電針對(duì)慢性束縛應(yīng)激抑郁模型小鼠行為學(xué)的影響及機(jī)制研究*

張華敏,李江帆,邵 靜

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科,河南 鄭州 450000;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院, 北京 100029)

針灸具有整體調(diào)節(jié)、多靶點(diǎn)干預(yù)及不良反應(yīng)輕微等優(yōu)勢(shì),而電針是傳統(tǒng)針刺療法的一種改進(jìn),在穴位插入針灸針并與電極相連,以脈沖電流刺激特定部位,調(diào)節(jié)某些身體機(jī)能并治療疾病。抑郁癥是一種常見的精神疾病,多項(xiàng)研究表明電針治療抑郁癥療效較好[1-3],但其潛在的作用機(jī)制尚待闡明。抑郁癥屬中醫(yī)學(xué)“郁證”范疇。郁者,滯而不通之義,故中醫(yī)學(xué)認(rèn)為郁證是由七情內(nèi)傷、氣機(jī)郁滯導(dǎo)致臟腑陰陽(yáng)氣血失調(diào)后形成的以情緒低落、意志力減退為主的一系列情志疾病的總稱,發(fā)病機(jī)制與心、肝密切相關(guān)。本研究通過曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)觀察電針對(duì)慢性束縛應(yīng)激 (chronic restraint stress,CRS)抑郁模型小鼠行為學(xué)的影響,通過c-Fos免疫熒光染色驗(yàn)證電針神門穴和太沖穴能誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一些腦區(qū)的神經(jīng)元激活,為電針抗抑郁提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

7周齡雄性C57BL/6J小鼠,體質(zhì)量18～22 g,浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,許可證號(hào)為SCXK(浙)2019-0001。小鼠飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)籠具中,室溫(23±2)℃,相對(duì)濕度50%～70%, 12 h晝夜節(jié)律(光照07:00—19:00)。除手術(shù)期間外,造模及行為學(xué)測(cè)試期間,小鼠均可自由獲取滅菌水和營(yíng)養(yǎng)飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司產(chǎn)品)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)小鼠進(jìn)行斷頭處死并取腦。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置符合科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》要求。

1.2 主要試劑與儀器

驢血清,上海愛必信生物科技有限公司產(chǎn)品,批號(hào)abs935;Rabbit @c-Fos, 美國(guó)Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品,批號(hào)Cat# 2250S;594 D@Rb,美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品,批號(hào)Cat# A21207;抗熒光淬滅封片液,上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,批號(hào)p0131。太和牌針灸針,直徑0.16 mm、長(zhǎng)7 mm,北京中研太和醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品;SDZ-III型華佗電子針療儀,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司產(chǎn)品;Smart 3.0小動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng),西班牙Panlab公司產(chǎn)品;BT100-2J型蠕動(dòng)泵,保定蘭格恒流泵有限公司產(chǎn)品;BXH-280型電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海博訊醫(yī)療生物儀器產(chǎn)品;TS-2型數(shù)顯脫色搖床,海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品;VT-1200 S型振動(dòng)切片機(jī),德國(guó)徠卡產(chǎn)品;VS200研究級(jí)全玻片掃描系統(tǒng),儀景通株式會(huì)社產(chǎn)品;敞箱(40 cm × 40 cm × 40 cm)、懸尾檢測(cè)儀(20 cm × 20 cm × 35 cm),上海梵碧智能科技有限公司產(chǎn)品;小鼠束縛器,黑龍江博睿達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器經(jīng)營(yíng)部提供。

1.3 動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)一:小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)流程見圖1。將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、假電針組、電針太沖穴組、電針神門穴組4組,每組8只。

圖1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)流程圖

實(shí)驗(yàn)二:小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行c-Fos免疫熒光染色實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)流程見圖2。將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為假電針組、電針太沖穴組、電針神門穴組、穴位配伍(電針太沖穴+神門穴)組4組,每組8只。電針20 min,休息90 min,灌流取腦,進(jìn)行后續(xù)的免疫熒光染色。

