib‐co）中添加10%胎牛血清（Thermo Fisher Scientific）、1%非必需氨基酸（Gbico）、2 mmol/L GlutaMAX（Gib‐co）、0.1 mmol/L 2-巰基乙醇（Sigma-Aldrich）、50 U/mL 青霉素和50 μg/mL 鏈霉素（Thermo Fisher Scien‐tific）。EB 培養階段實驗組將添加不同濃度的PEG 300以改變滲透壓。

2 檢測方法

2.1 測定培養液中的滲透壓 在培養液中添加0%、1%、1.5%、1.75%、2%、2.25%和5%的PEG 300后，通過冰點滲透壓儀（FPOSM-V2.0）測量滲透壓來驗證PEG 300對于提高培養液滲透壓的有效性。

2.2 RT-qPCR 檢測使用Trizol 試劑提取EB 的RNA，每個樣本定量至1 μg。使用反轉錄試劑盒（TaKaRa）對總RNA 進行反轉錄。然后將反轉錄得到的cDNA 與SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）結合，進行RT-qPCR擴增，反應條件：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環。內參照為GAPDH。所用引物詳見表1。

表1 引物序列Table 1. Primer sequences

2.3 Western blot 檢測 使用含有蛋白酶抑制劑（Roche）的RIPA 裂解液提取蛋白質。使用Pierce?BCA 蛋白檢測試劑盒（Thermo Fisher Scientific）對總蛋白濃度進行定量。按每孔20 μg 蛋白的量將樣品加于4%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，樣品總體積不超過25 μL。電泳電壓為100～120 V，持續時間為40～60 min。隨后將凝膠轉移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore），電壓為140-160 V，30 min。轉移后，用1%吐溫20 的三相緩沖鹽水（TBST）配置的5%脫脂牛奶溶液封閉膜。隨后使用特異性Ⅰ抗（GAPDH 抗體，1∶10 000；Tubb3 抗體，1∶50 000；T/Bry 抗體，1∶1 000；histone H3 抗體，1∶10 000；CDH1 抗體，1∶1 000；CDH2 抗體，1∶3 000；p-SMAD3 抗體，1∶2 000）對膜進行孵育。使用ECL 蛋白印跡底物（Pierce）進行化學發光檢測，使用ImageJ 軟件進行灰度值定量分析。所用抗體詳見表2。

表2 抗體信息Table 2. Antibody Information

2.4 免疫熒光染色 培養EB 2、4 和6 d 后，在室溫下用4%多聚甲醛固定30 min，隨后進行石蠟包埋和切片。使用檸檬酸溶液（pH 6.0）在高溫高壓條件下進行抗原修復。自然冷卻后，切片在蒸餾水中沖洗3次，每次5 min。然后使用10%山羊血清封閉，37 ℃孵育30 min。封閉完成后，每個切片上加入Ⅰ抗（CDH1 和CDH2 抗體，1∶200），在4 ℃冰箱中孵育過夜。次日，在每個切片中加入Ⅱ抗，室溫下孵育60 min。使用TBST 洗去Ⅱ抗后，在黑暗環境中用50μL DAPI 工作溶液（Abcam；DAPI 原液按1∶500 稀釋制備）進行5 min 的核染色。完成這一過程后，用熒光封片劑封好切片，避光保存在4 ℃冰箱。拍攝時，使用LSM Meta共聚焦顯微鏡（LSM980；Zeiss）或熒光顯微鏡（Axio vert5；Zeiss）對切片進行拍照。

2.5 CCK-8實驗 將6孔板中一個孔的hiPSCs進行消化后，加入2 mL mTeSR 培養液，然后在低附著96孔板上每孔加66 μL 細胞懸浮液以測定EBs 細胞的活力。移除培養液后，重新添加含有10 μL CCK-8溶液的100 μL 新鮮培養液，分別在培養箱中孵育2 h。接著，使用分光光度計測定細胞在450 nm 處的吸光度，分析細胞活力時采用實驗組與空白組的吸光度值的比值。

2.6 AM/PI 凋亡染色檢測 使用超低吸附懸浮6 孔板培養EB。在實驗當天，首先將培養液棄去，然后使用PBS緩沖液對細胞進行3次洗滌，以確保去除殘留的培養液。隨后，按照AM/PI 染色試劑的使用說明書，加入適量的AM/PI 工作液。接下來，將細胞在37 ℃中避光的條件下孵育30 min。孵育結束后，通過熒光顯微鏡對染色情況進行觀察。

