NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950通過抑制Th1/Th17和促進Tregs改善膿毒癥小鼠器官損傷

葉玉妹，陳隆望，張萬里，王雪濤

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 超聲影像科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325015；3.溫州市龍灣區(qū)第一人民醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325024；4.溫州市龍灣區(qū)第一人民醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325024

膿毒癥是以感染性損傷引起的病理生理和生化改變?yōu)樘卣鞯木C合征，可導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙[1]，病死率高達35.5%[2]。機體炎癥反應(yīng)的激活與放大是膿毒癥發(fā)生與進展的關(guān)鍵因素[3]。 膿毒癥中輔助性T細(xì)胞（helper T cell, Th）1、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell, Tregs）亞群之間的平衡受損，Th1和Th17驅(qū)動的炎癥及Tregs誘導(dǎo)的抗炎作用與膿毒癥的免疫發(fā)病機制相關(guān)[4-6]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain like receptors family pyrin domain containing 3, NLRP3）炎癥小體作為炎癥反應(yīng)的上游，激活后可促進下游炎性細(xì)胞因子的合成和分泌，如IL-1β和IL-18，引起器官炎癥反應(yīng)持續(xù)放大[7]。阻斷NLRP3炎癥小體激活顯著降低IL-1β的產(chǎn)生，增加Tregs比例，同時降低Th17比例[8]。MCC950作為NLRP3抑制劑[9]，在各種臨床免疫疾病模型中展現(xiàn)優(yōu)越的療效，包括非酒精性脂肪性肝炎模型和哮喘模型[10-11]。但MCC950對膿毒癥器官損害的影響及其作用機制仍未明確。因此，本研究擬采用MCC950抑制NLRP3炎癥小體的激活，探討MCC950對膿毒癥小鼠T細(xì)胞免疫反應(yīng)及器官損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料和動物 MCC950（純度＞99.9%）購自美國Selleck Chemicals公司。清潔級C57BL/6小鼠（雄性，8周齡，體質(zhì)量22～25 g）購自上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SYXK（浙）2015-0009。小鼠生活在無特定病原體、 （22±2）℃、12 h/12 h晝夜交替環(huán)境中，給予足量的標(biāo)準(zhǔn)食物和水。在實驗前1周允許小鼠適應(yīng)環(huán)境。所有實驗均根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院《保護和使用動物指南》進行。

1.1.2 主要試劑及儀器 小鼠ELISA試劑盒（IL-1β、IL-18、IL-1α、IL-6、TNF-α）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；改良HE染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗小鼠NLRP3單抗、兔抗小鼠GAPDH單抗購自美國Abcam公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（二抗）購自上海碧云天生物技術(shù)公司；小鼠脾臟組織淋巴細(xì)胞分離液試劑盒購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；BV786標(biāo)記的CD4單抗、BV650標(biāo)記的抗鼠IL-17單抗、PE標(biāo)記的IFN-γ單抗、BV421標(biāo)記的叉頭框蛋白3（forkhead box protein 3, Foxp3）單抗、BB515標(biāo)記的CD25單抗購自美國BD公司；酶標(biāo)儀購自美國Beckman公司；BD FACSCanto II流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 膿毒癥小鼠模型構(gòu)建 采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)建立膿毒癥小鼠模型[12]。予自由飲水，禁食1 d后，2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠。沿腹中線切開1 cm左右切口，分離盲腸并用3-0絲線在其末端0.5 cm處結(jié)扎。20號針頭穿透結(jié)扎線遠(yuǎn)端盲腸的兩側(cè)腸壁，擠出少量腸內(nèi)容物后，將盲腸及糞便回納，逐層縫合關(guān)腹。75%乙醇消毒切口，立即皮下注射1 mL無菌且室溫的0.9%氯化鈉溶液進行液體復(fù)蘇。

