中藥單體調控肌腱干細胞成骨分化促進腱骨愈合的研究進展*

楊 慶,汪小敏,楊超強,王宜燦,康天泰,張虎林

(1.甘肅中醫藥大學中醫臨床學院,甘肅 蘭州 730000; 2.甘肅中醫藥大學附屬醫院北院骨科,甘肅 蘭州 730000)

隨著健身運動的普及,肌腱和韌帶損傷變得十分常見。肌腱和韌帶損傷位置廣泛,以肩袖(rotator cuff,RC)、髕腱和跟腱為主[1]。一般情況下,臨床對于RC和前交叉韌帶(anterior cruciate ligament,ACL)附著點的損傷常采用手術重建的方式進行治療。該手術通常是通過以肌腱為移植物將其插入骨隧道中以促進腱骨愈合。研究表明,RC修復術后和ACL重建術后平均再撕裂率分別為94%和11.7%[2-3];此外,腱骨愈合不良還會導致膝關節松弛、軟骨和半月板損傷及創傷后骨關節炎等[4-6]。研究[7]表明,纖維軟骨區的再生對于腱骨愈合十分重要。腱骨愈合的機制十分復雜,目前尚未完全闡明,肌腱-骨連接處新骨的生成是評價其愈合的主要指標。研究[8]表明,通過種植間充質干細胞成骨分化可有效促進腱骨愈合。間充質干細胞是一種存在于全身器官間質和結締組織中的成體干細胞,具有自我修復和多向分化潛能。根據其來源可將其分為骨髓間充質干細胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)、肌腱干細胞(tendon-derived stem cells, TDSCs)、脂肪間充質干細胞(adipose derived stem cells, ADSCs)、滑膜間充質干細胞(synovial mesenchymal stem cells,SMSCs)。這些間充質干細胞可以自我再生并潛在地分化為不同的細胞類型,促進組織修復和再生[9]。此前BMMSCs被認為是促進腱骨愈合的最佳種子細胞,但近來研究[10]表明TDSCs的增殖分化能力強于BMMSCs,比BMMSCs表現出更多成軟骨和成骨標志物,經過誘導其成脂分化、成軟骨分化、成骨分化均強于BMMSCs。TDSCs成骨分化在促進腱骨愈合方面表現出較大的優勢,具有廣泛的臨床應用前景。筆者對中藥單體調控TDSCs成骨分化促進腱骨愈合的研究進行綜述,以期為臨床促進腱骨愈合提供新的思路。

1 肌腱干細胞成骨分化促進腱骨愈合

1.1 正常腱骨止點的解剖結構及腱骨愈合過程

腱骨止點是連接肌腱和骨骼的獨特分層過渡組織,根據是否存在纖維軟骨層分為直接止點和間接止點,兩者結構、成分和機械性能完全不同[11-12]。直接止點存在纖維軟骨層,由肌腱/韌帶、未鈣化的纖維軟骨、鈣化的纖維軟骨和骨4種不同類型的組織組成,如RC和前后交叉韌帶的腱骨界面。間接止點不存在纖維軟骨層,由致密的纖維組織將韌帶直接連接到骨膜,如內側副韌帶腱骨界面[9]。腱骨愈合過程包括炎癥期、纖維增殖期、改造塑期3個階段[13-16]。早在1997年,有學者[17]構建兔腱骨愈合模型,通過常規組織學和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原的免疫組織化學定位發現,手術后1周可以在腱骨界面觀察到炎癥細胞,手術后2周可以在腱骨界面觀察到疤痕組織,手術后4周可以在腱骨界面觀察到疤痕組織重組形成的致密結締組織基質,手術后第6周可以在腱骨界面觀察到夏貝氏纖維。