3 統計學處理

使用GraphPad Prism 8 軟件進行統計分析。數據以均數±標準差（mean±SEM）表示。為評估結果的顯著性，采用了獨立樣本Student′st檢驗和單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 PEG 300增加了培養液的滲透壓

如圖1所示，加入PEG 300明顯提高了培養液的滲透壓。隨著PEG 300 濃度的逐漸增加，滲透壓也相應呈上升趨勢，并且這兩者之間表現出顯著的線性關聯（R2=0.998 4，P<0.01）。這些結果表明，PEG 300的使用有效提升了培養液的滲透壓。

Figure 1. Osmotic pressure curve of the culture medium.圖1 培養液滲透壓曲線

2 高滲透壓對EB活力和增殖無明顯毒副作用

為了確認將PEG 300 添加到培養液中對細胞的生物安全性，本研究進行了細胞活力測定。研究比較了在不同滲透壓濃度中的EB 形成形態。在滲透壓濃度較高（4% PEG 300）的情況下，EB 出現散亂不聚集的現象，無法正常存活至培養結束（圖2A）。因此接下來只探究2%濃度PEG 300 與對照組細胞的存活情況。通過對高滲組和對照組的EB進行AM/PI染色檢測結果顯示，兩組EB 中含有相當大比例的活細胞（綠色熒光染色）。EB 的死細胞染色并不明顯（紅色熒光染色，用白色箭頭表示的簇），相較而言，高滲組中紅色熒光更少，并且EB 的形態良好，無明顯凋亡壞死現象（圖2B）。

Figure 2. Activity assay of embryoid bodies（ EBs）. A： suspension cultured EBs in different concentrations of osmotic pressure； B：AM/PI staining to detect the activity of EBs； C： A450 values of suspended EBs from day 0 to day 5 were detected by CCK-8 assay. Mean±SEM. n=5. **P<0.01 vs control group.圖2 擬胚體的活力檢測

CCK-8 實驗檢測了培養過程中EB 的增殖活性情況。CCK-8 實驗的生長曲線顯示，EB 在整個培養周期持續增殖，其中，從第3 天開始，高滲組的細胞較對照組相比優勢增殖率升高，差異均有統計學意義（P<0.01），見圖2C。

3 高滲透壓引起EB 中CDH1 表達維持同時CDH2表達下調

在EB 形成和分化過程中，鈣黏蛋白在細胞連接和功能中扮演重要角色，而CDH1 和CDH2 的表達與EB的分化相關［23-24］。為了探究高滲透壓培養環境對EB 分化方向的影響，檢測了第2、4、6 天高滲組和對照組EB 中CDH1 和CDH2 的表達情況。實驗結果顯示，與第2 天相比，第4 天和第6 天高滲組和對照組的EB 中CDH1（紅色熒光）和CDH2（綠色熒光）熒光強度呈下降趨勢，二者表達呈現相似的變化趨勢。然而，組間比較結果顯示，高滲組的CDH1 的熒光強度更高，而CDH2 熒光強度更低。另外，研究觀察到，高滲組的EB 在第2 天和第4 天表現出規則形態，并形成完整的球形結構，見圖3A、B。

這些結果提示，增加培養液的滲透壓影響了CDH1和CDH2的表達。為進一步探討PEG 300導致的培養液滲透壓變化對EB 中CDH1 和CDH2 表達的影響，我們進行了Western blot 實驗，檢測不同濃度滲透壓中EB 的蛋白表達量。結果顯示，CDH1 和CDH2的表達量與滲透壓濃度相關，隨著滲透壓濃度的升高，CDH2 的表達逐漸下調，而CDH1 總體上呈輕微上升趨勢。相關性統計分析顯示滲透壓與CDH1 和CDH2 的表達存在著直接相關性（P<0.05），見圖3C。

4 高滲透壓對EB中MET進程的影響

由于CDH1 和CDH2 是MET 進程兩個關鍵生物標志物，而順序性EMT-MET 在干細胞命運決定和轉換過程中發揮重要作用［25-26］，為了了解不同滲透壓培養液中EB 的EMT 進程，我們檢測了EMT 相關基因的表達情況，RT-qPCR 結果顯示，EMT 經典標志物（Snail 和Twist）的上下調趨勢不具有統計學意義，vi‐mentin出現明顯上調，CDH1略有上調，而CDH2則明顯下調，見圖4。

Figure 4. The expression of EMT markers in embryoid bodies. Mean±SEM. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs control group.圖4 擬胚體EMT標志物檢測

