基于Klotho/血管緊張素Ⅱ1型受體信號通路探討大蒜素對鹽敏感性高血壓模型大鼠腎臟的影響

趙偉，張瑤，2，唐榮杰，2，霍迎新，2，廉秋芳，2

作者單位：1.712000 陜西省咸陽市，延安大學咸陽醫院心血管內科 2.716000 陜西省延安市，延安大學醫學院

腎臟在維持血壓穩定方面發揮著重要作用，且長期血壓負荷值偏高會造成腎臟損傷［1］。鹽敏感性高血壓（salt sensitive hypertension，SSH）是一種特殊類型的高血壓，研究發現，與原發性高血壓病（essential hypertension，EH）相比，SSH患者腎臟損傷更為嚴重，分析其原因為高鹽攝入所致血壓升高及高鹽本身均可導致腎臟損傷［2］。目前，臨床上阻止或逆轉SSH患者腎臟損傷的方法仍然有限。大蒜素是大蒜中的主要生物活性物質?，F代研究表明，大蒜素具有廣泛的藥理活性，其對腸道菌群紊亂、血脂代謝異常、癌癥等具有一定治療作用［3-5］。近年來大蒜素作為一種腎臟保護藥物備受關注，研究表明，補充外源性大蒜素能有效減輕腎缺血再灌注損傷模型大鼠腎臟損傷、局部炎癥損傷及氧化應激損傷，減少腎臟細胞凋亡，進而改善腎功能［6］；此外，大蒜素還能抑制慢性腎衰竭模型大鼠炎癥相關信號通路，降低炎癥因子水平，減輕腎臟纖維化，進而保護腎功能［7］?；诖?，本研究基于Klotho/血管緊張素Ⅱ 1型受體（angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R）信號通路探討大蒜素對SSH模型大鼠腎臟的影響，以期為SSH藥物研發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗時間

本實驗時間為2022年2—6月。

1.2 實驗動物

健康SPF級Dahl鹽敏感大鼠24只，雄性，8周齡，體質量200～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。飼養環境：溫度（22±2）℃，相對濕度（55±2）%，12 h光照/12 h黑暗交替進行，自由飲食和攝水。將24只Dahl鹽敏感大鼠隨機分為正常鹽組、高鹽組和高鹽＋大蒜素組，每組8只。動物實驗方案經延安大學醫學院動物倫理委員會審核批準（編號：2021-41）。

1.3 主要實驗藥物、試劑及儀器

（1）藥物：大蒜素購自上海創賽科技有限公司（純度≥98%，生產批號：PA02571）。（2）試劑：尿蛋白定量測試盒（貨號：C035-2-1）、血肌酐測定試劑盒（貨號：C011-2-1）均購自南京建成生物工程研究所有限公司，HE染色試劑盒（貨號：C0105S）購自上海碧云天生物技術有限公司，Masson染色試劑盒（貨號：B1130）購自北京普利萊基因技術有限公司，丙二醛檢測試劑盒（CEA597Ge 96T）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（SES134Ra 96T）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒（CEA294Ge 96T）購自博奧派克生物科技有限公司，Klotho抗體（貨號：DF10309）購自Affinity Biosciences公司，AT1R抗體（貨號：ab124734）購自Abcam公司，TRIzol（貨號：10296028）、SuperScriptⅢ逆轉錄試劑盒（11752050）、PCR mix（4472920）購自Invitrogen公司，BCA蛋白質定量試劑盒（型號：MD913053）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（型號：MD911919）購自北京百奧思科生物醫學技術有限公司。（3）儀器：多參數監護儀（型號：PM-9000GTA）購自湖南瑞博科技有限公司，酶標儀（型號：Model 550）購自Bio-Rad公司，化學發光成像儀（型號：chemiscope 6100）購自上海勤翔科學儀器有限公司，熒光定量PCR儀（型號：StepOne Software）購自Applied Biosystems公司，電泳儀（型號：EPS 300）購自Bio-Rad公司，凝膠成像儀（型號：2500）購自Bio-Rad公司，凝膠成像系統（型號：GelDoc-It310）購自上海巴玖實業有限公司，化學發光成像系統（型號：170-8280）購自Bio-Rad公司。