1.2.2 分組和處理 將18只小鼠隨機分為假手術(shù)組（sham組）、膿毒癥模型組（CLP組）和MCC950治療組（MCC950組），每組6只。在CLP術(shù)前2 h，單次腹腔注射50 mg/kg MCC950或等體積0.9%氯化鈉溶液。sham組只開腹、牽引盲腸、復(fù)位、關(guān)腹、復(fù)蘇，但盲腸既不結(jié)扎，也不穿孔。于CLP術(shù)后24 h麻醉小鼠，采用二氧化碳吸入法處死。收集血清和組織樣本進行后續(xù)分析。為了分析小鼠存活率。將60只小鼠隨機分為sham組、CLP組、MCC950組，每組20 只。每12 h觀察1次小鼠的存活情況，7 d后分析小鼠的存活率。

1.2.3 肺臟、腎臟組織病理染色 采用HE染色法觀察組織病理變化。收集小鼠肺臟和腎臟組織，浸泡于4%多聚甲醛中48 h。組織標(biāo)本經(jīng)脫水、透明、打蠟、包埋后，切成4 μm厚的切片。根據(jù)HE染色試劑盒說明書，采用二甲苯脫蠟后，進行染色，顯微鏡下觀察并評分。肺損傷程度根據(jù)以下四個方面進行評估[13]：①中心粒細(xì)胞浸潤；②出血；③間質(zhì)水腫；④肺泡充血程度（0分：無損傷；1分：＜25%損傷；2分：＜50%損傷；3分：＜75%損傷；4分，＜100%損傷）。將每個類別的評分相加即為總分。腎損傷程度[14]根據(jù)毛刷邊緣脫落、細(xì)胞空泡、細(xì)胞脫屑、腎小管擴張和腎小管變性五個方面進行評分，均從0～3分評分，總分為15分。

1.2.4 ELISA法檢測炎癥因子水平 收集小鼠血清和肺組織標(biāo)本，根據(jù)ELISA試劑盒的操作說明，檢測IL-1β、IL-18、IL-1α、IL-6、TNF-α的含量。

1.2.5 Western blot檢測NLRP3蛋白表達水平 收集小鼠脾臟，加入組織裂解液，充分勻漿后，在4 ℃ 以13 000×g轉(zhuǎn)速離心20 min，收集上清液。采用BCA濃度測定試劑盒定量測定上清液中的蛋白濃度。然后將蛋白與蛋白質(zhì)緩沖液混合，100 ℃干浴鍋中加熱10 min使蛋白變性。在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中分離等量蛋白質(zhì)（30 μg），隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下將膜與5%脫脂奶粉封閉2 h后，將膜與抗NLRP3抗體（稀釋度1:1 000）、抗GAPDH抗體（稀釋度1:1 000）在4 ℃下孵育過夜。洗膜后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（稀釋度1:5 000）在室溫下?lián)u床孵育60 min。3次漂洗后，采用ECL試劑盒顯示蛋白質(zhì)條帶，圖像成像系統(tǒng)和ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.2.6 脾臟淋巴細(xì)胞的分離 無菌環(huán)境下分離小鼠脾臟，將脾臟撕成小塊后輕輕研磨，用PBS和200目篩網(wǎng)沖洗、過濾，獲得細(xì)胞懸液。用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞。經(jīng)2次PBS洗滌后，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至淋巴細(xì)胞分離液中，在4 ℃下1 000×g離心15 min， 取第2層霧化細(xì)胞層。經(jīng)兩次洗滌后，獲得脾淋巴細(xì)胞懸液。細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測Th1、Th17、Tregs比例 將獲得的脾淋巴細(xì)胞懸液調(diào)整濃度為2×107個/mL。等 分細(xì)胞懸液，每管50 μL，再補加50 μL染色液。通過 以下方法獲得Th1、Th17、Tregs比例：①Th1：在低溫和黑暗環(huán)境中用抗CD4抗體孵育細(xì)胞30 min，將細(xì)胞固定和破膜后，加入抗IFN-γ抗體孵育30 min， 可獲得CD4+IFN-γ+Th1細(xì)胞；②Th17：用抗CD4抗體在4 ℃、黑暗環(huán)境中孵育細(xì)胞，將細(xì)胞固定并破膜后，加入抗IL-17抗體孵育30 min，可獲得CD4+IL-17+Th17細(xì)胞；③Tregs：將抗CD4抗體和抗CD25抗體與脾淋巴細(xì)胞在4 ℃、黑暗環(huán)境中進行細(xì)胞外染色30 min，將細(xì)胞固定并破膜后，加入抗Foxp3抗體孵育30 min，可獲得CD4+CD25+Foxp3+Tregs細(xì)胞。