5 高滲透壓對EB分化方向的影響

在EB 形成過程中，鈣黏蛋白的變化與EB 的分化有著一定關聯性［27］。我們從EB形成的第1天開始檢測了兩組EB 的三胚層標志物的表達情況，以探討高滲透壓培養液和對照組培養液對EB 形成階段分化方向的影響。研究發現，高滲組EB 中的中胚層相關標志物（T/Bry、Eome、Mixl1 和Hand1）的表達在EB的第4天開始顯現（圖5A）。同時，高滲組EB 中胚層標志物的表達量在第4 天或之后顯著高于對照組，提示高滲組EB的中胚層分化趨勢更強。

Figure 5. Expression of differentiation markers in embryoid bodies（ EBs） at different time points. A： the expression of mesoderm-re‐lated markers（ T/Bry， Eome， Mixl1 and Hand1） in the 2 groups of EBs at different time points； B： the expression of endo‐derm-related markers（ Gata4 and FoxA1） in the 2 groups of EBs at different time points； C： the expression of ectoderm-re‐lated markers（ Pax6 and Tubb3） in the 2 groups of EBs at different time points； D： the expression of T/Bry in EBs cultured with different concentrations of PEG 300； E： the expression of pluripotency-related markers （Oct4 and Nanog） in the 2 groups of EBs at different time points. Mean±SEM. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs contorl.圖5 各組擬胚體在不同時點的分化標志物表達情況

內胚層和外胚層相關標志物的表達檢測結果顯示，內胚層標志物的表達趨勢不一致，在高滲組，EB中Gata4 的表達相對高于對照組，FoxA1 無明顯趨勢（圖5B）。高滲組EB中，外胚層標志物Pax6在第4天和第6天的表達量都顯著低于對照組，而Tubb3在第6天的表達量也低于對照組（圖5C）。

在含有不同濃度PEG 300 的培養液中培養EB 6 d后，檢測了中胚層標志物T/Bry的表達情況，以明確滲透壓濃度與中胚層標志物表達情況的關聯性。結果顯示，T/Bry 的表達量隨著培養液滲透壓的增加而增加（P<0.05），見圖5D，提示培養液滲透壓的變化與中胚層標志物的表達存在一定的濃度相關性。

6 高滲透壓對EB多能性的影響

由于CDH2 和CDH1 的表達往往提示EB 的多能性發生了轉變，為了驗證高滲透壓培養液對EB 多能性的影響，檢測了第1 至第6 天EB 的多能性標志物Oct4 和Nanog 的表達情況?？傮w來看，這兩組標志物在時間推移中顯示出一時性的升高趨勢（圖5E）。在高滲組中，Nanog和OCT4在第2至第5天的表達均明顯高于對照組，這可能與高滲組EB 中CDH1 的保持有關［15，21］。

7 抑制p-Smad3上調CDH2并抑制中、外胚層分化

已有研究表明了Smad3 的存在會下調CDH2 的表達水平［28-30］。本研究通過SB431542［21］來抑制p-Smad3 的功能。蛋白相對定量結果顯示，在高滲+抑制劑組（以下簡稱Anti組）中，p-Smad3的表達水平受到抑制，表明SB431542成功抑制了p-Smad3的表達。免疫熒光染色結果顯示，與高滲組相比，Anti 組的CDH2呈現明顯的上調趨勢，其熒光表達強度接近于對照組（圖6B）。此外，Western blot 實驗結果顯示，Anti 組的CDH2 顯著上調（P<0.05），同時CDH1 的表達水平略有下降，表明SB431542 可以調節EB 的CDH2表達水平（圖6A）。進一步的Western blot檢測顯示，Anti 組EB 中胚層的表達情況呈現出T/Bry 表達量明顯下調，同時外胚層標志物Tubb3 的表達水平明顯回升（P<0.05），見圖6C。這提示改變CDH2的表達水平可能調節了EB的胚層分化方向。

Figure 6. Influence of up-regulated CDH2 on differentiation of embryoid bodies（ EBs） in high-osmolarity group. A： Western blot re‐sults for p-Smad3， CDH1 and CDH2 in the 3 groups of EBs； B： the immunofluorescence intensity of CDH2 in the 3 groups of EBs（ scale bar =100 μm）； C： the protein expression levels of T/Bry and Tubb3 in the 3 groups of EBs. Mean±SEM. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs control group； #P<0.05 vs Hyper group.圖6 上調CDH2對高滲組擬胚體分化的影響

