妊娠期糖尿病患者孕期鐵代謝水平與IRS-2基因單核苷酸多態性的關系

吳昊，吳博，林煊，徐云芝，胡速

1.溫州市中心醫院 檢驗科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫科大學 圖書館（期刊社），浙江 溫州 325035

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus, GDM）是在妊娠期間首次診斷出的糖尿病。在妊娠期間，由于孕期雌激素、孕激素的水平顯著升高，以及體內抗胰島素類物質分泌增加，導致機體難以有效處理血液中的游離糖并最終引起孕婦血糖代謝紊亂[1]。胰島素受體底物（insulin receptor substrate, IRS）是一類能夠激活的胰島素受體酪氨酸激酶作用的底物，既往研究認為，IRS的基因多態性與多種疾病的發生和發展密切相關，而IRS-2的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism, SNP）可能導致機體糖代謝的紊亂，是糖尿病的易感基因之一[2-3]。鐵是胎兒生長發育必不可少的微量元素，約40%的女性由于缺乏鐵儲備可能導致妊娠期貧血的癥狀[4]。然而，近來的研究顯示，孕期的高鐵狀態與GDM患病率的提升具有相關性，這一結果可能是由于鐵蓄積過多引起胰島細胞過度氧化應激造成細胞活力下降而導致 的[5-6]。因此，筆者認為GDM的發生與多種基因多態性以及代謝水平紊亂有關，尤其與IRS-2基因多態性和鐵代謝蓄積的共同作用有關。本研究分析了GDM患者的糖代謝相關指標水平、鐵代謝相關指標水平、IRS-2基因的1057位點各遺傳型比例，并揭示了IRS-2基因多態性與GDM發生率以及鐵代謝紊亂水平之間的關系，為臨床干預治療提供參考。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選擇2018年1月至2023年3月溫州市中心醫院收治的GDM患者50例和同期收治的正常孕產婦50名為研究對象。納入標準：①符合《婦產科學》（第8版）診斷標準的GDM患者[7]；②孕期沒有產科并發癥和內外科合并癥；③已經獲得患者及其家屬的知情同意。排除標準：①有GDM病史；②既往有高血壓、肝腎疾病、糖尿病等疾病史；③既往有不良用藥史。本研究經本院倫理委員會審核通過（批號：快2021-04-060）。

1.2 一般檢查和生化檢驗

收集兩組孕婦年齡、身高、體質量、孕次、產次及糖尿病家族史信息，計算BMI。對兩組孕婦在孕24～26周時行75 g葡萄糖進行糖耐量試驗。留取早晨的空腹外周靜脈血，進行相關指標的檢測。采用全自動生化儀及化學發光法測定空腹血糖、胰島素、C肽、血清鐵蛋白、高密度脂蛋白；采用原子吸收分光光度法測定血清鐵；采用免疫比濁法測量血清轉鐵蛋白。根據Homa穩態模型計算胰島素抵抗指數，胰島素抵抗指數=空腹血糖（mmol/L）×空腹胰島素（μU/mL）/22.5，該值越大代表對胰島素的抵抗性越強。

1.3 IRS-2位點SNP信息獲取

通過美國國家生物技術信息中心大型數據庫（NCBI數據庫，http://www.ncbi.nlm.nih.gov）搜索人IRS2基因的外顯子測序數據結果，下載相關數據，得到人IRS-2基因的SNP位點、頻率以及翻譯后氨基酸相關數據。隨后，將次要等位基因出現頻率≥0.01作為篩選標準，篩選得到IRS-2位點高頻核苷酸多態性相關信息表，作為后續的主要研究位點。

1.4 IRS-2基因G1057D位點基因型鑒定

收集患者外周血后，采用QIAamp blood DNA提取試劑盒（德國凱杰公司），提取外周血總DNA，通過限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應結合測序技術進行基因型的判定。根據NCBI上NC_000013.11的IRS2序列信息以及NCBI primer blast數據庫合成引物，上下游引物如下：上游：5’ GTCTCCGCTCTCCG ACTACA 3’，下游：5’ GAGAAGGTCTCGGAACTGTGG 3’。擴增產物片段長度為543 bp。測序結果見圖1。1057GG純合密碼子為GGC，編碼甘氨酸（Gly, G），后續稱為GG型。1057GA雜合密碼子為GAC，編碼天冬氨酸（Asp, D），后續稱為GD型。1057AA純合子密碼為GAC，后續稱為DD型。

圖1 IRS-2基因G1057D位點基因測序結果

1.5 統計學處理方法

采用SPSS27.0統計學軟件。經Hardy-Weinberg平衡檢驗，確認樣本的群體代表性。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料采用頻數和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；變量之間的相關性用Pearson相關分析；采用Logistic回歸分析計算不同遺傳型的相對危險度。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

