LncRNA SNHG1在同型半胱氨酸致足細胞焦亡中的作用

張正皓 馬芳 張晴 夏童童 劉虹麟，3 白志剛，4 盧冠軍，5 張競文 彭紅建，6 姜怡鄧 馬勝超，3

寧夏醫科大學1基礎醫學院，3檢驗學院 （銀川 750004）；2國家衛生健康委員會代謝性心血管疾病研究重點實驗室 （銀川 750004）；4寧夏回族自治區人民醫院 （銀川 750004）；5寧夏醫科大學總醫院 （銀川 750004）；6中南大學化學化工學院 （長沙 410083）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）作為慢性腎臟疾病患者心血管疾病的獨立危險因素，由蛋氨酸和半胱氨酸共同代謝形成。腎臟是Hcy重要代謝場所之一，當血清中Hcy含量超過15 μmol/L即可診斷為高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocyste?inemia，HHcy）。HHcy引起腎小球受損和腎臟功能下降進而導致慢性腎炎、慢性腎功能不全等腎病綜合征［1］，終末期腎臟疾病患者中HHcy的發病率高達85%［2］。足細胞是腎小球濾過膜的主要組成部分，其功能是維持體內水、電解質和代謝物的穩態，足細胞的功能障礙或損傷是腎小球疾病的主要病理基礎之一［3］。足細胞焦亡將導致足細胞數量減少，裂孔膜破壞、足突融合和蛋白尿產生，最終引起腎損傷，但是其作用機制還尚未清楚。有研究［4］顯示Hcy水平升高可導致足細胞的損傷，致使其功能障礙，但Hcy能否引起足細胞發生焦亡及其作用機制目前尚未闡明。因此，深入探究足細胞發生焦亡的作用機制，將對未來防治腎臟疾病的發生發展有重要意義。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，ln?cRNA）作為轉錄因子和染色體的修飾因子，通常與DNA、RNA和蛋白質相互作用調節基因表達和表觀遺傳學修飾。lncRNA細胞功能多樣，如調節細胞周期、細胞分化、細胞焦亡、信號傳遞等多個方面。核仁小RNA宿主基因1（small nucleolar RNA host gene1，SNHG1），在人類基因組中位于11q12.3位置，在多種疾病發生過程中扮演重要角色。CUI 等［5］研究發現，過表達lncSNHG1能夠有效抑制miR-101-3p的表達水平，激活下游Wnt/β-catenin信號轉導通路，從而影響非小細胞肺癌的的發生發展；此外，腎癌組織中lncSNHG1呈高表達，lnc?SNHG1敲除后能夠抑制腎癌增殖、侵襲和上皮間質轉化（EMT）的作用也被相繼報道［6］。然而關于lncSNHG1在Hcy誘導足細胞焦亡的作用機制尚未報道。因此，本研究觀察和分析lncSNHG1的表達及其對足細胞焦亡的作用，探討lncSNHG1在Hcy誘導足細胞發生焦亡中的具體作用，將為Hcy引起的腎損傷提供潛在靶向預防和治療新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑及儀器細胞株：小鼠腎小球細胞株（MPC-5）由寧夏醫科大學病理生理學系惠贈；同型半胱氨酸（美國，Sigma）；胎牛血清、DMEM高糖培養基（美國，Gibco）；青鏈霉素、胰蛋白酶消化液（北京，索萊寶）；超凈工作臺（蘇州，安泰空氣技術）；細胞恒溫培養箱（德國，Heraeus）；5415D微型離心機（德國，Eppendorf）；總蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液（江蘇，凱基生物）；總RNA提取試劑盒（北京，天根生化）；逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒（日本，TaKaRa）；小鼠GAPDH內參引物及lncSNGH1上下游引物（上海，生工生物工程）；實時熒光定量分析儀（德國，耶拿）；激光共聚焦顯微鏡（德國，ZEISS）；電泳儀、電轉儀及凝膠成像儀（美國，Bio-Rad）；熒光顯微鏡（日本，Olympus）；酶標儀（美國，BioTek）；ELISA IL-1β、IL-18炎癥因子試劑盒（上海，科艾博生物）；Caspase-1、Cleaved Caspase-1、NLRP3抗體（美國，Cell Signaling Technology）、GSDMD、GSDMDN抗體（江蘇，Affinity）；辣根過氧化物酶（HRP）、熒光羊抗兔二抗（北京，博奧森）；β-actin抗體（武漢，愛博泰克）。

