沙眼衣原體Pgp3多克隆抗體的制備及鑒定

周璐琪，楊佳，李洋，朱珊麗

溫州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 分子病毒與免疫研究所，浙江 溫州 325035

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis, Ct）是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生、有獨(dú)特雙相發(fā)育周期的原核細(xì)胞型微生物，其唯一的自然宿主是人類。Ct引起的疾病范圍廣泛，可累及眼、生殖道、直腸等多個(gè)器官，如果不及時(shí)治療，可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，如盆腔炎性疾病、異位妊娠、輸卵管積水和不孕癥等[1]。 Ct包含感染性的原體（elementary body, EB）和無感染性的始體亦稱網(wǎng)狀體（initial body, RB）[2]，EB以吞飲的方式進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)形成空泡，空泡內(nèi)EB增大發(fā)育為RB，RB在空泡內(nèi)以二分裂形式繁殖并形成眾多的子代原體，構(gòu)成各種形態(tài)的包涵體。成熟的子代原體從宿主細(xì)胞釋放出來感染其他的宿主細(xì)胞，開始新的發(fā)育周期，整個(gè)發(fā)育周期約需要 40 h[3]。

Ct根據(jù)血清型可分為19個(gè)亞型，其中E血清型在國內(nèi)外報(bào)道生殖道感染中最為常見[4]，因此本研究主要選用E血清型Ct作為研究對(duì)象。除了高度保守的基因組外，所有菌株都攜帶一個(gè)大小約7.5 kb的隱蔽性質(zhì)粒，編碼8個(gè)質(zhì)粒基因蛋白（plasmid gene protein, Pgp）即Pgp1～Pgp8[5]。其中Pgp3是唯一分泌到細(xì)胞質(zhì)中的蛋白，X射線晶體學(xué)研究發(fā)現(xiàn)Pgp3天然結(jié)構(gòu)為約84 kDa的同源三聚體蛋白[6-7]。 它通過調(diào)節(jié)信號(hào)通路維持宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而參與Ct的致病過程[8]。此外，Pgp3蛋白上含有多種優(yōu)勢(shì)抗原表位，對(duì)Ct感染血清進(jìn)行抗原優(yōu)勢(shì)表位篩選發(fā)現(xiàn)Pgp3的抗原性最強(qiáng)，高于衣原體蛋白酶樣活性因子（chlamydial protease like activity factor,CPAF）和主要外膜蛋白（major outer membrane protein, MOMP），表明Pgp3可以作為衣原體疫苗的候選抗原[9]。本研究通過體外原核系統(tǒng)表達(dá)并純化Pgp3蛋白，免疫日本大耳白兔以制備Pgp3多克隆抗體，并進(jìn)一步檢測(cè)該抗體的效價(jià)和特異性，為進(jìn)一步探究Pgp3在Ct感染過程中的致病機(jī)制及相關(guān)疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞 HeLa細(xì)胞由溫州醫(yī)科大學(xué)分子病毒與免疫研究所保存；pET30a（+）/Pgp3重組質(zhì)粒及E型Ct標(biāo)準(zhǔn)株由天津醫(yī)科大學(xué)劉原君教授惠贈(zèng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康純種新西蘭兔購于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK （浙）2019-0009。

