姜黃素通過下調HO-1/NQO1保護肝癌模型小鼠*

牟海軍， 陳幸幸， 劉安安， 張 麗， 朱加興， 金 海

（遵義醫科大學附屬醫院消化病醫院，遵義醫科大學附屬醫院消化內科，貴州 遵義 563000）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是世界上第六大常見癌癥［1］。其發病率和死亡率占我國惡性腫瘤前5 位［2］。HCC 的發生發展是一個慢性多階段的病理過程，并且伴隨各種基因的改變。抗腫瘤藥物的作用機制也是多種多樣，中藥因其藥效多樣，副作用少，增強免疫力且不易產生耐藥等優點，在腫瘤治療方面一直是人們關注的熱點。姜黃素是中藥材姜黃中含有的一種天然抗氧化物質，可調節細胞周期、增殖、清除氧自由基、抑制腫瘤生長，還具有較強的抗病毒和肝功能保護作用［3-4］。近期研究顯示，姜黃素可能同時作用于多條信號通路發揮抗癌作用。對前列腺癌［5］、結直腸癌［6］、肺癌［7］等疾病均有較好的作用，在腫瘤的防治具有良好的應用前景。本研究采用N-亞硝基二乙胺（N-nitrosodiethylamine，DEN）聯合四氯化碳（carbon tetrachloride， CCl4）誘導C57BL/6J 小鼠肝癌模型，以觀察姜黃素對小鼠肝癌模型發生發展的影響，并探究其機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 SPF 級C57BL/6J 小鼠30 只（雌性20 只，雄性10只），5周齡，體重19～22 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002。動物均飼養于遵義醫科大學附屬醫院實驗動物中心，環境溫度（22±2） ℃、濕度50%±10%、明暗周期 12 h/12 h，自由攝食和飲水。動物實驗經遵義醫科大學附屬醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥品及主要試劑 姜黃素（純度≥75.0%； CAS：458-37-7； CB0346）購自上海生工生物工程股份有限公司；DEN（N0756）購自Sigma；CCl4（C11605036）購自上海麥克林生化科技有限公司；逆轉錄試劑盒（AQ601）、熒光PCR 擴增酶（AE311）和β-actin 抗體（HC201）購自北京全式金生物技術有限公司；血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1， HO-1）、NAD（P）H-醌氧化還原酶1［NAD（P）H-quinone oxidoreductase 1，NQO1］和β-actin引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設計及合成；HO-1 抗體（ab13248）購自Abcam；NQO1 抗體（BM4978）和Ki67 抗體（A00254）購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 主要儀器 5849R 型高速冷凍離心機（Eppen‐dorff）；Icycler IQ 實時熒光定量PCR 儀、GelDoc 型電泳凝膠成像分析儀和DDY-10 型電泳儀（Bio-Rad）；IX53+DP73 倒置顯微鏡（Olympus）；AU680 全自動生化儀（Beckman）。

2 方法

2.1 藥物制備 稱取233、466 和932 mg 姜黃素，分別加入17.5 mL 純凈水攪拌混勻，并陶瓷研缽攪拌研磨混勻為混懸液，4 ℃冰箱保存，每周制備1次。

2.2 動物分組與模型建立 按雌雄比例為2∶1分籠飼養繁殖，取繁殖雄性幼鼠40只，出生后第14天一次性腹腔注射DEN（25 mg/kg），第4 周將小鼠斷乳飼養并隨機分為模型組和藥物組（低、中、高劑量分別為100、200和400 mg/kg），每組10只。另取同齡雄性小鼠10只作為正常對照。從第8周開始，模型組和藥物組灌胃給予CCl4（0.5 mL/kg），每周2 次；藥物組以灌胃方式給予不同劑量姜黃素，每天1次（10 mL/kg）。

2.3 標本采集 第22 周末次給藥后小鼠禁食不禁水，24 h 后稱重，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后眼球取血，1 000×g離心15 min，分離血清?80 ℃保存，切取肝左葉部分組織用10%福爾馬林固定，其余肝臟組織?80 ℃保存備用。

2.4 肝臟組織巨檢 小鼠肝臟取出后生理鹽水洗凈拍照，觀察小鼠肝臟表面，比較各組癌結節數量。

2.5 肝臟組織病理學觀察 福爾馬林固定48 h 后，常規石蠟包埋切片和HE 染色，光鏡下觀察并拍照，觀察小鼠肝臟組織病變。

2.6 血清天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活性的檢測 采用全自動生化儀測定血清中AST和ALT活性，按試劑盒說明書操作。