1.1.2 實驗動物SPF級18只雄性雜合子Cbs+/-小鼠購自美國Jackson實驗室，體質量25～30 g，8周齡，合格證號：SCXK（京）2016-0006，小鼠飼養于寧夏醫科大學動物實驗中心。

1.2 方法

1.2.1 動物及分組選取18只Cbs+/-小鼠隨機分成兩組（每組9只），設置正常飲食組（ND）和高蛋氨酸飲食組（HMD），正常飲食中加入2%蛋氨酸。晝夜節律12 h，室內環境溫度（25±2） ℃，相對濕度60%，每2天更換飼養籠1次，喂養8周后進行實驗。

1.2.2 細胞培養及分組足細胞采用DMEM（高糖）培養基（含10%胎牛血清、100U/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素）培養，條件：37 ℃、5% CO2。細胞密度達80%時，設置對照組（Control，0 μmol/L Hcy）和同型半胱氨酸干預組（Hcy，80 μmol/L Hcy），干預細胞48 h后，檢測焦亡相關指標。

1.2.3 細胞轉染及分組依照過表達慢病毒載體試劑盒說明書按步驟培養足細胞至對數生長期，細胞密度達40%時進行轉染。設置對照組（Con?trol）、lncSNHG1過表達陰性對照組（OE-NC）和lnc?SNHG1過表達組（OE-SNHG1）；轉染后同型半胱氨酸干預細胞，設置lncSNHG1過表達陰性對照+同型半胱氨酸干預組（OE-NC+Hcy）和lncSNHG1過表達+同型半胱氨酸干預組（OE-SNHG1+Hcy）。干預細胞48 h后進行后續實驗。

1.2.4 過表達慢病毒載體構建效果鑒定lncSNHG1過表達慢病毒轉染至足細胞72 h后，通過熒光顯微鏡下觀察足細胞綠色熒光情況；qRT-PCR法檢測足細胞中lncSNHG1表達水平。

1.2.5 qRT?PCR法檢測lncRNA SNHG1表達水平依據RNA提取試劑盒說明書分別提取各組細胞總RNA，取2 μg總RNA為模板逆轉錄成cDNA，進行qRT-PCR檢測。Gene Bank數據庫查詢lncSNHG1基因序列并設計引物（上海，生工生物工程）合成。lncSNHG1引物序列Forward；5′-TCCTT?GTTCGGGGTTTGAGG-3′，Reverse：5′-ACAGCACCCTGACTACAAGC-3。GADPH引物序列Forward；5′-ACCCAGAAGACTGTGGAGG-3′，Reverse：5′-TTCTAGACGGCAGGTCAGGT-3′。逆轉錄反應體系：PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1.0 μL、RT Primer Mix×4 1.0 μL、5× PrimeScriptBuffer2（For Real Time） 4.0 μL、RNase Free dH2O 4.0 μL；PCR反應體系：TBGreen 10 μL、上下游引物各0.8 μL、RNase Free dH2O 6.4 μL、逆轉錄產物2 μL；lnc SNHG1熒光定量PCR擴增條件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、57.8 ℃ 34 s，共35個循環。以小鼠GADPH內參基因為對照，目的基因相對量根據公式2-ΔΔCt分析lnc SNHG1的表達。公式如下：ΔΔCt=［Ct目的基因（對照組）-Ct內參基因（對照組）-］-［（Ct目的基因（實驗組）-Ct內參基因（實驗組）］，2-ΔΔCt表示的是目的基因表達量相對于對照組的變化倍數，實驗重復3次。

1.2.6 Western blot法檢測Caspase?1、Cleaved Caspase?1、NLRP3蛋白表達水平依據分組收取細胞，根據凱基蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白樣品濃度。上樣蛋白經SDS?PAGE凝膠電泳90 V 20 min，120 V 30 min濕轉2 h轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉的PBST封閉4 h，PBST洗膜10 min × 3次；依次加入Caspase-1、Cleaved Caspase-1、NLRP3特異性一抗（1∶1 000）4 ℃搖床孵育過夜；次日加入HRP標記的兔二抗（1∶5 000），室溫搖床孵育2 h，PBST洗膜10 min × 3次；ECL試劑盒發光顯色，凝膠成像儀進行成像分析。Image Lab軟件分析灰度值，以β-actin為內參對照，計算Caspase-1、Cleaved Caspase-1、NLRP3蛋白與β?actin內參灰度值的比值做定量分析。

