漢黃芩素通過調控miR-451/PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號通路改善低氧誘導的肺動脈高壓

吳佩亮，王良興，黃曉穎

溫州醫科大學附屬第一醫院 呼吸與危重癥醫學科，浙江 溫州 325015

肺動脈高壓（pulmonary hypertension, PH）是一種危及生命的心肺疾病，其特征是血管阻力升高，最終導致進行性右心室衰竭[1]。流行病學研究表明，PH患者的臨床預后較差。如果不進行治療，許多PH和右心室衰竭的患者會死亡[2]。因此，早期診斷、早期干預和預后評估對提高PH患者的生存率、預后和精準治療具有重要意義。

漢黃芩素（5, 7-二羥基-8-甲氧基黃酮, wogonin） 是黃芩根中一種主要的黃酮類成分。研究表明，在卵清蛋白（ovalbumin, OVA）暴露的過敏性哮喘炎癥小鼠模型中，漢黃芩素通過促進嗜酸性粒細胞凋亡進而減輕氣道炎癥[3-4]。然而，漢黃芩素對PH的潛在作用鮮有報道。課題組前期研究發現經外源性中藥單體黃芩苷干預后小鼠肺組織中磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phosphorylation phosphatidylinositol-3-kinases, p-PI3K）、磷酸化蛋白質絲氨酸-蘇氨酸激酶（phosphorylation protein-serine-threonine kinase, p-AKT）的表達水平顯著下降，小鼠的右心室壓力（right ventricular systolic pressure,RVSP）顯著下降，肺血管壁增厚減輕，進而緩解PH。鑒于黃芩苷與漢黃芩素都屬于黃芩的黃酮類成分，兩者都具有抗炎、抗氧化、抗纖維化和抗增殖作用，存在一定相似性，故我們推測PI3K/AKT可能作為一個關鍵通路參與漢黃芩素抑制PH肺血管重建過程。此外，在多種腫瘤細胞中維甲酸X受體A（retinoid X receptor alpha, RXRA）依賴N端切割形式tRXRA發揮促癌作用，其致病機制主要包括PI3K/AKT、NFκB等信號通路[5-6]。然而，RXRA在PH中的作用仍不清楚。本研究旨在闡明漢黃芩素是否通過miR-451抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號通路對低氧誘導的PH（HPH）發生發展中的保護作用，為PH的臨床防治開辟新的思路和理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物來源、分組和給藥方案

由溫州醫科大學實驗動物中心提供18只野生型C57BL/6小鼠，許可證號：SYXK（浙）2021-0020，雄 性，10～14周齡，體質量18～25 g。將小鼠隨機分為3組，每組6只，分別為常氧對照（N）組、低氧（H+Saline）組、低氧+漢黃芩素（H+w）組。將N組小鼠飼養在常壓常氧（21% O2）SPF環境中，H+Saline組及H+w組小鼠飼養在低氧（O2濃度維持在9%～11%）實驗艙內21 d，每日造模24 h。H+w組小鼠在造模前，每日腹腔注射5 mg/kg漢黃芩素。漢黃芩素、740Y-P購于美國MedChemExpress公司。本研究實驗方案經溫州醫科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 細胞來源、分組和給藥方案

小鼠肺動脈平滑肌細胞（murine pulmonary artery smooth muscle cells, MPASMCs）購自ATCC，分為常氧（N）組、低氧（H+PBS）組、低氧+低劑量漢黃芩素（H+40 μmol/L w）組、低氧+高劑量漢黃芩素（H+80 μmol/L w）組，低氧+高劑量漢黃芩素（H+ 80 μmol/L w）+740Y-P（20 μg/mL）組[7]。N組在常氧（5% CO2，21% O2，74% N2，37 ℃）環境中培養48 h， H+PBS組、H+40 μmol/L w組、H+80 μmol/L w組和H+80 μmol/L w+740Y-P組在低氧（5% CO2，3% O2，92% N2，37 ℃）環境中培養48 h。