2.7 RT-qPCR 檢測HO-1 和NQO1 mRNA 表達 取相同部位肝臟組織約50 mg，加入1 mL Trizol UP 組織勻漿裂解，按照試劑盒說明書提取純化RNA，逆轉錄為cDNA 后進行PCR 擴增，擴增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個循環。以β-actin 為內參照，采用2?ΔΔCt法計算HO-1 和NQO1 的mRNA 相對表達水平。NQO1 的上游引物序列為5′-GCA GAT CCT GGA AGG ATG GA-3′，下游引物序列為5′-GGT TGT CAGC TGG AAT GGA C-3′；HO-1 的上游引物序列為5′-TGT CTG AGG CCT TGA AGG AG-3′，下游引物序列為5′-CAG GGC CGT GTA GAT ATG GT-3′；β-actin的上游引物序列為5′-GTG ACG TTG ACA TCC GTA AAG A-3′，下游引物序列為5′-GCC GGA CTC ATC GTA CTC C-3′。

2.8 Western blot 檢測HO-1 和NQO1 蛋白表達取相同部位肝臟組織約100 mg，將肝組織置于冰冷的裂解液收集裂解物總蛋白，采用BCA 法測定蛋白含量，并定量為5 g/L，配置10% SDS-PAGE 凝膠，每個樣本點樣10 μL，分離組織總蛋白并轉印至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后，分別與HO-1、NQO1 和β-actin 抗體（1∶1 000）孵育過夜，次日用TBST 洗膜（每次15 min，洗3 次）后，再與辣根過氧化物酶偶聯的Ⅱ抗（1∶2 000）反應，洗滌Ⅱ抗（每次15 min，洗3次），經凝膠成像系統曝光成像，ImageJ軟件測定條帶灰度值，計算目的蛋白與β-actin 條帶灰度值之比，即為目的蛋白的相對表達量。

2.9 免疫組化檢測Ki67 蛋白表達 取包埋組織切片，按照二步法免疫組織化學試劑盒說明進行操作。為定量分析Ki67 陽性細胞，每張染色切片在顯微鏡下隨機取5 個視野拍照并計數陽性細胞，觀察到呈現棕褐色的為Ki67 陽性細胞，采用陽性細胞數所占百分比來表示表達量。

3 統計學處理

用GraphPad Prism 7.03 軟件進行統計。計量資料均以均數±標準差（mean±SD）表示。采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 小鼠一般情況比較

至實驗結束，模型及藥物干預組小鼠肝臟100%成瘤且均無中途死亡。實驗中后期模型及藥物干預組小鼠開始精神萎靡，進食減少，體重增加緩慢且小于正常對照組。與正常對照組比較，模型組小鼠體重及增重顯著降低（P<0.01），與模型組比較，低、中、高劑量姜黃素組小鼠體重及增重均顯著升高（P<0.01）；與正常對照組比較，模型組小鼠肝重及肝臟指數顯著升高（P<0.01），與模型組比較，低、中、高劑量姜黃素組小鼠肝重及肝臟指數均無顯著變化（P>0.05），見表1。

表1 小鼠體重、增重、肝重及肝臟指數的比較Table 1. Comparison of body weight， weight gain， liver weight and liver index of the mice （Mean±SD. n=10）

2 肝臟形態學變化

由圖1 可見，正常組小鼠肝臟表明光滑、色澤紅潤、質地細膩，沒有出現增生結節；模型組小鼠肝臟色澤暗淡，邊緣不整齊，可見表面出現大小不一質地較硬的白色圓形癌結節，結節切面有壞死及出血；給予姜黃素后，小鼠肝臟也可見白色癌結節，但與模型組相比，癌結節數量及大小明顯減小。

Figure 1. Macroscopic examination of mouse livers. A： control group； B： model group； C： curcumin（ 100 mg/kg） group； D： cur‐cumin（ 200 mg/kg） group； E： curcumin（ 400 mg/kg） group.圖1 小鼠肝臟外觀

3 肝臟癌結節數量

通過圖片觀察肝臟，以直徑2 mm 和5 mm 為界，計數肝臟正反表面癌結節數量。由表2 可見，與模型組比較，給予姜黃素后小鼠肝臟癌結節總數及小于2 mm 癌結節數量均顯著減少（P<0.05 或P<0.01），大于2 mm癌結節數量均無顯著差異。

表2 小鼠肝臟癌結節數Table 2. The numbers of tumor nodules in mouse livers （Mean±SD. n=10）

4 血清ALT和AST活性

與正常對照組比較，模型組小鼠血清ALT 和AST 活性顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，低、中、高劑量姜黃素組小鼠血清ALT 活性無顯著變化，而AST活性均顯著降低（P<0.01），見表3。

表3 小鼠血清ALT和AST水平Table 3. The serum levels of ALT and AST in mice （U/L. Mean±SD. n=10）

5 肝組織病理學

HE 染色結果顯示，正常對照組小鼠肝臟結構正常，肝細胞結構完整、清晰，肝索排列整齊；模型組肝小葉結構模糊，有多處壞死并伴有炎癥細胞浸潤，出現大量大小、形狀不一不規則排列的細胞核；與模型組相比，各姜黃素組肝小葉結構紊亂和肝細胞變性程度明顯減輕，肝癌細胞排列相對有序，見圖2。