1.1.3 主要試劑及儀器 DNA marker和質(zhì)粒提取試劑盒（FastPure Plasmid Mini Kit）購自南京諾維贊生物科技有限公司；氨芐青霉素（Ampicillin,AMP）、卡那霉素和異丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG）購自上海杰瑞生物有限公司；鎳螯合親和層析樹脂（Ni-NTA）購自德國Qiagen公司；His-Tag抗體購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份公司；Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、抗熒光猝滅劑、不含SDS的RIPA裂解液（弱）（貨號(hào)：P0013D）和蛋白酶抑制劑混合物（通用性，×100）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Hoechst33342和皂素（Saponin）購自上海金山化學(xué)試劑有限公司；ECL發(fā)光底液購自美國Bio-rad公司；二乙胺乙基葡聚糖（DEAE-D）、完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑購自美國Sigma公司；兩性霉素、慶大霉素、放線菌酮、萬古霉素購自美國Solarbio公司；高分子量非變性電泳蛋白Marker（45-669 kDa）購自北京蘭杰柯科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Ct預(yù)處理及培養(yǎng) 將置于-80 ℃保存的E型Ct標(biāo)準(zhǔn)株取出，反復(fù)凍融2次，加入無菌玻璃珠渦旋振蕩90 s，3 500 r/min離心5 min，吸取上清液備用。將HeLa細(xì)胞消化后按2×105個(gè)/孔鋪于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；棄去培養(yǎng)液，PBS清洗后，每孔加入1 mL DEAE-D （30 μg/mL）溶液，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育 30 min；隨后每孔加入2 mL RPMI1640培養(yǎng)基和 20 μL處理后的E型Ct標(biāo)準(zhǔn)株，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱30 min；將細(xì)胞培養(yǎng)板于32 ℃，1 500 r/min， 離心1 h；棄去孔中液體，每孔加入2 mL衣原體感染液（RPMI 1640完全培養(yǎng)基含放線菌酮1 mg/mL、兩性霉素2.5 mg/mL、慶大霉素50 mg/mL、萬古霉素25 mg/mL），37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱靜置36～48 h。

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化鑒定 將含有 pET30（+）/Pgp3重組質(zhì)粒的E.coliBL21（DE3）接種于500 mL含Kana的LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)4 h至菌液A600=0.6～0.8；加入IPTG使其終濃度為1 mmol/L，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)6 h，離心收取菌液；用30 mL的8 mol/L尿素重懸細(xì)菌，冰浴超聲破碎細(xì)菌；12 000 r/min離心30 min，收取上清液；經(jīng)鎳螯合親和層析樹脂（Ni-NTA）及咪唑純化Pgp3重組蛋白；將蛋白分別置于4 mol/L、2 mol/L尿素溶液中透析2 h，最后置于PBS溶液中透析過夜；用SDS-PAGE電泳和Western blot進(jìn)行分析。

1.2.3 重組蛋白的表達(dá)形式分析 在含有pET30（+）/Pgp3質(zhì)粒的500 mL菌液中加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Pgp3蛋白，離心收集菌體；用10 mL PBS緩沖液及8 mol/L尿素重懸菌體，冰浴300W超聲破碎細(xì)菌 30 min（單次超聲時(shí)間3 s，間歇3 s）；12 000 r/min 離心10 min，分別收取誘導(dǎo)前細(xì)菌、誘導(dǎo)后細(xì)菌、誘導(dǎo)后上清液及誘導(dǎo)后包涵體蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE分析以明確Pgp3重組蛋白在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)形式。

1.2.4 Pgp3多克隆抗體的制備 取2只健康日本大耳白兔，在注射Pgp3重組蛋白之前進(jìn)行耳緣靜脈采血，分離血清作為陰性對(duì)照。取1 mL 500 μg/mL復(fù)性的Pgp3重組蛋白與弗氏佐劑等體積混合，充分乳化，以1 mL/只體積經(jīng)皮下多點(diǎn)免疫家兔；初次免疫采用弗氏完全佐劑，初次免疫后每隔2周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，采用弗式不完全佐劑；第3次免疫結(jié)束后經(jīng)兔心臟采血，分離血清，分裝后置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 抗體效價(jià)檢測(cè) 將純化并透析的Pgp3重組蛋白用包被緩沖液稀釋至終濃度10 μg/mL，按 100 μL/孔加入酶標(biāo)板中4 ℃包被過夜；PBST洗滌3遍后每孔加入200 μL 5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h；將兔血清用PBS緩沖液從1:1 000依次倍比稀釋至1:512 000，每個(gè)稀釋度設(shè)置3復(fù)孔加樣，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌后加入羊抗兔HRP-IgG（H+L）（1: 5 000），37 ℃孵育1 h；避光加入100 μL TMB顯色液，37 ℃避光顯色10 min后加入終止液，置于酶標(biāo)儀上讀取A450值，以（實(shí)驗(yàn)組血清A450-A450空白）/（PBS組血清A450-A450空白）＞2.1（即P/N＞2.1）的血清最高稀釋倍數(shù)判定為血清抗體效價(jià)[10]。