1.4 干預方法

正常鹽組大鼠給予0.3%氯化鈉飼料喂養。高鹽組和高鹽＋大蒜素組大鼠制備SSH模型，具體如下：參考文獻［8］，采用8%氯化鈉飼料喂養大鼠，在此基礎上，高鹽＋大蒜素組大鼠給予大蒜素16 mg/kg，口服。三組大鼠均干預4周。大鼠尾動脈收縮壓升高且發生腎臟纖維化提示造模成功。

1.5 觀察指標

1.5.1 尾動脈收縮壓

干預前及干預1、2、3、4周的同一時間，采用多參數監護儀測量大鼠平靜狀態下尾動脈收縮壓，每只大鼠連續測量3次，取平均值。

1.5.2 腎功能指標

干預4周后對大鼠進行稱重并采用代謝籠收集其24 h尿液，嚴格按照尿蛋白定量測試盒操作說明書檢測尿蛋白；之后采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取5 ml腹主動脈血，3 500～4 000 r/min離心10 min（離心半徑8 cm），分離血清，嚴格按照血肌酐測定試劑盒操作說明書檢測血肌酐水平。之后摘取大鼠雙腎并稱重，計算腎臟重量/體質量（kindey weight/body weight，KW/BW）比值。

1.5.3 腎組織病理學改變

干預4周后，取大鼠適量左腎組織，采用4%多聚甲醛溶液固定，然后洗滌、脫水，根據HE染色及Masson染色試劑盒說明書進行操作，脫水、透明、封固后在光鏡下觀察腎組織病理學改變。

1.5.4 氧化應激指標

干預4周后，采用酶聯免疫吸附試驗檢測大鼠腎組織丙二醛、SOD、GSH水平，具體如下：取大鼠適量右腎組織，根據丙二醛、SOD、GSH檢測試劑盒操作說明書檢測腎組織丙二醛、SOD、GSH水平。實驗獨立進行3次。

1.5.5 Klotho、AT1R表達水平

干預4周后，采用免疫組化染色法檢測大鼠腎組織Klotho、AT1R表達水平，具體如下：將腎臟組織進行石蠟包埋，切割5 μm石蠟切片并固定于60 ℃恒溫箱中，在水中采用二甲苯和梯度乙醇溶液脫蠟，采用枸櫞酸鈉緩沖液修復。采用PBS洗滌3次，每次持續3 min。加入已稀釋的一抗并于4 ℃環境下過夜，采用PBS洗滌后再次添加二抗，并在37 ℃環境下孵育30 min。通過光學顯微鏡觀察Klotho、AT1R表達水平。

1.5.6 Klotho、AT1R mRNA相對表達量

干預4周后，采用RT-qPCR法檢測大鼠腎組織Klotho、AT1R mRNA相對表達量，具體如下：取適量右腎組織并置于液氮中研磨，使用TRIzol提取總RNA，分別在260、280 nm波長處測定RNA溶液的吸光度。取適量RNA溶液按照SuperScript Ⅲ逆轉錄試劑盒將RNA合成cDNA，然后對cDNA進行PCR，以β-actin為內參。RT-qPCR引物序列見表1。PCR條件：95 ℃持續5 min，然后進行40次擴增循環（95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃20 s）。反應體系包括2 μl cDNA、6 μl ddH2O、10 μl PCR mix、1 μl正向引物和1 μl反向引物。目的基因mRNA相對表達量=2-（ΔCt目的基因－ΔCt參照基因）。實驗獨立進行3次。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequences

1.5.7 Klotho、AT1R蛋白相對表達量

干預4周后，采用Western blot法檢測腎組織Klotho、AT1R蛋白相對表達量，具體如下：將腎小管上皮細胞與裂解液在冰上孵育15 min，12 000 r/min離心10 min（離心半徑6.2 cm），收集上清液。采用BCA蛋白質定量試劑盒檢測細胞上清液中蛋白濃度，繪制標準曲線。通過SDS-PAGE凝膠配制試劑盒分離蛋白質，然后轉移到PVDF膜上；采用1×TBST配置的3%脫脂牛奶封閉液封閉1 h，然后將PVDF膜放一抗孵育過夜；采用1×TBST浸泡10 min后棄掉1×TBST，重復3次。將PVDF膜放入二抗孵育2 h；采用1×TBST浸泡10 min后棄掉1×TBST，重復3次。采用發光液浸濕PVDF膜后將其置于化學發光成像系統進行顯影，采用Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值/參照蛋白灰度值表示目的蛋白相對表達量。實驗獨立進行3次。