兩組孕婦年齡、孕周、孕前BMI、孕次、初產/經產情況、糖尿病家族史情況等一般資料差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組間一般資料比較（每組n=50）

2.2 兩組間孕期糖代謝水平比較

GDM組空腹血糖、空腹胰島素、空腹C肽、胰島素抵抗指數均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數比較（每組n=50，±s）

表2 兩組空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數比較（每組n=50，±s）

組別空腹血糖（mmol/L）空腹胰島素（μU/mL）空腹C肽（nmol/L）胰島素抵抗指數對照組4.26±0.0810.86±0.680.76±0.052.09±0.15 GDM組5.99±0.1416.02±1.650.92±0.064.25±0.42 t 10.5412.8862.023 4.818 P＜0.0010.0050.046＜0.001

2.3 兩組間孕期鐵代謝水平比較

GDM組血清鐵、鐵蛋白水平均顯著高于對照組（P＜0.001），而兩組間轉鐵蛋白差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 兩組血清鐵、鐵蛋白、轉鐵蛋白比較（每組n=50，±s）

表3 兩組血清鐵、鐵蛋白、轉鐵蛋白比較（每組n=50，±s）

組別血清鐵（μmol/L）鐵蛋白（μg/L）轉鐵蛋白（g/L）對照組15.11±0.5319.30±1.423.36±0.21 GDM組33.32±1.0959.26±3.783.16±0.10 t 14.975 9.8960.814 P＜0.001＜0.0010.419

2.4 血清鐵代謝指標與血糖代謝指標的相關性分析

Pearson相關分析結果表明，GDM組和觀察組的血清鐵與空腹血糖呈正相關（P＜0.01）。GDM組的血清鐵及鐵蛋白與空腹胰島素呈正相關（P＜0.05）。GDM組的血清鐵及鐵蛋白與胰島素抵抗指數呈正相關（P＜0.01）。見表4。

表4 血糖代謝指標與鐵代謝指標的相關性

2.5 IRS-2基因全點位SNP分析

根據IRS-2基因全外顯子測序結果統計，位于1057位點的甘氨酸（glycine, G）至天冬氨酸（aspartic, D）是出現頻率最高的有義突變，見表5。

表5 NCBI數據庫IRS2全外顯子測序相關信息

2.6 IRS-2 G1057D與GDM患病風險分析

以是否被診斷為GDM為因變量，以遺傳型為自變量進行Logistic回歸分析，GDM組中，GG、GD和DD遺傳型頻率分別為24%、44%和32%，對照組分別為64%、28%和8%，GDM組的GD和DD遺傳型相較于對照組更常見。相比于GG遺傳型個體，GD遺傳型（OR=4.19，95%CI=1.63～10.76，P=0.003）與DD遺傳型（OR=10.67，95%CI=2.96～38.40，P＜0.001）個體的GDM患病風險均顯著增高。見表6。

表6 IRS-2 G1057D與GDM易感性的Logistic回歸分析

2.7 不同IRS-2突變型間鐵代謝水平比較

無論孕婦是否患有GDM，GD和DD遺傳型的血清鐵及鐵蛋白水平均顯著高于GG遺傳型（P＜0.01），GD和DD遺傳型的胰島素抵抗指數均顯著高于GG遺傳型（P＜0.05），見表7。

表7 各遺傳型血清鐵、鐵蛋白、轉鐵蛋白、胰島素抵抗指數比較（±s）

表7 各遺傳型血清鐵、鐵蛋白、轉鐵蛋白、胰島素抵抗指數比較（±s）

與GG型比：aP＜0.05；與GD型比：bP＜0.05。

基因型例數血清鐵（μmol/L）鐵蛋白（μg/L）轉鐵蛋白（g/L）胰島素抵抗指數GG型4419.21±1.5320.59±1.523.08±0.162.49±0.26 GD型3626.25±1.74a44.18±3.91a3.36±0.173.28±0.29a DD型2031.57±1.88a71.58±7.09ab3.48±0.374.47±0.91a F 11.813 42.0580.9434.816 P＜0.001＜0.0010.3930.010

