一例混合感染奶牛乳房炎病例病原菌分離鑒定及藥敏試驗

曹 芳，魏 勇，吳 憂，王晨豫，趙鵬飛，李智星， 任靜靜，齊亞銀

1 石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003

2 新疆天潤科技股份有限公司，新疆烏魯木齊 830063

0 引言

乳房炎是奶牛最重要且常見的疾病之一，會導致奶牛產奶量和牛奶品質下降，亦可導致機體免疫力下降。奶牛乳房炎主要癥狀為乳房實質、間質的炎癥，表現為紅、腫、熱、痛等。根據有無臨床癥狀，將奶牛乳房炎分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎[1]。研究發現，已有超過180 種病原菌會引起奶牛乳房炎[2，3]。奶牛乳房炎主要是由于鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和支原體所致，此外，環境性鏈球菌、腸球菌、沙門氏菌、綠膿桿菌等也可引起乳房炎[4，5]。

目前，抗生素治療乳房炎仍是最常見的手段，但廣泛長期使用致使很多病原菌產生耐藥性，有的甚至出現多重耐藥現象，不但對奶牛造成不可挽回的傷害，并且嚴重危及養殖業發展。

近年來，隨著新疆奶牛養殖業發展，乳房炎發病率逐年升高，規模化牧場奶牛乳房炎發病情況更突出，因此，針對典型臨床型奶牛乳房炎病例無菌采集奶樣，進行實驗室分離鑒定及藥敏試驗，為該牧場的奶牛乳房炎防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例來源及試驗地點

本研究樣品于2023年7月份取自新疆某規模化牧場典型患乳房炎奶牛奶樣，臨床診斷均在牧場進行，后期的實驗室檢測于石河子大學動物科技學院反芻動物重要疫病防控研究室進行。

1.2 試驗儀器設備

光學顯微鏡（光學顯微鏡）、恒溫培養箱（北京市永光明醫療儀器廠）、電泳儀（北京市六一儀器廠）、PCR擴增儀（Techne公司）、凝膠成像系統（Biorad公司）。

1.3 主要試劑

腦心浸出液肉湯（BHI）液體培養基，麥康凱瓊脂培養基，伊紅美藍瓊脂培養基，沙門、志賀菌屬瓊脂培養基（ss）瓊脂培養基，梭菌鑒別瓊脂培養基，厭氧培養基，甘露醇鹽瓊脂培養基，Baird-Parker瓊脂培養基，均購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司。藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.4 臨床診斷與采樣

對體細胞數超過50 萬個/mL的奶牛乳房組織進行視診及觸診，針對最典型癥狀的臨床型乳房炎奶牛，對乳頭消毒處理后，棄去采樣乳區的前3 把乳樣[6]，無菌采集7 mL左右奶牛乳液至15 mL無菌離心管中，4 ℃保存備用。

1.5 病原菌分離純化

將奶樣無菌接種于BHI液體培養基，置于37 ℃搖床過夜培養。涂片固定后進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察，初步確定相關病原菌。

將觀察到的相關菌液分別無菌劃線接種于伊紅美藍瓊脂培養基、ss瓊脂培養基、甘露醇鹽瓊脂培養基、梭菌鑒別瓊脂培養基，置37 ℃恒溫培養箱中培養24～48 h。挑取各鑒別平板上的典型單菌落接種于BHI液體培養基、厭氧培養基，置于37 ℃搖床過夜培養。分別將劃線接種于麥康凱瓊脂培養基、Baird-Parker瓊脂培養基、梭菌鑒別瓊脂培養基，37 ℃培養24～48 h。繼續挑取典型單菌落接種于BHI液體培養基（梭菌鑒別平板上的菌落接種于厭氧培養基），置于37 ℃全自動震蕩培養箱中過夜培養，分別鏡檢，觀察。

1.6 PCR鑒定

按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟，提取細菌總DNA，-80 ℃儲存備用。根據大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、梭菌[7]特異性引物進行PCR擴增，引物序列見表1，反應體系是25 μL：2×Taq Plus Master mix Ⅱ為10 μL，上下游引物各為0.5 μL，ddH2O為 12 μL，cDNA模板為2 μL。反應條件：95 ℃預變性，2 min；95 ℃變性，30 s，55 ℃退火 ，30 s，72 ℃延伸，50 s，30個循環；72 ℃終延伸，10 min。