1.3 方法

1.3.1 RVSP、左頸總動脈壓力（mean carotid arterial pressure, mCAP）測定 對C57BL/6小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液（0.05 mL/10 g）進行麻醉，將小鼠固定在小動物手術臺上，經手術器械鈍性解剖，定位并分離右側頸外靜脈2 cm以及左頸總動脈1 cm，Powerlab生理信號系統記錄測量小鼠血流動力學：RVSP和mCAP。

1.3.2 肺動脈重構指標檢測 解剖分離小鼠右肺中葉，將組織浸泡在4%多聚甲醛中固定48 h，固定好的組織標本進行石蠟包埋，3～5 μm厚切片，常規梯度脫蠟，在25 ℃下進行HE染色3 min，應用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件分析肺動脈重構指標：肺小動脈管壁直徑（wall thickness, WT）和管總直徑（total thickness, TT）、肺小動脈管壁面積（wall area, WA）和管總面積（total area, TA）。

1.3.3 RT-qPCR 細胞內總RNA的抽提采用TRIzol提取試劑盒，使用高容量cDNA反轉錄試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行cDNA合成。隨后RT-qPCR采用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（美國Applied Biosystems公司）進行。使用GAPDH對表達值進行標準化，并通過2-ΔΔCt方法進行量化。引物序列如下：巨噬細胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）F 5’-TCCTGACTTACCAGCTCATGT-3’，R 5’-CCAAGATCGC TAGACTGGGC-3’；CAB39 F 5’-TGAACCTGCTGCGAGACAAA A-3’，R 5’-TGCGTCTTGTTAGGATTGGCTA-3’；GAPDH F 5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’，R 5’-AAGTGGTCGTTGAGG GCAATG-3’；miR-451 F 5’-GCGGCGCAAAGAATTCTCCT-3’，R 5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；miR-451 inhibitor 5’-AACTCAGTAATGGTAACGGTTT-3’。

1.3.4 細胞增殖實驗 應用CCK-8、EdU及集落形成檢測評估細胞增殖能力。CCK-8實驗：將MPASMCs接種于96孔板中，細胞密度為5×103/孔，培養24 h，將10 μL CCK-8溶液（美國MedChemExpress公司）加入48孔板中，在37 ℃下培養4 h。最后，每個孔在酶標儀450 nm波長下測OD值。EdU檢測：滴入適量工作液在細胞爬片上，在孵箱中常規培養24 h。采用4%多聚甲醛固定細胞片，用EdU試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）進行染色，最后用熒光顯微鏡（日本Olympus公司）觀察EdU染色圖像并采集，隨后統計EdU陽性細胞數。集落形成實驗：將細胞按每孔750個細胞接種到12孔板上進行培養，14 d后加入多聚甲醛進行細胞固定并加入結晶紫進行染色，計算細胞集落個數。

1.3.5 傷口愈合/劃痕實驗 將MPASMCs接種于6孔培養板，待MPASMCs生長匯合度達到80%時，用200 μL槍頭在MPASMCs內劃一垂線，用PBS沖洗劃下的MPASMCs，加入無血清培養基[8]。

1.3.6 Western blot 利用蛋白裂解緩沖液RIPA（美國Thermo Fisher Scientific公司）提取肺組織和細胞總蛋白，采用BCA法（美國Pierce公司）測定各個樣本的蛋白濃度，提取的蛋白進行10% SDS/PAGE電泳，電轉移到PVDF膜上，在Western blot快速封閉液中封閉。應用cyclin B1、p-PI3K、p-AKT、PCNA、RXRA、Bcl-2、Ki-67、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP）-2和MMP-7（抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司）進行一抗孵育，在4 ℃冰箱內放置過夜，用TBS-T在室溫下搖晃洗滌膜3次，每次持續10 min。室溫下加入HRP二抗抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）孵育后化學發光成像儀顯影，以GAPDH作為內對照。