圖2 c-Fos免疫組化實(shí)驗(yàn)流程圖

1.4 模型的建立

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,參照既往文獻(xiàn)[4-5]構(gòu)建CRS抑郁模型。將小鼠置于固定在方形底座上的圓柱形透明束縛器(高10 cm、直徑2.7 cm)內(nèi)。為引導(dǎo)小鼠主動(dòng)進(jìn)入束縛器,在束縛器上面覆蓋一條小毛巾,使束縛器內(nèi)光線更暗。旋緊底蓋,避免夾傷尾巴、腳趾和睪丸等。每天克制壓力持續(xù)4 h,連續(xù)3周。正常組小鼠被輕柔撫摸2 min 后,在鼠籠里自由活動(dòng),且每天在同一時(shí)間禁食和水4 h。持續(xù)2周。2周后采用行為學(xué)測(cè)試(包括曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn))判斷造模是否成功。抑郁小鼠表現(xiàn)為敞箱內(nèi)總運(yùn)動(dòng)距離縮短、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間減少,懸尾實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間增加。

1.5 選穴與電針操作

參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]確定太沖穴、神門穴位置。太沖穴位于后肢足背第一和第二跖骨間凹陷處。神門穴位于前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣。分別用無菌毫針直刺電針太沖穴組、電針神門穴組小鼠雙側(cè)神門穴、太沖穴,深度2～3 mm,針柄連接華佗牌電針儀(頻率2 Hz,電流強(qiáng)度1 mA,疏密波);針刺假電針組小鼠尾巴非穴位處,操作同電針組。均20 min/次,1次/d,連續(xù)治療7 d。正常組可自由獲得光照、食物和水,不做特殊處理。治療期間保持環(huán)境安靜。各組針刺位置和操作見圖3。

圖3 電針治療示意圖。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.6.1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

分別在造模前、電針治療前后進(jìn)行,包括曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test,OFT): OFT是用于研究小鼠焦慮情緒行為和動(dòng)機(jī)趨向特點(diǎn)的經(jīng)典方法[7]。敞箱上蓋敞開,在敞箱正中垂直上方1.5 m處設(shè)置固定攝像頭;將小鼠放置于敞箱底板的中心方格(20 cm×20 cm)內(nèi),錄制視頻10 min;采用Smart I/O 3.0視頻行為學(xué)分析軟件分析。檢測(cè)環(huán)境安靜、隔音。將在曠場(chǎng)中移動(dòng)10 min的總距離作為衡量運(yùn)動(dòng)能力的指標(biāo),將在空曠場(chǎng)地的中央?yún)^(qū)所停留的時(shí)間、在中央?yún)^(qū)穿越次數(shù)作為衡量焦慮行為的指標(biāo)。高度焦慮的小鼠會(huì)逃避對(duì)曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)域的探索,主要在周邊區(qū)域活動(dòng)。

懸尾實(shí)驗(yàn)(tail suspension test,TST):TST被廣泛應(yīng)用于評(píng)估抗抑郁藥物的治療效果[8]。其原理是小鼠懸尾后企圖逃脫但又無法逃脫,從而放棄掙扎,顯示“行為絕望”,進(jìn)入特有的抑郁不動(dòng)狀態(tài)。房間燈光設(shè)置為暗淡(50 Lux)狀態(tài),將C57小鼠的尾巴(離尾尖約1 cm)粘在懸尾檢測(cè)儀頂部掛鉤上。為防止小鼠發(fā)生爬尾行為,懸掛之前在小鼠尾部套1個(gè)塑料管(直徑0.5 cm、長(zhǎng)3 cm)。懸掛后小鼠鼻尖距離設(shè)備地板約20 cm。懸掛小鼠6 min,用秒表手動(dòng)記錄后5 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。

1.6.2 基底外側(cè)杏仁核腦區(qū)的c-Fos蛋白表達(dá)