表1 引物

PCR擴增反應完成后，進行凝膠電泳試驗，在凝膠成像系統儀下觀察，若出現與引物相應大小條帶則為目的條帶。

1.7 藥敏試驗

取營養肉湯增菌培養后的菌液，用移液槍吸取100 μL均勻涂抹到整個營養瓊脂培養基[8]，貼藥敏紙片，37 ℃倒置培養24～48 h，判定結果參照美國臨床實驗室國家標準化管理委員會標準（CLSI2008）[9]。

2 結果

2.1 臨床診斷結果

視診觀察發現患乳房炎奶牛乳房明顯紅腫；觸診發現乳房硬脹，并且發熱（圖1）。

圖1 患乳房炎奶牛乳房局部照片

2.2 病原菌分離純化結果

通過革蘭氏染色鏡檢，初步觀察到3 類病原菌：①革蘭氏陰性短桿狀，單個或成對病原菌。②革蘭氏陽性粗大且兩端鈍圓的桿菌。③革蘭氏陽性呈葡萄狀的球菌（圖2a、2b）。

圖2 初步鏡檢結果

將觀察到的病原菌接種于鑒別培養基后，麥康凱瓊脂培養基長出圓形、金屬紅色光澤菌落（圖3a）；伊紅美藍瓊脂培養基長出紫黑色，并帶有綠色金屬光澤菌落（圖3b）；甘露醇鹽瓊脂培養基長出黃色菌落且菌落周圍也為黃色（圖3c）；Baird-Parker瓊脂培養基長出黑色菌落（圖3d）；梭菌鑒別瓊脂培養基長出黑色菌落（圖3e）。

圖3 接種于鑒別培養基后的鏡檢結果

鑒定后判定上述革蘭氏陰性桿菌為大腸桿菌，革蘭氏陽性球菌為金黃色葡萄球菌，革蘭氏陽性桿菌為梭菌，見圖4a、4b、4c。

圖4 病原菌鑒定后的鏡檢結果

2.3 PCR鑒定結果

PCR擴增結果如圖5a、5b、5c所示，可分別觀察到287 bp（大腸桿菌）、196 bp（金黃色葡萄球菌）、478 bp（梭菌）條帶，大小與預期符合。

圖5 PCR鑒定結果

2.4 藥敏試驗結果

由表2可知，大腸桿菌對復方新諾明、卡那霉素、恩諾沙星、環丙沙星高度敏感，其中環丙沙星極度敏感；金黃色葡萄球菌對復方新諾明、卡那霉素、恩諾沙星、氯霉素極度敏感；梭菌對氯霉素、頭孢曲松、氨芐西林高度敏感。分離得到3 種細菌均出現多重耐藥現象。

表2 藥敏試驗結果

3 討論

對該規模化牧場典型乳房炎病例進行采樣鑒定后，發現奶牛乳房炎多由于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、梭菌感染所致。與新疆地區常見奶牛乳房炎分離到的病原類型一致[10，11]，并且不同細菌呈現不同耐藥情況，建議該牧場對患病牛采取隔離措施，并配合使用替米考星、頭孢噻呋鈉、及梭菌疫苗進行聯合用藥治療。

乳房炎為奶牛養殖業臨床常見疾病，主要由于病原體感染所致。新疆地區長期干燥，晝夜溫差較大，奶牛更易發生乳房炎。因此，該地區通常采取“預防為主，治療為輔”的防治措施。在預防方面，定期檢測乳房健康狀況，保持圈舍環境衛生及奶牛體表清潔，保證擠奶衛生，堅持乳頭藥浴，還應加強干奶期隱性乳房炎防治，對于已患乳房炎奶牛，應根據不同病因采取措施，合理用藥。

在治療方面，雖然抗生素對奶牛乳房炎治療至關重要，但隨著大量長期不合理的使用，出現大量耐藥菌株，且耐藥性越來越高，這提示養殖戶應合理使用抗生素，平時在奶牛及牛舍消毒衛生管理方面多下功夫，以達到良好預防疾病效果。

4 結論

本研究通過對該牧場乳房炎奶樣進行病原菌分離鑒定發現，該牧場奶牛乳房炎是由大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及梭菌混合感染所致。藥敏試驗顯示，3 種菌對多種抗生素產生了不同的耐藥效果，其中大腸桿菌及金黃色葡萄球菌對復方新諾明、恩諾沙星、氯霉素相對敏感。建議該牧場對患病牛采取隔離措施，并配合使用替米考星、頭孢噻呋鈉、及梭菌疫苗進行聯合用藥治療，以期達到良好的治療效果。