3 討論

GDM是一種常見的高風險妊娠疾病，可能導致多種嚴重的不良妊娠后果，包括流產、妊娠期高血壓疾病、感染以及巨大兒導致的生產困難等。盡管目前的研究仍未能闡明GDM的病因，但其發病機制被認為是由多方面因素導致的，主要因素包括遺傳、胰島素缺乏、胰島素抵抗、機體免疫狀態等。胰島素穩態失衡被認為是導致GDM的主要原因，孕婦在妊娠期間對葡萄糖需要量增加，導致胰島細胞的代謝負擔加重并導致胰島素分泌不足，并且妊娠期間分泌的多種升糖激素同樣會導致組織和細胞對胰島素敏感性降低而促進胰島素抵抗的發 生[8-9]。既往研究已經揭示了T2DM及GDM存在家族發病的傾向，而多個基因的突變表型及其突變機制也被深入研究[10]，證明遺傳因素在GDM的發生、發展中起到了重要作用。目前，臨床對于GDM患者的主要治療手段仍是胰島素注射，復雜的注射操作極大地影響了患者的治療依從性。因此，探明GDM的病因、發病機制，及早預測疾病發生并開發新型藥物是GDM的主要研究方向。

近年來的研究顯示，機體的鐵代謝異常與T2DM具有相關性[11]。鐵是胎兒生長發育必不可少的微量元素，約40%的女性由于缺乏鐵儲備可能導致妊娠期貧血的癥狀。本研究發現，在GDM患者中，糖代謝相關指標及鐵代謝相關指標均顯著高于對照組。本研究在糖代謝指標與鐵代謝指標的相關性試驗中發現，GDM組的血清鐵、鐵蛋白與空腹血糖、空腹胰島素以及胰島素抵抗指數呈正相關關系。其具體機制可能是機體異常的糖代謝干擾了鐵代謝的正常運行，過量的鐵代謝物如血清鐵、鐵蛋白等在體內異常蓄積，而過量的鐵可能導致細胞的應激死亡模式，如鐵死亡。這一氧化應激狀態作用于胰島細胞則可能導致胰島細胞的異常死亡，最終使機體的胰島素穩態失衡，糖尿病癥狀進一步加劇[12-13]。

隨著對IRS研究的逐步深入，研究人員已經證明了IRS基因，尤其是IRS-1[14]以及IRS-2[15]的缺失可以導致胰島素抵抗以及糖尿病的發生。然而，在人群中，大部分糖尿病患者IRS突變是以單核苷酸突變形式出現的，因此研究IRS-2基因的SNP則更貼近臨床現實[16]。本研究通過篩選IRS-2基因的全基因組測序結果，得到位于1057位點的GtoD突變是出現頻率最高的有義突變。而本研究結果顯示，GDM患者的IRS-2 1057位點的D等位基因與DD遺傳型明顯高于對照組，并且相比于GG遺傳型個體，GD遺傳型（OR=4.19，95%CI=1.63～10.76，P=0.003）與DD遺傳型（OR=10.67，95%CI=2.96～38.40，P＜0.001）個體的GDM患病風險均顯著增高。導致這一結果的機制可能是由于G1057D突變導致IRS-2轉錄產生的蛋白質發生了結構變化，導致胰島素與IRS-2的結合效率下降，機體的胰島素抵抗指數上升，最終促進了GDM的發生[17]。

最終，筆者對IRS-2基因的1057位點遺傳型多態性與鐵代謝物以及胰島素抵抗指數進行了相關性分析。結果顯示，在GDM和對照組的混合樣本中，GD和DD遺傳型的血清鐵水平、鐵蛋白水平以及胰島素抵抗指數均顯著高于對照組，顯示IRS-2的GD遺傳型與DD遺傳型與鐵代謝異常具有顯著的相關性。發生這一現象的原因可能是，IRS-2基因的突變導致了機體表達了突變的IRS-2蛋白產生并導致胰島素抵抗增加[18]。而正常的鐵代謝在異常糖代謝的影響下受到干擾，各類鐵代謝物在體內異常蓄積，最終引起胰島細胞的異常鐵死亡以及周圍組織對胰島素的抵抗，進一步加劇了糖尿病的發展[19]。

綜上所述，本研究的結果揭示了在妊娠期人群中，IRS-2基因是否存在G1057D多態性與GDM以及血清鐵代謝異常是否發生具有顯著相關性，可為GDM易感人群的早期識別、診斷和預防提供新的理論依據，為GDM早防早治策略的制定提供積極有效的手段。這一發現為理解GDM的病因和發病機制提供了新的視角，也為開發新的治療策略提供了可能。然而，本研究還存在一些局限性，例如妊娠期人群樣本量較小，未能收集溫州本地的非GDM患者的IRS-2基因數據、未能充分考慮其他可能導致GDM及血清鐵代謝異常的混雜因素，以及未能深入挖掘G1057D導致GDM的分子機制等。因此，我們的發現還需要在更大的樣本中進行驗證，并需要進一步的實驗研究來揭示其具體的分子機制。