c-Fos是神經(jīng)細(xì)胞接受刺激時(shí)被迅速并短暫激活的基因,峰值在 90～120 min[9-10]。采用c-Fos免疫熒光染色的方法標(biāo)記基底外側(cè)杏仁核(basolateral amygdala, BLA)腦區(qū)在短暫時(shí)間窗內(nèi)接受針刺太沖穴后被激活的情況。在針刺治療結(jié)束后90 min,腹腔注射水合氯醛(7.5 μL/g體質(zhì)量)深度麻醉小鼠;先后用生理鹽水和 40 g/L 多聚甲醛經(jīng)心灌注5 min;斷頭處死小鼠,取出鼠腦,放入40 g/L多聚甲醛溶液中,4 ℃冰箱固定12 h;用振動(dòng)切片機(jī)制備40 μm厚冠狀腦切片;將腦片轉(zhuǎn)入驢血清中室溫封閉1 h,孵育一抗(Rabbit@c-Fos, 1∶5 000)4 ℃冰箱過夜;次日在6孔板中加入5 mL磷酸緩沖鹽溶液,室溫振搖漂洗3次,每次10 min;將腦片轉(zhuǎn)入裝有二抗稀釋液(594D@Rb, 1∶1 000)的2 mL微量離心管中,室溫下避光孵育2 h;室溫振搖漂洗3次,方法同前;貼片,滴加4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚溶液染細(xì)胞核,并用指甲油封片。用VS 200全玻片掃描系統(tǒng)拍片,Image J軟件進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算每0.1 mm2內(nèi)c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目,取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

在基礎(chǔ)狀態(tài)下,4組之間曠場(chǎng)內(nèi)總運(yùn)動(dòng)距離對(duì)比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模2周,與正常組對(duì)比,假電針組、電針神門穴組和電針太沖穴組的總運(yùn)動(dòng)距離縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)停留時(shí)間減少 (P<0.05)。電針治療后,與假電針組對(duì)比,兩個(gè)電針組的總運(yùn)動(dòng)距離增加(P<0.01),且電針太沖穴組中央?yún)^(qū)停留時(shí)間增加(P<0.05),而電針神門穴組中央?yún)^(qū)停留時(shí)間無明顯改善。結(jié)果表明,電針神門穴或太沖穴可逆轉(zhuǎn)CRS誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為,且電針太沖穴效果更佳。見表1、表2。

表1 各組小鼠各時(shí)間點(diǎn)總運(yùn)動(dòng)距離對(duì)比

表2 各組小鼠各時(shí)間點(diǎn)曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)停留時(shí)間對(duì)比

2.2 各組小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

基礎(chǔ)狀態(tài)下,4組之間不動(dòng)時(shí)間對(duì)比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。造模2周,與正常組對(duì)比,假電針組、電針神門穴組和電針太沖穴組的不動(dòng)時(shí)間增加(P<0.05)。電針治療后,與假電針組對(duì)比,兩個(gè)電針組的不動(dòng)時(shí)間減少(P<0.01)。結(jié)果表明,在神門穴或太沖穴處的電針治療可以挽救CRS誘導(dǎo)的小鼠“行為絕望”。見表3。

表3 各組小鼠各時(shí)間點(diǎn)不動(dòng)時(shí)間對(duì)比

2.3 各組小鼠BLA腦區(qū)的c-Fos激活情況對(duì)比

與假電針組對(duì)比,電針神門穴組、電針太沖穴組和穴位配伍組BLA腦區(qū)c-Fos表達(dá)增加(P<0.01);與電針神門穴組或電針太沖穴組對(duì)比,穴位配伍組BLA腦區(qū)c-Fos表達(dá)增加(P<0.01)。結(jié)果表明,電針太沖穴或神門穴發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)的機(jī)制可能跟激活BLA腦區(qū)相關(guān)。見表4。

