酶聯免疫吸附和膠體金技術對黃曲霉毒素M1檢測的結合驗證

喬 寬，王路陽，王艷飛，張云鮮，時長旭

蒙牛乳業（焦作）有限公司，河南焦作 454100

0 引言

黃曲霉毒素（AFT）是黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產生的雙呋喃環類毒素。其衍生物有約20 種，分別命名為B1、B2、G1、G2、M1、M2、GM、P1、Q1、毒醇等。其中B1的毒性最大，致癌性最強。動物食用黃曲霉毒素污染的飼料后，在肝臟、腎臟、肌肉、血液、乳汁及蛋品中可測出極微量毒素[1]。黃曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）是動物攝入黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）后在體內經羥基化形成的代謝產物，毒性僅次于AFB1，WHO將其列為ⅡB類致癌物。AFM1主要存在于動物的乳汁、腎臟、肝臟、蛋、肉和尿中，以乳中最常見。牛乳及其制品是易受黃曲霉毒素污染的食品之一[2，3]。若把發霉谷物作為飼料飼喂動物，其中的黃曲霉毒素在24 h之后就能進入乳中。黃曲霉毒素被動物食用后，一部分會蓄積在體內，另外一部分會轉化到乳汁和尿液中，轉化率一般為3.45%～11.39%，排出AFM1的量為AFB1攝入量的1%～3%。黃曲霉毒素M1進入人或動物體內后，除抑制DNA、RNA合成外，也抑制肝臟蛋白質合成，導致人體中毒。其危害主要表現在3 個方面：一是損害組織器官；二是致癌、致畸、致突變，引發動物及人類的肝癌、腎癌和胃癌等；三是抑制免疫機能。其毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68 倍，主要危害部位是肝臟。我國規定生牛乳中黃曲霉毒素M1含量不得超過0.5 μg/kg[4]。近年來，由于國內外乳品安全問題，作為乳品中廣泛存在的一類劇毒物——黃曲霉毒素越發引起關注。黃曲霉毒素具有強烈致癌性、致畸性及誘變性，已被證實可對人和動物健康造成極大傷害，牛乳中以其代謝產物黃曲霉毒素M1最常見。

本文闡述牛乳中黃曲霉毒素M1的來源與危害，并重點介紹2 種檢測方法的對比分析。當前，我國檢測機構針對生牛乳中AFM1檢測設備有很多種，涉及檢測原理主要有同位素稀釋液相色譜—串聯質譜法、高效液相色譜法、酶聯免疫吸附篩查法、膠體金法等。在AFM1檢測中根據不同需求，選擇不同設備和方法檢測，對檢測效率至關重要，因此，本文通過試驗對酶聯免疫吸附篩查法、膠體金法對生牛乳中AFM1的進行對比分析，旨在為乳品企業選擇牛乳中AFM1檢測方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

酶標儀ELx800，美國伯騰儀器有限公司生產；膠體金讀數儀OTplus-Ⅱ，北京陸橋技術股份有限公司生產；ME204E/02電子天平，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司生產；高速冷凍離心機Neofuge15R，上海力申科學儀器有限公司生產；振蕩器MS3 basic，德國IKA Works GmbH & Co.KG生產；保鮮柜LSC-600K，浙江星星冷鏈集成股份有限公司生產；黃曲霉毒素M1靈敏檢測試劑盒，丹麥普格生物技術股份有限公司生產；黃曲霉毒素M1金標快速檢測條，北京陸橋技術股份有限公司生產；去離子水。

1.2 樣品前處理

1.2.1 酶標儀

吸取1.0 mL液體生乳樣品于離心管中，2～8 ℃、3 000 r/min離心10 min，去除脂肪層，吸取100 L脫脂牛奶樣品進行檢測。

1.2.2 膠體金讀數儀

生乳樣品回溫至20～25 ℃。混勻后直接檢測。

1.3 儀器檢測原理對比

1.3.1 酶標儀檢測原理

該產品基于競爭性酶聯免疫吸附測定原理。酶標板微孔包被有AFM1特異性抗體。AFM1標準品和待測樣品加入酶標微孔中，若AFM1存在，溶液中AFM1會與包被的抗體偶聯。未偶聯的AFM1將在洗滌步驟中洗去。之后將AFM1-HRP酶結合物（檢測溶液）加入酶標板微孔中。AFM1-HRP酶結合物與還未被標準品或樣品中AFM1占據的抗體結合部位偶聯。檢測溶液中所有未偶聯的AFM1-HRP酶結合物將在洗滌步驟中洗去。將顯色底物加入微孔中，與檢測出的抗體逐漸形成藍色絡合物。顯色過程在加入酸后停止，并將生成的最終物質變成黃色。450 nm下測定吸光值，有色絡合物的光強度與樣品、標準品中AFM1濃度間接成比例。