設(shè)門策略如下：首先對活細(xì)胞進行選擇，圈出CD4+細(xì)胞，然后分別選擇IFN-γ+細(xì)胞和IL-17+細(xì)胞，即為CD4+IFN-γ+Th1細(xì)胞和CD4+IL-17+Th17細(xì)胞。另外，圈出CD4+細(xì)胞后，繼續(xù)選擇CD25+和Foxp3+細(xì)胞，即為CD4+CD25+Foxp3+Tregs細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法

采用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較采用Log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCC950減輕膿毒癥小鼠臟器損傷，提高膿毒癥小鼠生存率

采用HE染色觀察肺臟與腎臟的組織病理學(xué)改變。在肺組織中，與sham組相比，CLP組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤、水腫和肺泡壁增厚（P＜0.05）；與CLP組比較，MCC950組病理癥狀減輕（P＜0.05），見圖1A、圖1C。在腎組織中，與sham組相比，CLP組腎組織出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞脫落，刷狀緣和上皮細(xì)胞減少，腎小球萎縮，腎小管成彌漫性擴張，大量炎性細(xì)胞浸潤（P＜0.05）；與CLP組比較，MCC950組腎小管上皮細(xì)胞水腫減輕，腎小球萎縮不明顯，炎性細(xì)胞浸潤較少（P＜0.05），見圖1B、圖1D。此外，在實驗期間檢測小鼠生存率。sham組小鼠在術(shù)后7 d全部存活；與sham組比較，CLP組小鼠7 d生存率僅為30%（P＜0.05）；與CLP組相比，MCC950組的存活率出現(xiàn)有效逆轉(zhuǎn)（P＜0.05），見圖1E。

圖1 各組肺臟和腎臟病理損傷及存活率比較

2.2 MCC950抑制膿毒癥小鼠脾臟NLRP3炎癥小體的激活

采用Western blot法檢測脾臟NLRP3蛋白含量，以觀察MCC950對NLRP3炎癥小體的抑制作用。與sham組相比，CLP組NLRP3的蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與CLP組相比，MCC950組NLRP3的蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖2A、圖2B。成熟的IL-1β和IL-18是NLRP3激活的結(jié)果。采用ELISA法測定小鼠血清中IL-1β和IL-18蛋白的濃度。結(jié)果顯示，CLP組中IL-1β和IL-18水平均高于sham組（P＜0.05），而MCC950組這兩種細(xì)胞因子水平顯著降低（P＜ 0.05），見圖2C、圖2D。

圖2 各組脾臟NLRP3蛋白及血清IL-1β、IL-18水平比較

2.3 MCC950抑制膿毒癥小鼠脾臟Th1/Th17反應(yīng)并增強Tregs反應(yīng)

為了進一步明確MCC950改善膿毒癥小鼠器官損傷的機制，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟淋巴細(xì)胞中Th1、Th17和Tregs的比例。與sham組相比，CLP組脾臟CD4+IFN-γ+Th1、CD4+IL-17+Th17和 CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例均升高（P＜0.05）；與CLP組相比，MCC950組脾臟CD4+IFN-γ+Th1和CD4+IL+17+Th17比例降低，而CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例進一步升高（P＜0.05），見圖3、圖4。

圖3 各組脾臟CD4+IFN-γ+ Th1和CD4+IL-17+ Th17比例比較

圖4 各組脾臟CD4+CD25+Foxp3+ Tregs比例比較

2.4 MCC950減輕膿毒癥小鼠炎癥反應(yīng)

隨后，采用ELISA法檢測了小鼠血清和肺組織的IL-1α、IL-6、TNF-α蛋白水平，以明確MCC950對膿毒癥小鼠炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，與sham組相比，CLP組血清和肺組織的IL-1α、IL-6、TNF-α蛋白水平均升高（P＜0.05）；與CLP組相比，MCC950組血清和肺組織的炎癥因子水平得到有效降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組血清和肺組織中IL-1α、IL-6、TNF-α比較