1.3.7 網絡藥理學分析 通過中藥系統藥理學數據庫（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology, TCMSP）篩選漢黃芩素關鍵活性成分，按照生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%、類藥性（drug-likeness, DL）≥0.18的篩選條件進行靶分子篩選；STRING數據庫（https://string-db.org/）是預測和構建“蛋白-蛋白”相互作用網絡的數據庫[9]，將漢黃芩素和PH共同作用的基因通過STRING數據庫構建“蛋白-蛋白”相互作用網絡。

1.4 統計學處理方法

2 結果

2.1 黃芩調控PH的下游效應分子的網絡藥理學預測及篩選

基于網絡藥理學篩選黃芩調控PH的下游效應分子，見圖1A。通過TCMSP數據庫篩選黃芩關鍵活性成分，按照OB≥30%、DL≥0.18的篩選條件，共篩選出36種關鍵活性成分，獲得關鍵活性成分作用的靶點共96個。從GeneCards和OMIM數據庫共收集了3 762個PH相關基因。最后，將黃芩活性成分作用的靶點96個和3 762個PH相關基因進行匯集，生成85個兩者共同作用的基因，見圖1B。隨后將黃芩和PH共同作用的基因通過STRING數據庫構建“蛋白-蛋白”相互作用網絡，并由Cytoscape軟件將“PH-基因-靶標-黃芩”網絡進行可視化，篩選出“PH-基因-靶標-黃芩”網絡中排名前5的黃芩重要的活性成分，分別為：漢黃芩素（wogonin），黃芩素 （baicalein），β-谷甾醇（beta-sitosterol），豆甾醇（stigmasterol），木蝴蝶素A（oroxylin A），見圖1C。根據網絡預測的結果，選取了漢黃芩素作為主要的活性成分進行下一步實驗驗證，并且構建了GO分子功能分類層次網絡、GO生物學過程分類層次網絡及通路富集分析下游通路進行預測，發現漢黃芩素可通過PI3K/AKT、IL-17信號通路、凋亡信號通路、TNF信號通路、p53信號通路等調節PH的進程，見圖1D-F。

圖1 漢黃芩素作用于HPH的下游靶點通路篩選及預測

2.2 漢黃芩素抑制低氧誘導的MPASMCs增殖和遷移

與N組比，H+PBS組MPASMCs細胞的相對細胞活力、EdU陽性細胞率、細胞集落形成數顯著增加（P＜0.05）；與H+PBS組比，H+40 μmol/L w組和H+ 80 μmol/L w組MPASMCs細胞的相對細胞活力、EdU陽性細胞率、細胞集落形成數顯著減少，其中H+ 80 μmol/L w組較H+40 μmol/L w組對MPASMCs細胞增殖能力的抑制作用更為明顯（P＜0.05），見圖2AC。與N組比，H+PBS組MPASMCs中增殖相關蛋白的表達水平均顯著增加（P＜0.05）；與H+PBS組比，H+ 40 μmol/L w組和H+80 μmol/L w組MPASMCs中增殖相關蛋白的表達水平均顯著下降（P＜0.05），見圖2D。與N組比，H+PBS組MPASMCs細胞的相對細胞侵襲數、相對遷移距離顯著增加（P＜0.05）；與H+PBS組比，H+40 μmol/L w組和H+80 μmol/L w組MPASMCs細胞的相對細胞侵襲數、相對遷移距離顯著下降（P＜0.05），其中H+80 μmol/L w組較H+ 40 μmol/L w組對MPASMCs細胞遷移能力的抑制作用更為明顯（P＜0.05），見圖2E、圖2G。與H+PBS組比，H+40 μmol/L w組和H+80 μmol/L w組MPASMCs中細胞遷移相關蛋白的表達水平均顯著下降（P＜0.05），見圖2F。

圖2 漢黃芩素抑制低氧誘導的MPASMCs增殖和遷移

2.3 漢黃芩素對肺小動脈重構、RVSP、mCAP的影響

H+Saline組小鼠WA/TA、WT/TT和RVSP與N組比顯著升高（P＜0.05）；與H+Saline組比，H+w組WA/TA、WT/TT和RVSP顯著下降（P＜0.01）；mCAP在N組、H+Saline組和H+w組3組間差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 漢黃芩素對小鼠肺小動脈重構以及血流動力學的影響