1.3.2 膠體金讀數儀檢測原理

應用競爭性免疫層析檢測原理，通過受檢樣品中AFM1與固定在檢測線上的AFM1競爭結合標記有膠體金顆粒的抗體，達到抑制檢測線顯色效果。

1.4 儀器檢測

1.4.1 酶標儀

（1）使用前將所有試劑恢復至20～25 ℃，將所需數量的板條固定在微孔板架上，記錄標準品和樣品位置。

（2）將100 μL標準品或樣品加入對應微孔中，封板，搖板30 s，室溫下溫育45 min。

（3）將孔內液體甩干，在吸水紙上拍干，加入稀釋后的洗滌液250 μL/孔到微孔中，重復洗滌4 次，每次間隔10 s。如使用自動洗板機，可預定洗板完成5次周期，用吸水紙拍干（拍干后未清除氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

（4）加入100 μL AFM1檢測溶液，封板，搖板30 s后，室溫下溫育15 min。

（5）重復步驟3，將孔內液體甩干，在吸水紙上拍干，加入稀釋后的洗滌液250 μL/孔到微孔中，重復洗滌4 次，每次間隔10 s。如使用自動洗板機，可預定洗板完成5 次周期，用吸水紙拍干（拍干后未清除氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

（6）加入100 μL TMB基底，封板，搖板30 s后，于室溫下暗處避光溫育15 min。

（7）移去封板膜，在每個微孔中加入100 μL終止液，搖板，設定酶標儀于450 nm處（在5 min內讀完數據）測定每孔OD值。用spline曲線進行計算。

1.4.2 膠體金讀數儀

（1）試驗前請將試紙條和待測樣本恢復至20～25 ℃。

（2）用移液器移取200 μL待測生乳樣品于微孔中，反復吹打直至微孔中紅色試劑充分溶解混勻后，將其放置于（40±1）℃溫育器上溫育3 min。

（3）將試紙條插入微孔中，（40±1）℃溫育器上繼續溫育7 min，溫育結束后取出試紙條，去除下端樣品墊，判讀結果。

2 結果與分析

2.1 酶標儀和膠體金讀數儀的檢測試驗對比

將10 個AFM1定性檢測為陽性的生乳樣本，分別用酶標儀和膠體金讀數儀檢測，其中酶標儀檢測采用加標回收率方法，膠體金讀數儀檢測采用陽性質控樣方法，按照正常試驗步驟進行前處理和檢測。2 種方法檢測結果見表1、表2。其中表1的本底樣為不含待檢物質的復原乳，表2的本底樣為不含待檢物質的生牛乳。

表1 酶標儀檢測樣本數據結果

表2 膠體金讀數儀檢測樣本數據結果

根據《牛乳中黃曲霉毒素M1的快速檢測 雙流向酶聯免疫法》（NY/T 1664—2008）、《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）、《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素M族的測定》（GB 5009.24—2016）、《商品化食品檢測試劑盒評價方法》（SN/T 2775—2011），以及表1、表2數據可知，酶標儀檢測和膠體金讀數儀檢測均滿足檢測要求（其中膠體金讀數儀的結果報出只有陰性或陽性的定性結果），酶標儀檢測方法的回收率和膠體金讀數儀檢測方法精密度均達標[5]。

2.2 不同設備的使用對比分析

對2 種設備在單位樣品檢驗時間、費用、操作等方面進行綜合比較，結果見表3。2 種檢測設備各有優劣，檢測機構、企業或檢驗人員可綜合考量自身不同需求和環境、樣品量等因素，選擇最合適設備進行檢驗。

表3 酶標儀與膠體金讀數儀檢測結果比較

3 結論

本文主要對酶標儀、膠體金讀數儀檢測牛乳中黃曲霉毒素M1的操作過程和檢測結果對比分析。從操作過程看，酶標儀檢測操作過程相對復雜，所需耗材成本較高，因其試劑較多，操作暴露風險較大，有安全隱患，但快速、靈敏、對樣品純度要求不高，特別適用于大批量樣品檢測。由于需要酶標儀和熟練操作人員，不適合現場快速檢測[6]。膠體金讀數儀操作較簡單，所用耗材較少，檢測過程較安全，檢測速度較快，人員水平要求較低。從檢測結果看，酶標儀、膠體金讀數儀檢測方法均滿足檢測要求。酶標儀檢測方法的回收率、膠體金讀數儀檢測方法精密度均達標。酶標儀檢測結果較準確，適合作為定性初篩陽性樣品的再次定量驗證。膠體金讀數儀檢測速度較快，但無法定量檢測，較適用于快速定性檢測。實際應用中，2 種方法可配合使用，靈活運用設備優勢，高效率完成工作。