3 討論

膿毒癥的特點是持續(xù)的感染和不受控制的全身炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致組織損傷，并最終導(dǎo)致多器官衰竭[15]。目前，膿毒癥器官損傷的機制尚不明確，主要認(rèn)為與炎癥反應(yīng)失衡有關(guān)[3]。NLRP3炎癥小體作為免疫應(yīng)答的重要組成部分，被證實參與多種炎癥反應(yīng)性和自身免疫性疾病。許多研究報告了NLRP3炎癥小體對膿毒癥發(fā)病機制的影響[16-18]。FUJIMURA等[16]發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體的形成可導(dǎo)致膿毒性心肌病的發(fā)生。NLRP3參與膿毒癥誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮[17]。MORAES等[18]還發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體釋放大量IL-1β，可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞興奮性突觸消失，從而引發(fā)膿毒癥相關(guān)腦病。同時研究證實，在膿毒癥合并急性呼吸窘迫綜合征的患者中，宿主血清中NLRP3的含量對其28 d死亡率具有顯著的預(yù)測價 值[19]。上述研究表明抑制NLRP3炎癥小體的激活可能對膿毒癥患者有益。因此，我們建立了CLP誘導(dǎo)的膿毒癥模型，以確認(rèn)膿毒癥中NLRP3的作用，并研究其作用機制。研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠NLRP3表達活躍，炎癥反應(yīng)劇烈，器官損傷嚴(yán)重，具有極高的死亡率。同時，脾臟T細(xì)胞分化向Th1和Th17偏倚。這與以往研究相似[20-21]。而采用MCC950抑制NLRP3的激活后，膿毒癥小鼠的炎癥反應(yīng)減弱，器官損傷減輕，該過程可能是通過抑制Th1/Th17反應(yīng)和增強Tregs反應(yīng)實現(xiàn)的。

膿毒癥患者的臟器損傷與預(yù)后相關(guān)，其中肺臟和腎臟是膿毒癥疾病進程中極易受累的器官[22]。膿毒癥常導(dǎo)致肺部炎癥無法消退，并誘發(fā)急性呼吸窘迫綜合征[23-24]。其主要病理學(xué)特征為大量炎性細(xì)胞浸潤，屏障完整性喪失和肺泡毛細(xì)血管通透性增加，從而導(dǎo)致肺組織損傷[25-26]。另外，研究顯示超過一半的膿毒癥患者會出現(xiàn)腎功能不全[27]。目前的證據(jù)表明，局部微循環(huán)障礙和炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致膿毒癥性腎損害的重要原因，包括缺血再灌注損傷、氧化應(yīng)激和腎小管凋亡[28]。KIM等[29]證實，改善膿毒癥小鼠的器官損害，可明顯提升其生存率。因此，我們采用MCC950進行干預(yù)，觀察膿毒癥小鼠的器官損害情況，同時觀察小鼠的7 d生存率。結(jié)果證實MCC950改善肺臟和腎臟的病理學(xué)損傷，提高了小鼠的生存率。可見，MCC950對于改善膿毒癥小鼠的器官損害有積極作用。另外，全身炎癥是膿毒癥死亡的主要原因。抑制炎癥反應(yīng)對治療膿毒癥引起的器官損傷具有明顯的療效[30]。NLRP3炎癥小體的激活可促進L-1β和IL-18的成熟和分泌，增強中性粒細(xì)胞募集，促進Th1或Th17分化[31-32]。本研究證實了MCC950處理后膿毒癥小鼠的NLPR3、IL-1β、IL-18的水平下降。這表明MCC950可以通過抑制NLRP3炎癥小體的活化來緩解膿毒癥。此外，IL-1α、IL-6和TNF-α被認(rèn)為是關(guān)鍵的促炎因子[33]。一些報告表明，IL-1α、IL-6和TNF-α可以作為膿毒癥嚴(yán)重程度的評價標(biāo)準(zhǔn)，并且細(xì)胞因子水平升高可以預(yù)測膿毒癥小鼠的死亡率[34-37]。在本研究中，MCC950有效抑制了血清、肺臟及腎臟中IL-1α、IL-6和TNF-α的表達水平，展現(xiàn)出有效的抗炎特性。