1.2.7 ELISA法檢測白細胞介素IL?1β、IL?18含量依據分組處理細胞，設置標準品孔和樣本孔，各加不同濃度的標準品50 μL，樣品稀釋液40 μL及待測樣品10 μL；每孔加酶標試劑100 μL，空白孔除外；封板膜封板60 min；棄去液體，甩干，每孔加洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次；每孔加顯色劑37 ℃避光顯色15 min后加終止液50 μL；以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔吸光度（OD值）。

1.2.8 免疫熒光法檢測GSDMD、GSDMD?N表達足細胞密度達50%鋪皿，同型半胱氨酸干預細胞48 h后收皿，4%多聚甲醛固定細胞30 min，山羊血清封閉30 min，配置GSDMD、GSDMD-N特異性抗體（1∶200）4 ℃搖床孵育過夜，次日加入FITC熒光標記二抗避光孵育60 min，細胞核染色避光孵育5 min，使用激光共聚焦取視野拍照采取圖像。

1.3 統計學方法實驗數據應用SPSS 25.0軟件進行統計學分析，GraphPad Prism 8.0軟件進行制圖。結果采用（）表示，并滿足方差齊性。兩組間數據比較采用獨立樣本t檢驗；多組間數據比較采用單因素方差分析（One-way A NOVA）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高蛋氨酸小鼠腎臟組織中焦亡相關蛋白的表達水平Western blot檢測Cbs+/-小鼠腎臟組織中的焦亡相關蛋白表達水平。實驗結果顯示：與ND組相比較，HMD組中Caspase-1、Cleaved Caspase-1及NLRP3蛋白表達水平增高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1。

圖1 檢測ND、HMD組中的焦亡蛋白表達Fig.1 Detection of the expression of pyroptosis in ND and HMD groups

2.2 同型半胱氨酸對足細胞焦亡的影響Western blot和免疫熒光分別檢測了足細胞中焦亡蛋白表達水平，使用ELISA檢測焦亡介導的炎癥因子含量。Western blot實驗結果顯示：與Control組相比較，Hcy組中焦亡蛋白Caspase-1、Cleaved Caspase-1及NLRP3表達水平增高（P＜0.05，P＜0.01）；免疫熒光結果顯示：與Control組相比較，Hcy組中焦亡蛋白GSDMD、GSDMD-N表達水平增高；ELISA結果顯示：與Control組相比較，Hcy組中焦亡介導的炎癥因子IL-1β和IL-18的含量增高（P＜0.01）。見圖2。

2.3 同型半胱氨酸對lncRNA SNHG1表達水平的影響qRT?PCR法檢測了足細胞中lncSNHG1的表達水平，結果顯示：與Control組相比較，Hcy組中lncSNHG1的表達水平增高（P＜0.01）。見圖3。

圖3 LncSNHG1在Hcy干預的足細胞中高表達Fig.3 LncSNHG1 is High-expression in homocysteine intervention podium

2.4 過表達lncRNA SNHG1慢病毒載體構建為了探究過表達lncSNHG1慢病毒載體在足細胞中是否構建成功。通過鏡下觀察足細胞轉染的綠色熒光，qRT?PCR法檢測足細胞中lncSNHG1表達水平。結果顯示：慢病毒轉染至足細胞72 h后，可見較強綠色熒光，轉染效率＞80%；qRT?PCR法結果顯示：與Control組和OE-NC組相比較，OE-SNHG1組中lncSNHG1的表達水平增高（P＜0.01）。以上實驗結果提示慢病毒載體在足細胞中構建成功，可用于后續實驗。見圖4。

圖4 過表達慢病毒lncSNHG1載體構建結果Fig.4 Construction of lentivirus overexpressed lncSNHG1

2.5 過表達lncRNA SNHG1對同型半胱氨酸誘導的足細胞焦亡的影響Western blot和免疫熒光技術分別檢測了足細胞中的焦亡蛋白表達水平，使用ELISA檢測焦亡介導的炎癥因子含量。Western blot實驗結果顯示：與OE-NC+Hcy組相比較，OE-SNHG1+Hcy組中焦亡蛋白Caspase-1、Cleaved Caspase-1及NLRP3表達水平增高（P＜0.05，P＜0.01）；免疫熒光結果顯示：與OE-NC+Hcy組相比較，OE-SNHG1+Hcy組中焦亡蛋白GSDMD、GSDMD-N表達水平增高；ELISA結果顯示：與OENC+Hcy組相比較，OE-SNHG1+Hcy組中焦亡介導的炎癥因子IL-1β和IL-18的含量增高（P＜0.01）；見圖5。