1.2.6 多克隆抗體與重組及天然Pgp3蛋白的結(jié)合特異性檢測(cè)

1.2.6.1 血清抗體與重組蛋白結(jié)合的Western blot鑒定 將誘導(dǎo)前菌體、誘導(dǎo)后菌體分別經(jīng) 8 mol/L尿素裂解后與Ni-NTA純化的Pgp3重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h，TBST洗滌后分別孵育商品化的兔抗His-tag單克隆抗體、本研究制備的兔多克隆抗體（1:10 000），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌后加入羊抗兔HRP-IgG（H+L）（1:10 000），37 ℃孵育1 h；ECL顯色液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

1.2.6.2 血清抗體與天然Ppg3蛋白的非變性 Western blot鑒定 按1.2.1得到感染Ct的HeLa細(xì)胞及未感染的HeLa細(xì)胞，將細(xì)胞6孔板置于冰上，PBS清洗2次；每孔加入100 μL RIPA（弱）裂解液和1 μL蛋白酶抑制劑，靜置15 min，用細(xì)胞刮刀將貼壁的細(xì)胞碎片刮入裂解液中；放置于4 ℃搖床作用15 min；12 000 r/min 4 ℃離心15 min，收集上清液后加入5×非變性非還原蛋白上樣緩沖液（不含SDS等變性試劑，不含DTT、β-巰基乙醇等還原性試劑），同時(shí)設(shè)置未感染的HeLa細(xì)胞總蛋白及純化并復(fù)性的Pgp3重組蛋白對(duì)照。將制備的蛋白樣品經(jīng)8% Native-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h，TBST洗滌后孵育兔多克隆抗體（1:5 000），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌后加入羊抗兔HRP-IgG（H+L），37 ℃孵育2 h；ECL顯色液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

1.2.6.3 免疫熒光鑒定多克隆抗體對(duì)Ct的特異性識(shí)別 將HeLa細(xì)胞按5×104個(gè)/孔加入放置了細(xì)胞爬片的24孔板中，按1.4感染Ct；36～48 h后棄去感染液，用PBS緩沖液洗3次，加入多聚甲醛固定 15 min；PBST洗滌3次后加入打孔劑皂素（Saponin）作用15 min，隨后用5% BSA 37 ℃封閉2 h；洗滌后加入Pgp3兔多抗（1:2 000），4℃孵育過夜；洗滌后加入Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（1:2 000），37 ℃避光孵育2 h；洗滌后每孔加20 μL Hoechst33342， 避光染色10 min；再次洗滌，避光加入10 μL抗熒光淬滅封片液，熒光顯微鏡下觀察熒光情況。

2 結(jié)果

2.1 Ct感染細(xì)胞模型的建立

Ct感染HeLa細(xì)胞后48 h，在光鏡及熒光下均可看到胞質(zhì)內(nèi)顆粒感較強(qiáng)的Ct包涵體（紅色箭頭所示），內(nèi)部充滿EB和RB，胞核被擠于一側(cè)，表明Ct感染HeLa細(xì)胞模型建立成功，見圖1。

圖1 E型Ct標(biāo)準(zhǔn)株感染HeLa細(xì)胞模型鑒定

2.2 重組Pgp3蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與鑒定

SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白成功誘導(dǎo)表達(dá)，且主要以包涵體形式存在（圖2A）；以his-tag單克隆抗體作為一抗，Western blot結(jié)果顯示，在28 kDa處出現(xiàn)特異性條帶（圖2B）。說明Pgp3重組蛋白制備成功，且純度可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 Pgp3重組蛋白的表達(dá)形式分析及鑒定