炎癥和免疫反應(yīng)密切相關(guān)并且相互作用。受到抗原刺激后，幼稚CD4+T細(xì)胞接收不同細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，可以快速分化為CD4+T細(xì)胞亞群，包括多種Th細(xì)胞（Th1、Th17）和Treg[38]。Th細(xì)胞是巨噬細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞及B細(xì)胞成熟和功能活化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，而Treg主要維持外周免疫耐受[38-39]。Th1和Th17通常分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-22等細(xì)胞因子參與促炎反應(yīng)[40-42]。Treg通常表達CD4+CD25+雙陽性，F(xiàn)oxp3是Treg細(xì)胞的重要基因，對免疫抑制具有重要作用[43-44]。這幾個T細(xì)胞亞群相互作用，在生理條件下共同維持機體免疫平衡。既往有研究表明，Th1和Th17參與膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展，Tregs延緩膿毒癥的進展[45]。膿毒癥會導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞亞群失衡和T細(xì)胞功能受損[45-46]。LIU等[45]證實抑制Th1和Th17反應(yīng)，促進Tregs反應(yīng)可以改善膿毒癥相關(guān)的胰腺損傷；JIN等[4]發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞的抗原提呈可顯著增加CD4+T細(xì)胞活化、增殖和Th1分化，最終加重促炎標(biāo)志物的分泌和肺損傷，降低膿毒癥小鼠的存活率。臨床上也有數(shù)據(jù)表明膿毒癥患者血清中鎳紋蛋白樣蛋白（meteorin-like, metrnl）缺乏導(dǎo)致的高炎癥狀態(tài)明顯增加膿毒癥的死亡率，同時證實metrnl通過調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡保護機體免受細(xì)菌侵染[47]。可見，Th1/Th17和Tregs的功能變化操控著膿毒癥的疾病進程。因此，我們推測NLRP3抑制劑MCC950對膿毒癥的保護性作用可能部分歸因于調(diào)節(jié)Th1/Th17和Tregs的平衡。我們的數(shù)據(jù)表明，膿毒癥小鼠脾臟CD4+IFN-γ+Th1和CD4+IL-17+Th17數(shù)量明顯增加，伴隨著CD4+CD25+Foxp3+Tregs數(shù)量增多。應(yīng)用MCC950后，CD4+IFN-γ+Th1和CD4+IL-17+Th17數(shù)量減少，CD4+CD25+Foxp3+Tregs數(shù)量進一步增多，抑制了Th1/Th17應(yīng)答，增加了Tregs免疫反應(yīng)。此外，有研究顯示MCC950抑制NLRP3可降低小鼠的中性粒細(xì)胞浸潤和T細(xì)胞活化，有助于治療重癥胰腺炎[48]。也有研究報道MCC950改變Treg/Th17平衡，調(diào)整了炎癥反應(yīng)的方向，從而減輕了根尖牙周炎[8]。另外，在哮喘小鼠模型中，MCC950通過下調(diào)Th17比例和上調(diào)Tregs比例，減輕了氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥[11]。上述研究均表明MCC950可有效調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化水平，有助于炎癥反應(yīng)的調(diào)整。這與我們的研究內(nèi)容一致，MCC950參與調(diào)整膿毒癥中Th1/Th17和Treg的應(yīng)答改變。

總之，MCC950通過抑制NLRP3的激活，降低了膿毒癥的炎癥反應(yīng)，減輕了器官損傷。本研究表明，MCC950干預(yù)對膿毒癥小鼠器官損傷有保護作用，并且該作用可能是通過抑制Th1/Th17反應(yīng)和增強Tregs反應(yīng)實現(xiàn)的。然而，本研究為動物實驗，雖然證實T細(xì)胞分化參與了膿毒癥的進程，但仍有明顯的局限性和不足，有必要深入探討其確切機制，同時為臨床上的有效性研究提供證據(jù)。