1.6 統計學方法

應用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行數據處理。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 尾動脈收縮壓

高鹽組和高鹽＋大蒜素組大鼠均造模成功。干預前，三組大鼠尾動脈收縮壓比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；干預1、2、3、4周，三組大鼠尾動脈收縮壓比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。干預1周，高鹽組大鼠尾動脈收縮壓高于正常鹽組，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預2、3、4周，高鹽組大鼠尾動脈收縮壓高于正常鹽組，高鹽＋大蒜素組大鼠尾動脈收縮壓低于高鹽組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組大鼠干預前后尾動脈收縮壓比較（±s，mmHg，n=8）Table 2 Comparison of tail artery systolic blood pressure among the three groups of rats before and after intervention

表2 三組大鼠干預前后尾動脈收縮壓比較（±s，mmHg，n=8）Table 2 Comparison of tail artery systolic blood pressure among the three groups of rats before and after intervention

注：a表示與正常鹽組比較，P ＜0.05；b表示與高鹽組比較，P＜0.05；1 mmHg=0.133 kPa。

組別干預前 干預1周 干預2周 干預3周 干預4周正常高鹽組117±3 115±4120±5117±4 118±3鹽組114±4 123±6a 165±6a 181±4a 207±10a高鹽＋大蒜素組 118±3 123±2144±6b 154±6b 172±9b F值3.409.40118.70350.20265.40 P值0.0510.001＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 腎功能指標

干預4周后，三組大鼠尿蛋白、血肌酐、KW/BW比值比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預4周后，高鹽組大鼠尿蛋白、血肌酐、KW/BW比值高于正常鹽組，高鹽＋大蒜素組大鼠尿蛋白、血肌酐、KW/BW比值低于高鹽組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 三組大鼠干預4周后腎功能指標比較（±s，n=8）Table 3 Comparison of renal function indexes among the three groups of rats at 4 weeks after intervention

表3 三組大鼠干預4周后腎功能指標比較（±s，n=8）Table 3 Comparison of renal function indexes among the three groups of rats at 4 weeks after intervention

注：KW/BW=腎臟重量/體質量；a表示與正常鹽組比較，P＜0.05；b表示與高鹽組比較，P＜0.05。

組別尿蛋白（mg/L） 血肌酐（μmol/L） KW/BW比值正常鹽組5.50±1.1624.14±0.810.66±0.06高鹽組高鹽＋大蒜素13.67±1.18a43.02±0.88a1.19±0.19a組9.21±0.96b29.83±0.76b0.88±0.12b F值109.901 124.0031.30 P值＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 腎組織病理學改變

HE染色結果顯示，正常鹽組大鼠腎小球與腎小管結構清晰，形態正常；與正常鹽組相比，高鹽組大鼠腎小球囊腔增大且輪廓不規則，腎小球基底膜增厚，腎小管上皮細胞肥大，呈空泡變性，腎間質伴有炎性細胞浸潤；與高鹽組相比，高鹽＋大蒜素組大鼠腎組織病理損傷相對減輕，局部可見少量炎性細胞浸潤，見圖1。Masson染色結果顯示，與正常鹽組相比，高鹽組視野內觀察到大量膠原纖維沉積，腎組織纖維化嚴重；與高鹽組相比，高鹽＋大蒜素組大鼠腎組織纖維化明顯減輕，見圖2。

圖2 三組大鼠腎組織Masson染色結果（×400）Figure 2 Masson staining results of renal tissue among the three groups of rats

2.4 氧化應激指標

干預4周后，三組大鼠腎組織丙二醛、SOD、GSH水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預4周后，高鹽組大鼠腎組織丙二醛水平高于正常鹽組，腎組織SOD、GSH水平低于正常鹽組，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預4周后，高鹽＋大蒜素組腎組織丙二醛水平低于高鹽組，腎組織SOD、GSH水平高于高鹽組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 三組大鼠干預4周后腎組織氧化應激指標比較（±s，n=3）Table 4 Comparison of oxidative stress indexes of renal tissue among the three groups of rats at 4 weeks after intervention