2.3 多克隆抗體的效價(jià)及其與Pgp3重組蛋白的結(jié)合鑒定

以純化后的Pgp3重組蛋白為抗原進(jìn)行ELISA檢測(cè)血清效價(jià)（圖3A）。結(jié)果顯示，Pgp3重組蛋白可刺激家兔產(chǎn)生高水平的多克隆抗體，效價(jià)可達(dá)1:512 000，說明Pgp3重組蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性。采用Western blot檢測(cè)兔多克隆抗體與Pgp3重組蛋白的結(jié)合特異性，同時(shí)以his-tag單克隆抗體作為陽性對(duì)照。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的菌體總蛋白及純化蛋白經(jīng)兔多克隆抗體孵育后在28 kDa處出現(xiàn)一條特異性條帶（圖3C），與his-tag單克隆抗體孵育結(jié)果相同（圖3D）。而誘導(dǎo)前菌體總蛋白并無條帶出現(xiàn)。表明兔多克隆抗體可特異性識(shí)別Pgp3重組蛋白。

圖3 Pgp3兔多克隆抗體效價(jià)及特異性分析

2.4 多克隆抗體與Pgp3天然蛋白結(jié)合的特異性檢測(cè)

2.4.1 非變性Western blot法鑒定Pgp3兔多克隆抗體特異性 在相對(duì)分子質(zhì)量84 kDa處感染Ct的HeLa細(xì)胞及純化并復(fù)性的Pgp3重組蛋白可見一明顯條帶（紅色箭頭所示），未感染的HeLa細(xì)胞相應(yīng)位置處未見條帶（圖4）。這表明兔多克隆抗體可特異性識(shí)別具天然構(gòu)象的Pgp3蛋白三聚體。

圖4 兔多克隆抗體與Pgp3天然蛋白結(jié)合特異性的非變性SDS-PAGE及Western blot分析

2.4.2 間接細(xì)胞免疫熒光鑒定Pgp3兔多克隆抗體特異性 在普通光鏡下可觀察到感染后的HeLa細(xì)胞中出現(xiàn)致密的衣原體包涵體，在熒光視野下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)了體積較大的紅色熒光團(tuán)塊。Hoechst33342可以結(jié)合細(xì)胞核和包涵體內(nèi)的核酸進(jìn)而顯藍(lán)色，包涵體的藍(lán)色熒光和多克隆抗體的紅色熒光疊加為玫紅色熒光（圖5）。這表明Pgp3兔多克隆抗體能夠特異性識(shí)別感染后HeLa細(xì)胞中的Ct天然Pgp3蛋白。

圖5 間接免疫熒光鑒定Pgp3多克隆抗體的特異性（×400）

3 討論

Ct感染是目前最常見的性傳播性疾病之一[11]。由于Ct感染個(gè)體多為無癥狀感染者，患者往往不會(huì)主動(dòng)就醫(yī)，進(jìn)而無法有效的控制Ct感染。因此預(yù)防Ct性傳播性疾病最有效的方法之一為研制預(yù)防性疫苗[12]。幾乎所有Ct臨床分離株都含有高度保守的隱秘質(zhì)粒，編碼8種Pgp，即Pgp1～8，在Ct發(fā)病機(jī)制中起重要作用。各種Pgp功能不同，Pgp2、Pgp4和Pgp6是衣原體特異性蛋白，Pgp4和Pgp5是質(zhì)粒編碼基因和一些染色體基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[13-14]，Pgp8為維持質(zhì)粒所必需[15]。Pgp3是目前研究最深入的Pgp，它可以從衣原體中分泌出來形成衣原體包涵體，并在感染的晚期積累在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中[16]。Ct感染者血清抗體對(duì)Pgp3的識(shí)別主要依賴于它的三聚體結(jié)構(gòu)[6]，目前研究發(fā)現(xiàn)純化的Pgp3蛋白可以刺激巨噬細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因子，接種Pgp3疫苗可以保護(hù)機(jī)體免受衣原體的侵襲感染[17]，LI等[18-19]通過建立小鼠模型發(fā)現(xiàn)接種了Pgp3疫苗之后小鼠對(duì)Ct的抗感染能力增強(qiáng)，這些結(jié)果提示Pgp3是較強(qiáng)的免疫原性蛋白，可以作為疫苗抗原候選物。