2.4 漢黃芩素能夠抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2通路激活

與N組比，H+PBS組MPASMCs中p-PI3K、p-AKT、RXRA及Bcl-2蛋白表達顯著增加（P＜0.05）；與H+PBS組比，H+40 μmol/L w組和H+80 μmol/L w組MPASMCs中p-PI3K、p-AKT、RXRA及Bcl-2蛋白表達顯著下降（P＜0.05），見圖4A。與N組比，H+Saline組小鼠肺組織中p-PI3K、p-AKT、RXRA及Bcl-2表達明顯增加（P＜0.01）；與H+Saline組比，H+w組小鼠肺組織中p-PI3K、p-AKT、RXRA及Bcl-2蛋白表達表達顯著下降（P＜0.01），見圖4B。

圖4 漢黃芩素對PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號通路的影響

2.5 漢黃芩素調控PI3K/AKT/RXRA通路抑制MPASMCs增殖和遷移

與H+PBS組比，經740Y-P干預后，漢黃芩素對p-PI3K、p-AKT、RXRA及Bcl-2蛋白表達抑制效應被顯著削弱（P＜0.05），見圖5A；與H+PBS組比，H+ 80 μmol/L w組細胞增殖能力顯著下降，經740Y-P干預后，740Y-P能夠部分逆轉漢黃芩素對MPASMCs增殖能力的抑制效應（P＜0.05），見圖5B-D。與H+PBS組比，H+80 μmol/L w組細胞遷移能力顯著下降，經740Y-P干預后，740Y-P能夠部分逆轉漢黃芩素對MPASMCs遷移能力的抑制效應（P＜0.05），見圖5E。

圖5 漢黃芩素抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號軸

2.6 漢黃芩素通過上調miR-451抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2通路激活

與N組比，miR-451在H+Saline組小鼠肺組織中表達水平顯著減少（P＜0.05）；與H+Saline組比，miR-451在H+W組小鼠肺組織中表達水平顯著增加（P＜0.05），見圖6A。與N組比，miR-451在H+PBS組MPASMCs中表達顯著減少（P＜0.01）；與H+PBS組比，miR-451在H+40 μmol/L w組和H+80 μmol/L w組MPASMCs中表達水平顯著增加（P＜0.05），見圖6B。與N組比，H+PBS組MPASMCs中CAB39和MIF表達水平顯著上升（P＜0.01）；與H+PBS組比，H+40 μmol/L w組和H+80 μmol/L w組MPASMCs中CAB39和MIF表達水平顯著下降（P＜0.05），見圖6C-E。miR-451 inhibitor干預能夠部分逆轉漢黃芩素對MPASMCs增殖和遷移能力的抑制效應（P＜0.05），見圖6F、圖6G。表明漢黃芩素通過上調miR-451靶向調控CAB39和MIF，繼而抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號通路激活，調控PH進展，見圖6H。

圖6 漢黃芩素通過上調miR-451抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號軸參與PH進展

3 討論

PH是一種影響肺小動脈嚴重的疾病。盡管PH的確切病理生理學仍不清楚，但最近的進展使人們更好地了解了肺血管重塑的細胞和分子驅動因素，包括內皮細胞功能障礙、平滑肌細胞異常、炎癥和免疫系統失調以及受體和配體的不平衡[10]。PH發生的關鍵性標志是肺動脈細胞功能障礙以及小動脈重塑，由于血管平滑肌細胞不受控制的增殖、細胞骨架瓦解和去分化，導致血管中膜增厚和管腔閉 塞[11]。PH中肺動脈表型的形成有多種過程，包括遺傳因素、DNA損傷、miRNA、性激素、氧化應激和細胞代謝改變[12]。在臨床上，內皮素途徑、前列環素途徑和一氧化氮/可溶性鳥苷酸環化酶途徑[13]的多種靶向藥已被批準用于治療PH。雖然這些藥物能夠改善患者的臨床癥狀，但不能逆轉疾病的進展。因此，研究PH的發生發展機制，探索新型有效的治療方案，對于改善PH的臨床預后十分重要。