圖5 檢測OE-NC+Hcy、OE-SNHG1+Hcy組中的焦亡相關指標的表達Fig.5 Detection of the expression of pyroptosis related indicators in OE-NC+Hcy and OE-SNHG1+Hcy groups

3 討論

慢性腎臟疾病（chronic kidney disease，CKD）指多種原因導致腎臟結構和功能發生異質性疾病的總稱。CKD主要特征是通過炎癥、纖維化和高濾過等過程損害腎小球、血管供應和腎小管間質。足細胞是腎小球有絲分裂后高度分化的上皮細胞，通過血漿蛋白和腎小球基底膜之間的支撐作用過濾血漿，在維持腎小球濾過屏障功能和結構方面發揮重要作用［7］。當足細胞損傷或功能發生障礙時會引起細胞內信號通路異常、基質增生和炎癥反應使腎小球濾過膜破壞，進而導致慢性腎臟疾病［8］。有文獻［9］報道，腎臟是Hcy代謝途徑之一，因此Hcy與慢性腎臟疾病發生發展密切關聯，所以Hcy可以作用于足細胞并引起腎小球結構損傷和功能障礙，但具體作用機制尚未明確。

細胞焦亡（pyroptosis）是近年來新發現的一種依賴Caspase蛋白，伴隨炎癥反應的特殊程序性細胞死亡。細胞焦亡通過清除病原體或產生炎性信號來保護機體，當細胞受到外界刺激或內源性信號的作用下，導致疾病的發生發展［10］。經典細胞焦亡信號通路，由活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）切割并激活成孔細胞通透性蛋白gasdermin-D在細胞膜上成孔、細胞腫脹、質膜破裂，繼而釋放炎性胞質內容物IL-1β、IL-18和其他物質，導致細胞膜破裂引起炎性反應［11-12］。實驗結果顯示，高蛋氨酸飲食小鼠腎臟組織焦亡相關蛋白表達增高；體外80 μmol/L Hcy干預足細胞48 h后Caspase-1、Cleaved Caspase-1、NLRP3和GSDMD、GSDMD-N表達增高，焦亡介導的炎癥因子IL-1β、IL-18含量增高。提示Hcy可以誘導足細胞發生焦亡進而引起足細胞損傷。但Hcy具體通過何種途徑誘導足細胞發生焦亡尚未明確。

長鏈非編碼RNA在人類疾病中已成為新的生物標記物和治療靶點，長鏈非編碼核仁小分子RNA宿主基因1在多種疾病組織中具有顯著特異性，廣泛參與人體生理調節、細胞增殖、凋亡和轉移等生物學過程，在調控疾病發生發展有著重要作用［13］。ZHANG等［14］研究發現，SNHG1通過抑制miR-195-5p的表達來促進肝臟癌細胞的增殖、侵襲和轉移。LEI等［15］在對骨關節炎的研究中證實，SNHG1可介導p38 MAPK-NF-κB信號通路減緩骨關節炎的代謝功能障礙與炎性狀態，并提出SNHG1可以緩解骨關節炎的進展。XU等［16］發現SNHG1基因敲除可抑制肌層浸潤性膀胱癌癌細胞的侵襲。另有研究者通過GEO數據庫的分析顯示，SNHG1在腎癌細胞系中呈現高表達，且與腎癌患者預后不良相關［17］。在本實驗中發現，Hcy誘導的足細胞lncSNHG1表達增高；過表達lnc?SNHG1后足細胞中Caspase-1、Cleaved Caspase-1、NLRP3和GSDMD、GSDMD-N表達增高，焦亡介導的炎癥因子IL-1β、IL-18含量增加。提示，在Hcy誘導足細胞發生焦亡過程中，過表達lncSNHG1可以進一步促進足細胞發生焦亡，進而加速腎臟損傷。

綜上所述，lncSNHG1在慢性腎臟疾病中介導的分子功能和細胞機制是復雜的，涉及多個因素。這些分子機制對泌尿生殖系統的臨床診斷、治療和預后有重要意義。本文首次探究了lncSNHG1在Hcy誘導的足細胞焦亡中的具體調控作用。提示lncSNHG1可作為慢性腎臟疾病的一種新型靶向標記，為進一步研究足細胞焦亡的具體作用機制提供了新的實驗依據。考慮本次實驗條件存在局限性，隨著基因組學技術的不斷發展，將在今后的實驗中進一步體內驗證lncSNHG1在HHcy致腎損傷中的作用，闡明足細胞焦亡引起腎功能障礙的分子機制，為進一步治療HHcy引起的腎損傷提供理論依據。