研究[20]發(fā)現(xiàn)，Pgp3與Ct致病性密切相關(guān)，不僅在感染過程中促進(jìn)Ct生殖道上行感染、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)致輸卵管病變，且抑制感染細(xì)胞的凋亡[8]、促進(jìn)感染細(xì)胞自噬[21-22]、抵抗抗菌肽的殺衣原體效應(yīng)[23]等。雖然Pgp3蛋白是Ct致病過程中的重要毒力因子，但目前尚無其特異性單克隆抗體上市，全球Ct研究實(shí)驗(yàn)室依賴各自制備的多克隆抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)重制約了該蛋白分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的研究進(jìn)展。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功誘導(dǎo)表達(dá)并純化了Pgp3重組蛋白，免疫家兔后獲得了高水平的Pgp3兔多克隆抗體，效價(jià)可達(dá)1:512 000，Western blot結(jié)果顯示該多克隆抗體可以和Pgp3重組蛋白特異性結(jié)合。由于Pgp3三聚體化為抗體識(shí)別Pgp3所必需，為了進(jìn)一步檢測(cè)Pgp3兔多克隆抗體和天然Pgp3蛋白的特異性結(jié)合能力，本研究經(jīng)Native-PAGE分離天然Pgp3蛋白及感染Ct的HeLa細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示本研究制備的多克隆抗體可以特異性結(jié)合天然Pgp3蛋白三聚體。此外用E型Ct標(biāo)準(zhǔn)株感染HeLa細(xì)胞，在感染48 h后在光鏡下可看到胞內(nèi)致密Ct包涵體，這一結(jié)果說明Ct感染HeLa細(xì)胞模型建立成功。最后用免疫熒光法檢測(cè)Pgp3兔多克隆抗體對(duì)天然Pgp3蛋白的特異性結(jié)合能力，結(jié)果顯示，感染細(xì)胞的包涵體和胞質(zhì)中均出現(xiàn)了玫紅色熒光團(tuán)塊，這說明本研究制備的多克隆抗體可以特異性結(jié)合天然Pgp3蛋白。

免疫家兔制備的多克隆抗體相比單克隆抗體而言，具有制備過程簡(jiǎn)單、作用全面、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。除此之外，多克隆抗體可以識(shí)別多個(gè)抗原表位、對(duì)靶蛋白抗原的親和力較高、檢測(cè)結(jié)果更為穩(wěn)定，這些優(yōu)點(diǎn)使多克隆抗體廣泛地應(yīng)用于生物研究領(lǐng) 域[24]。國內(nèi)學(xué)者孔杰等[25]和賈曉輝等[26]分別采用家兔免疫和雜交瘤技術(shù)成功制備了Pgp3多克隆抗體及單克隆抗體，但他們均未檢測(cè)上述抗體與天然構(gòu)象Pgp3蛋白的結(jié)合特異性，而本研究分別采用了細(xì)胞免疫熒光和非變性Western blot驗(yàn)證了兔血清多克隆抗體和天然Pgp3的特異性結(jié)合能力。

綜上所述，本研究制備的Pgp3多克隆抗體效價(jià)高，能特異性識(shí)別重組及天然Pgp3蛋白，親和力和特異性較強(qiáng)，可用于Western blot和免疫熒光定位等實(shí)驗(yàn)，并為Pgp3蛋白功能的研究、單克隆抗體的制備及衣原體免疫制劑的研發(fā)等奠定基礎(chǔ)。