我國藥用植物資源豐富，從天然草藥中開發出更有效、更安全的防治PH的藥物具有得天獨厚的優勢。黃芩始載于《神農本草經》，為唇形科多年生草本植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根[14]，是中國傳統醫學的50種基本草藥之一，作為一種具有很高藥用價值和廣泛功效的傳統中藥，目前被認為是治療如炎癥、發熱、動脈粥樣硬化、過敏和排尿困難的強有力的藥用植物[15]。既往的研究表明，黃芩提取物及其生物活性成分具有廣泛的藥理活性，包括抗炎[16]、抗氧化[17]、抗 菌[18]、神經保護[19]、抗腫瘤[20]。與單體或化學藥通常作用于單一靶點不同，黃芩的有效成分群是如何作用于體內靶點群，從而發揮整合調節作用尚不清楚。本研究基于網絡藥理學方法成功構建了黃芩作用于HPH的體內反應網絡系統，并成功篩選出黃芩最主要的活性成分之一漢黃芩素，同時預測到PI3K/AKT/RXRA是漢黃芩素調控PH進展的潛在信號通路。因此，本研究在體外實驗證實漢黃芩素可顯著抑制MPASMCs的增殖能力，同時漢黃芩素還能夠顯著抑制MPASMCs的遷移和侵襲能力，初步證實了網絡藥理學的預測結果。在動物模型上，低氧組小鼠RVSP顯著升高，表明成功構建了HPH小鼠模型，經過漢黃芩素干預后本研究結果表明漢黃芩素能夠顯著改善肺小動脈的重構以及降低RVSP，進而緩解PH。上述體內外實驗表明漢黃芩素能夠緩解HPH的發生發展。

基于網路藥理學篩選預測結果，本研究為了進一步闡明了漢黃芩素發揮其作用的潛在機制，選擇PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號通路進行驗證。PI3K/AKT是細胞內重要的信號轉導通路，參與調控多種細胞功能，如增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運[21]。研究發現，激活PI3K/AKT信號通路能夠促進PASMCs的增殖，下調PI3K/AKT能抑制PASMCs的增殖，促進其凋亡，改善低氧誘導的肺血管結構重建，從而緩解PH[22]。本研究體內外實驗結果提示漢黃芩素能夠顯著抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號通路的活化，表明PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號通路是漢黃芩素調控PH進展的潛在下游效應通路。

miRNA在體內表達豐富，miRNA對細胞增殖、遷移、侵襲、分化和凋亡等多種細胞過程發揮著關鍵的調控作用[23-24]。研究發現慢性缺氧小鼠模型和PH患者血漿中存在miR-451表達下降，上調miR-451可改善血流動力學和血管重塑，從而減輕PH的發 展[25-26]，與本研究的結果一致。另有研究發現miR-451能夠靶向調控PI3K/AKT通路[27]。基于此，我們推測漢黃芩素可能通過調控miR-451影響PI3K/AKT信號通路。另有研究表明CAB39和MIF是miR-451的直接靶蛋白并且介導了miR-451對PI3K/AKT信號通路的調控作用[27-28]，本研究發現缺氧誘導的MPASMCs細胞中CAB39和MIF表達上調，漢黃芩素能夠顯著抑制CAB39和MIF的表達水平。表明漢黃芩素可能通過上調miR-451靶向調控CAB39和MIF，繼而抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號通路激活。

綜上所述，本研究結果證實漢黃芩素能夠改善HPH小鼠右心室壓力和肺動脈結構重塑，抑制低氧誘導的MPASMCs的增殖和遷移。進一步探究其作用機制發現漢黃芩素通過上調miR-451的表達靶向調控CAB39和MIF進而抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號通路，最終緩解PH的進展。