1.2 TDSCs成骨分化促進腱骨愈合研究進展

肌腱是一種致密的結締組織,通常呈索狀或膜狀,位于肌肉末端與骨骼連接處,主要由腱纖維構成,主要作用為連接骨骼和肌肉引起關節活動。由于肌腱屬于低細胞密度、低血管組織,其損傷后愈合效果較差[18]。TDSCs來源于肌腱,由Bi等[19]于2007年首次在離體組織分離獲得。TDSCs外形呈鵝卵石形,較普通的腱鞘細胞體積更小、細胞核更大[20]。Zhang等[20]研究表明,TDSCs體外可分化為脂肪細胞、軟骨細胞和骨細胞,在體內也能夠形成類似于肌腱、軟骨或骨組織樣結構。在腱骨愈合纖維增殖期,M1型巨噬細胞通過釋放細胞因子招募間充質干細胞,促進間充質干細胞遷移至損傷部位;M2型巨噬細胞則促進間充質干細胞的存活和定向成骨分化[21]。除此之外,巨噬細胞分泌的骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)對TDSCs具有分化誘導活性,能誘導TDSCs細胞成骨分化、成脂分化及成軟骨分化,進而促進腱骨愈合[22]。Liu等[23]研究發現,前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)通過激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶b(protein kinase b,Akt)信號通路誘導BMP-2信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)表達,BMP-2隨后激活Smad蛋白(small mothers against decapentaplegic,Smad)磷酸化,誘導成骨細胞特異性轉錄因子2(runt-related transcription factor-2,Runx2)和骨鈣素(osteocalcin,OCN)表達促進TDSCs成骨分化。綜上可知,TDSCs成骨分化能促進腱骨愈合。

2 中醫學對腱骨愈合的認識

腱骨愈合屬中醫學“筋骨病”范疇,其病位在筋和骨。廣義的筋是指筋膜、肌腱、韌帶、關節軟骨盤、腱鞘等軟組織。筋與骨共同構成關節,從而約束骨骼,主司關節運動。《素問·痿論篇》曰:“宗筋主束骨而利機關也。”中醫學認為,筋骨病的病因主要有外因和內因兩類,外因主要為外力傷害和外感六淫,內因則與年老體虛、慢性勞損、肝腎虧虛等密切相關。《諸病源候論》曰:“肝主筋而藏血,腎主骨而生髓,虛勞損血耗髓,故傷筋骨也。”肝藏血,在體和筋。肝血濡養全身筋脈,肝血充足則筋強,運動靈活有力。若肝血不足,筋失濡養,則筋骨運動能力減退。腎在體和骨,生髓。腎精生髓而充骨,腎精充足則骨強。若腎精不足,則骨髓失養,骨失所養易發生骨病。因此,中醫學治療筋骨病注重“筋骨并重”,常以滋補肝腎為治則。如:沈錦濤[24]基于“筋骨并重”理論,以滋補肝腎為治則,采用中藥續斷治療兔前交叉韌帶重建術后模型,證明中藥續斷可以增加腱骨愈合界面骨小梁數量,提高骨密度,促進成纖維細胞和夏貝氏纖維增加,促進成骨,從而促進腱骨愈合;楊偉毅等[25]構建兔前交叉韌帶重建術后模型,將其分為溫補腎陽組、空白對照組、滋補腎陰組,采用中藥干預,結果發現,滋補腎陰組腱骨愈合界面成纖維細胞、軟骨細胞和膠原纖維增殖優于溫補腎陽組和空白對照組,得出補腎中藥可以促進腱骨愈合。以上研究從組織學角度探討了腱骨愈合機制,但其相關信號通路及作用靶點有待進一步研究。