表4 各組小鼠BLA腦區(qū)c-Fos表達(dá)對(duì)比

3 討 論

本研究采用CRS應(yīng)激模型符合人類“肝氣郁結(jié)、神明受損”所致心境障礙。基于疏肝和調(diào)神的治則,選擇具有寧心安神、疏肝解郁功效且既往研究證實(shí)可明顯抗抑郁、改善認(rèn)知的穴位:太沖,足厥陰肝經(jīng)之原穴;神門(HT7),手少陰心經(jīng)之原穴。《靈樞·九針十二原》[11]記載:“五臟有疾也,應(yīng)出十二原”。《難經(jīng)·六十六難》[12]曰:“五臟六腑之有病者,取其原也”。因此,臟腑發(fā)生疾病會(huì)反映于相應(yīng)的原穴。針刺原穴能使三焦元?dú)馔ㄟ_(dá),調(diào)節(jié)臟腑經(jīng)絡(luò)功能,從而發(fā)揮維護(hù)正氣、抗御病邪的作用。足厥陰肝經(jīng)屬多血少氣之經(jīng),肝為臟之陰,主藏血,主疏泄。太沖穴是足厥陰肝經(jīng)之原穴,具有疏肝理氣、調(diào)和氣血、調(diào)暢情志之功效,是治療郁癥的經(jīng)驗(yàn)效穴。有研究者利用靜息狀態(tài)功能磁共振成像探討針刺太沖作用機(jī)制,顯示該穴主要特異性激活參與視覺功能、聯(lián)想功能和情緒認(rèn)知的腦功能網(wǎng)絡(luò)[13]。神門穴是手少陰心經(jīng)的原穴,心藏神,在志為喜,“喜則氣和志達(dá),榮衛(wèi)通利”。《靈樞·官能》載:“用針之要,勿忘其神。”神門穴是神出入之門戶,針刺神門可清心除煩,寧神開竅。有研究通過功能性磁共振成像技術(shù)觀察單純刺激神門激活的腦區(qū)為左側(cè)額極區(qū)、左側(cè)顳上回、左側(cè)額下回等,主要對(duì)受試者的復(fù)雜情緒、認(rèn)知、語(yǔ)言及邏輯產(chǎn)生影響[14]。目前,針刺抗抑郁的機(jī)制研究主要集中在突觸和分子水平,對(duì)于其潛在的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制研究尚待進(jìn)一步闡明。

本研究通過曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)兩種經(jīng)典的抑郁行為學(xué)測(cè)試發(fā)現(xiàn),與假電針對(duì)比,電針太沖穴和神門穴可明顯改善小鼠抑郁樣行為,且電針太沖穴效果較佳。上述結(jié)果表明,基于疏肝調(diào)神理論進(jìn)行針刺可有效改善小鼠抑郁樣行為。接下來,筆者進(jìn)一步探索針刺發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)的作用機(jī)制,采用c-Fos免疫熒光染色的方法檢測(cè)電針神門穴或太沖穴對(duì)經(jīng)典的抑郁相關(guān)腦區(qū)BLA的激活情況。c-Fos作為一種神經(jīng)元激活后迅速且大量表達(dá)的即刻早期基因被視為神經(jīng)元激活的標(biāo)志。c-Fos mRNA的峰值在30 min左右,c-Fos蛋白的峰值在90～120 min[15-16]。杏仁核是包括人類在內(nèi)的復(fù)雜脊椎動(dòng)物大腦顳葉內(nèi)側(cè)深處的兩個(gè)杏仁狀核簇,是大腦邊緣系統(tǒng)的一部分,在記憶、決策和情緒反應(yīng)(恐懼、焦慮或攻擊性行為等)的處理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,且與其他大腦區(qū)域進(jìn)行信息互通[17]。杏仁核的區(qū)域進(jìn)一步細(xì)分為幾個(gè)亞區(qū),有基底外側(cè)杏仁核、皮質(zhì)核、內(nèi)側(cè)核、中央核等,分別具有不同的連接和功能特征。大量文獻(xiàn)表明基底外側(cè)杏仁核中的谷氨酸能神經(jīng)元向伏隔核殼和核發(fā)送投射,這些預(yù)測(cè)驅(qū)動(dòng)激勵(lì)顯著性的能力取決于多巴胺受體[18-19]。因此,本研究通過熒光免疫組化標(biāo)記c-Fos陽(yáng)性神經(jīng)元來反映電針后短暫時(shí)間窗內(nèi)杏仁核的激活情況。結(jié)果顯示:與假電針對(duì)比,電針太沖穴或神門穴可誘導(dǎo)c-Fos的表達(dá),當(dāng)兩個(gè)穴位配伍時(shí)c-Fos激活更為明顯(P<0.01),提示基于疏肝調(diào)神理論的電針抗抑郁機(jī)制可能與激活杏仁核腦區(qū)相關(guān)。筆者接下來的研究方向是進(jìn)一步通過病毒示蹤技術(shù)找到杏仁核的輸入和輸出腦區(qū),明確一條或幾條潛在的神經(jīng)環(huán)路,利用光/化學(xué)遺傳學(xué)、光纖記錄等手段深入探討基底外側(cè)杏仁核相關(guān)環(huán)路介導(dǎo)“疏肝調(diào)神”穴位配伍發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)的神經(jīng)機(jī)制。