Figure 2. HE staining results of paraffin sections of the mouse liver（ scale bar=20 μm）. A： control group； B： model group； C： cur‐cumin（ 100 mg/kg） group； D： curcumin（ 200 mg/kg） group； E： curcumin（ 400 mg/kg） group.圖2 小鼠肝臟石蠟切片HE染色結果

6 肝組織中HO-1和NQO1的mRNA表達水平

RT-PCR 檢測結果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織中HO-1和NQO1的mRNA表達水平均顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，中劑量姜黃素組小鼠肝組織中HO-1 的mRNA 表達水平顯著降低（P<0.05），高劑量姜黃素組小鼠肝組織中NQO1 的mRNA表達水平顯著降低（P<0.05），見圖3。

Figure 3. The mRNA expression levels of HO-1（ A） and NQO1（ B） in mouse livers. Mean±SD. n=10. #P<0.05 vs control group； *P<0.05 vs model group.圖3 小鼠肝臟HO-1和NQO1的mRNA表達水平

7 肝組織中HO-1和NQO1蛋白表達水平

Western blot實驗結果顯示，與正常對照組比較，模型組HO-1 和NQO1 蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，中劑量姜黃素組小鼠肝組織中HO-1 和NQO1 蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），高劑量姜黃素組小鼠肝組織中NQO1 蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），見圖4。

Figure 4. The protein expression levels of HO-1 and NQO1 in mouse livers. Mean±SD. n=10. ##P<0.01 vs control group； *P<0.05 vs model group.圖4 小鼠肝臟HO-1和NQO1蛋白表達水平

8 肝組織Ki67蛋白的免疫組化染色

免疫組化染色結果（圖5）顯示，正常對照組、模型組、低劑量姜黃素組、中劑量姜黃素組和高劑量姜黃素組小鼠肝組織中Ki67陽性表達率分別為（1.55±0.05）%、（63.24±5.42）%、（38.32±2.98）%、（40.68±3.52）%和（35.46±3.79）%。低、中、高劑量組小鼠肝臟組織中Ki67 陽性表達率均低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），給藥組之間比較差異無統計學意義（P>0.05）。

Figure 5. Immunohistochemical staining of Ki67 in mouse livers（ scale bar=50 μm）. A： control group； B： model group； C： curcumin（100 mg/kg） group； D： curcumin（ 200 mg/kg） group； E： curcumin（ 400 mg/kg） group.圖5 小鼠肝臟Ki67免疫組化染色

討 論

本研究使用DEN 聯合CCl4誘發的肝癌模型，100%的小鼠在5 個月大時出現肝臟腫瘤，且對肝臟致癌有較好的專一性。肝臟是藥物代謝的主要器官，DEN 具有較強的肝毒性，可誘導急性肝毒性和肝細胞DNA 損傷［8］，可誘導肝內炎癥發生，損傷肝細胞，造成肝組織纖維化，繼而發生肝細胞結節性增生及肝硬化，最后誘發肝癌。將DEN 與CCl4聯合使用誘導肝癌，可縮短造模時間，降低小鼠死亡率，其病變過程與人類肝癌病程相似，因而被廣泛用于肝癌的臨床及基礎研究中。

Ki67是惡性腫瘤細胞增殖的標志物，表達越高，說明腫瘤細胞處于快速分裂期，增殖快，惡性程度較高。血清ALT 和AST 水平是評價肝功能損害的重要指標。當肝功能損害發生時血清ALT 和AST 活性也會大幅升高。本研究結果提示DEN 聯合CCl4可明顯誘導小鼠肝癌的發生，給與姜黃素干預后，小鼠肝臟Ki67表達顯著降低，同時血清AST 活性也顯著降低，提示姜黃素對DEN 聯合CCl4誘導的肝癌模型小鼠有保護作用。

大多數HCC在慢性肝臟炎癥的背景下發展。氧化應激被認為在HCC 發展的發病機制中起主要作用［9-10］。Nrf2-Keap1信號通路被認為是細胞內最重要的抗氧化應激機制之一。當細胞受毒物刺激時，Nrf2從Keap1中解偶聯進入細胞核內，通過調控下游抗氧化分子如HO-1、NQO1 等的表達，從而抵抗氧化應激損傷［11-13］。本研究顯示DEN 聯合CCl4誘導小鼠肝癌形成，小鼠機體快速啟動氧化應激形成自我保護，導致模型組小鼠肝臟HO-1 和NQO1 蛋白表達大幅度增加，但HO-1 和NQO1 過度表達將產生過多的Fe2+和CO，過多的Fe2+和CO 會一定程度地加大細胞氧化應激壓力，損傷線粒體［14］，破壞細胞完整性［15］，因此過度表達的HO-1 和NQO1 反而有細胞毒性作用。而給予姜黃素后，小鼠肝臟HO-1 和NQO1 蛋白表達較模型組顯著降低，將細胞內HO-1 和NQO1 蛋白表達控制在一定范圍內，保障了Nrf2-Keap1 信號通路更好地發揮抗氧化應激的作用，因此姜黃素對于肝癌小鼠Nrf2-Keap1 信號通路平衡的調節值得進一步研究。