3 中藥單體調控TDSCs促進成骨分化

現有研究表明,中藥單體促進TDSCs成骨分化進而促進腱骨愈合主要通過促進成骨因子的表達,調控β-連環素(β-catenin)信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路、核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路,誘導TDSCs成骨分化,從而促進腱骨愈合。Runx2是一種成骨轉錄因子,是細胞成骨分化的早期標志。OCN是Runx2下游基因,由成骨細胞表達,是細胞分化為成骨細胞的標志。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)與骨的鈣化密切相關。黃芩素又名黃芪苷元,是黃芩的主要有效成分之一。江華基等[26]通過建立大鼠關節外骨隧道-游離肌腱移植模型,發現黃芩素能通過促進TDSCs ALP分泌和礦化,以及Runx2、成骨細胞特異性轉錄因子(osterix,OSX)、OCN、Ⅰ型膠原蛋白α1 (collagen type I alpha 1,Col1α1)表達,誘導TDSCs成骨分化,進而促進腱骨愈合。同時,蛋白質免疫印跡結果顯示,黃芩素能夠促進TDSCs β-catenin蛋白的表達,使用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑分泌型蛋白Dickkopf-1可以顯著抑制黃芩素的促成骨作用,由此推斷黃芩素可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進TDSCs成骨分化,進而促進腱骨愈合,但其具體機制有待進一步深入研究[26]。骨碎補總黃酮是黃酮類化合物,是中藥骨碎補干燥根莖的主要有效成分之一。張新濤等[27]通過大鼠關節外骨隧道-游離肌腱移植造模發現,大鼠跟腱干細胞經骨碎補總黃酮處理后,成骨因子Runx2、OCN及ALP、血管內皮生長因子表達增加,mTOR信號通路標記物磷酸化核糖體蛋白S6在TDSCs中增多,磷酸化真核翻譯起始因子4E結合蛋白1減少,進而誘導TDSCs成骨和成血管,最終促進腱骨愈合。此結果表明,骨碎補總黃酮調控TDSCs成骨分化進而促進腱骨愈合與mTOR信號通路密切相關。然而,該實驗存在局限性,未完全明確骨碎補總黃酮調控TDSCs mTOR信號通路促進腱骨愈合的機制,且實驗所用強骨膠囊含有多種成分,可能對實驗結果產生偏倚。三七總皂苷是三七的主要活性物質。史友剛等[28]通過ALP染色、茜素紅染色觀察及對Runx2、Osx mRNA、β-catenin蛋白表達量的研究發現:在三七總皂苷的干預下,Runx2、Osx mRNA、β-catenin蛋白表達量的表達量均增加;此外,三七總皂苷對TDSCs的促增殖和成骨分化作用與其質量分數有關,以100 mg/L質量分數為較佳。此結果表明,三七總皂苷體外誘導TDSCs向成骨細胞定向分化可能與Wnt/β-catenin信號通路有關。劉曉華等[29]在前期實驗研究中證實,三七總皂苷可提高重建ACL腱骨愈合處成骨能力,機制可能與TDSCs成骨分化有關;研究進一步發現,三七總皂苷能促進TDSCs成骨標志物骨ALP表達量增加,增強裸鼠皮下異位成骨能力。綜上,三七總皂苷可能通過Wnt/β-catenin信號通路促進TDSCs成骨分化,進而促進腱骨愈合。白黎蘆醇是虎杖的干燥根莖提取物,具有強大的抗氧化、抗炎和抗分解代謝特性,有治療骨質疏松癥和類風濕性關節炎相關骨丟失的潛力[30]。王文等[31]從髕腱組織中分離TDSCs進行體外培養,結果發現,白藜蘆醇能夠抑制β-catenin蛋白表達,誘導成骨因子Runx2、OCN表達,促進TDSCs礦鹽沉積,進而促進TDSCs的成骨分化,得出白藜蘆醇可以體外誘導并促進人肌腱干細胞的成骨分化,可能通過調節β-catenin信號通路來調控。小白菊內酯是一種倍半萜內酯類化合物,具有多種藥理活性,一般由木蘭科或菊科植物提取。周倩等[32]研究表明,小白菊內酯在和花木蘭葉片中含量最高,厚樸葉片次之。厚樸作為傳統中藥,在提取小白菊內酯方面有天然優勢。腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)是炎癥反應的主要調節因子。李知玻等[33]研究表明,TNF-α能抑制成骨細胞生長。許華亮等[34]研究發現,小白菊內酯可以抑制TDSCs被TNF-α刺激后NF-κB信號通路關鍵蛋白p65的表達,進而促進Runx2和下游基因OCN的表達,表明小白菊內酯可能通過抑制NF-κB信號途徑和炎癥反應促進TDSCs成骨分化。由此可知,小白菊內酯可能是促進TDSCs成骨分化進而促進腱骨愈合的潛在有效中藥單體。

4 小 結

綜上所述,TDSCs成骨分化對促進腱骨愈合有重要意義。我國中藥種類繁多,質量優良,具有簡、便、廉、效等特點。近年來隨著研究的不斷深入,越來越多的證據表明中藥單體在促進TDSCs成骨分化進而促進腱骨愈合方面具有巨大的應用前景,其主要通過調節相關信號通路及提高成骨因子的表達促進TDSCs成骨分化達到腱骨愈合的目的。但由于TDSCs成骨分化機制復雜,中藥單體調控TDSCs成骨分化的確切機制尚未完全清楚,有待臨床進一步深入研究。除此以外,中藥單體調控TDSCs成骨分化促進腱骨愈合的研究較少,且實驗多為體外細胞培養,動物造模較少,缺乏大量臨床觀察研究,有待進一步深入研究。因此,今后當利用現代生物學技術,從多信號通路、多基因、多靶點等方面進一步深入研究中藥單體調控TDSCs成骨分化促進腱骨愈合的機制,挖掘出更多有效中藥單體,以促進臨床腱骨愈合。