討 論

干細胞在微環境中能夠精確感知并傳導生物化學信號進入細胞，對細胞的行為、細胞命運或生長變化產生顯著影響［31，32］。目前，關于較高滲透壓環境因素對于誘導多能干細胞來源的EB 發生發育影響的研究相對較少，本研究為探討組織與培養環境對干細胞的功能與分化的影響提供了新的視角。本研究使用PEG 300 來提高培養液滲透壓。結果顯示，PEG 300對EB沒有即時毒性作用，并且在EB形成過程中能夠維持EB 的良好形態，具有良好的生物安全性。

體外研究已經充分證明了鈣黏蛋白對于干細胞增殖、自我更新、黏附和多譜系分化的調節發揮著重要作用［23-24，27，33-35］。本研究觀察到，培養液滲透壓對EB 的CDH1 和CDH2 的表達水平產生影響。在高滲組中，CDH1 和CDH2 表達量與滲透壓濃度呈顯著的線性相關。然而，與CDH1 相比，高滲組與對照組之間CDH2 表達量的差異更為顯著，表明培養環境滲透壓的提高可能與CDH2 表達水平相關聯相關性更強。由于CDH1和CDH2同時是EMT過程的標志物，其轉變可能與EMT 過程的改變相關，但由于其他的經典EMT 標志物沒有與CDH1 和CDH2 改變相符的趨勢，與EMT-MET 過程的標志物轉變不相符，提示高滲透壓對EMT 過程的影響不甚明顯，CDH1 和CDH2可能是作為獨立因素在發揮作用。

另外，在EB 形成過程中，鈣黏蛋白與中胚層和外胚層分化的最早階段事件相關［27］，了解EB 的三胚層分化情況對于更充分地利用EB 在再生醫學和臨床應用上至關重要。對三個胚層的標志物的表達情況分析顯示，第6 天EB 的中胚層相關標志物表達量顯著高于前4 天，提示EB 的中胚層分化開始于第4天之后。同時，高滲組的中胚層標志物表達量在第4天后顯著高于對照組，提示高滲促進了EB 的中胚層分化效率。相比之下，高滲抑制了EB 的外胚層標志物的表達，但對內胚層標志物的表達影響不明確。

進一步比較不同滲透壓濃度對EB 中胚層分化的影響發現，隨著滲透壓濃度的升高，EB 中胚層標志物的表達明顯增強，并且與CDH1 隨著滲透壓濃度增加而上調、CDH2隨著滲透壓濃度增加而下調的趨勢一致。這提示滲透壓升高可能通過穩定CDH1及抑制CDH2 的表達，從而影響了EB 的分化過程。此外，CDH1可能直接或間接參與多能性相關轉錄因子的表達，進而影響轉錄因子OCT4 的表達［15］。因此，高滲組EB 中多能性相關基因的高表達量可能提示著滲透壓可以通過調節鈣黏蛋白來影響細胞內的這些過程。

Sally 等［21］的研究結果顯示，阻斷CDH1 的下調能夠抑制神經誘導分化，同時促進多能性或中胚層分化。在本研究中，滲透壓引起的CDH1 表達差異并不如CDH2 顯著。相對于高滲組，Anti 組的CDH1降低沒有統計學意義。然而，高滲組與對照組的比較結果顯示，在較高滲透壓環境中，CDH1 的表達量高于對照組，與Sally 等的研究結果一致。這也提示在較高滲透壓環境中，CDH2 可能對EB 的分化扮演更為重要的角色，這與其他關于CDH2 對分化影響的研究相符［28，35-37］。

通過上調高滲組EB 的CDH2 表達，本研究發現Anti 組中胚層標志物的表達量下降，而外胚層標志物的表達量上調。這表明高滲對于EB 分化的影響是可以通過上調CDH2被逆轉的。Pei等人的研究也顯示，在iPSCs 中強制表達CDH2 顯著提高了分化效率，而shRNA 敲低CDH2 則阻斷了神經分化［36］。這些研究結果支持了本研究的發現，即較高滲透壓環境導致CDH1 相對維持而CDH2 下調，尤其是CDH2的下調，對EB 產生傾向于中胚層分化和神經外胚層抑制具有顯著影響（圖7）。

Figure 7. Schematic diagram depicting the influence of hyperos‐motic pressure on the differentiation of embryoid bodies.圖7 高滲透壓影響擬胚體分化示意圖

綜上所述，本研究結果強調了細胞外環境中滲透壓對干細胞分化的重要影響：增加環境滲透壓對EB 的中胚層分化起到了促進作用，而對外胚層分化起到抑制作用。這種作用與較高滲透壓環境引發的CDH1 的維持和CDH2 的下調相關聯。本研究為物理環境因素影響細胞功能提供了新的線索，為基礎醫學研究提供了新的思路。