表4 三組大鼠干預4周后腎組織氧化應激指標比較（±s，n=3）Table 4 Comparison of oxidative stress indexes of renal tissue among the three groups of rats at 4 weeks after intervention

注：SOD=超氧化物歧化酶，GSH=谷胱甘肽；a表示與正常鹽組比較，P＜0.05；b表示與高鹽組比較，P＜0.05。

組別丙二醛（ng/ml） SOD（ng/ml） GSH（μg/ml）正常鹽組110.6±3.05.8±0.210.6±1.1高鹽組鹽＋大蒜素202.7±4.5a1.7±0.1a4.4±0.5a高組161.1±4.4b4.6±0.2b8.8±0.9b F值1 043.01633.0105.1 P值＜0.001＜0.001＜0.001

2.5 Klotho、AT1R表達水平及其mRNA、蛋白相對表達量

干預4周后，三組大鼠腎組織Klotho、AT1R表達水平及其mRNA、蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預4周后，高鹽組大鼠腎組織Klotho表達水平及其mRNA、蛋白相對表達量低于正常鹽組，AT1R表達水平及其mRNA、蛋白相對表達量高于正常鹽組，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預4周后，高鹽＋大蒜素組大鼠腎組織Klotho表達水平及其mRNA相對表達量、蛋白高于高鹽組，AT1R表達水平及其mRNA、蛋白相對表達量低于高鹽組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表5、圖3～4。

圖3 三組大鼠免疫組化染色結果（×400）Figure 3 Results of immunohistochemical staining among the three groups of rats

圖4 Western blot法檢測三組大鼠Klotho、AT1R蛋白相對表達量的SDS-PAGE圖Figure 4 SDS-PAGE diagram of relative expression of Klotho，AT1R protein detected by Western blot method among the three group of rats

表5 三組大鼠干預4周后腎組織Klotho、AT1R表達水平及其mRNA、蛋白相對表達量比較（±s，n=3）Table 5 Comparison of expression level，mRNA relative expression，protein relative expression of Klotho and AT1R of renal tissue among the three groups of rats at 4 weeks after intervention

表5 三組大鼠干預4周后腎組織Klotho、AT1R表達水平及其mRNA、蛋白相對表達量比較（±s，n=3）Table 5 Comparison of expression level，mRNA relative expression，protein relative expression of Klotho and AT1R of renal tissue among the three groups of rats at 4 weeks after intervention

注：a表示與正常鹽組比較，P＜0.05；b表示與高鹽組比較，P＜0.05。

組別Klotho表達水平AT1R表達水平Klotho mRNA相對表達量 AT1R mRNA相對表達量Klotho蛋白相對表達量AT1R蛋白相對表達量正常鹽組0.32±0.020.23±0.031.03±0.091.04±0.080.92±0.010.32±0.02高鹽組0.21±0.05a0.39±0.08a0.51±0.06a1.63±0.09a0.37±0.03a0.83±0.04a高鹽＋大蒜素組 0.29±0.02b0.26±0.02b0.82±0.10b1.28±0.06b0.59±0.02b0.65±0.03b F值10.968.6327.9643.99471.20201.50 P值0.0090.017＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

3 討論

高血壓是慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）的主要原因，僅次于糖尿病，是加劇患者CKD患者腎功能惡化的重要因素［9］。眾所周知，飲食習慣與高血壓的發病密切相關，尤其是高鹽飲食。研究表明，高達50%的EH為高鹽引起，其被稱為SSH［10］。研究表明，天然植物化合物（natural plant compounds，NPC）在高血壓及其靶器官損傷的治療中發揮著重要作用［11-12］。在臨床研究中，幾種NPC已被證明具有腎臟保護作用，其主要通過激活抗氧化防御系統及抑制促炎信號通路而改善腎臟病患者預后［13］。因此，本研究以NPC為切入點，基于Klotho/AT1R信號通路探討大蒜素對SSH模型大鼠腎功能的影響。

本研究結果顯示，干預1周，高鹽組大鼠尾動脈收縮壓高于正常鹽組；干預2、3、4周，高鹽組大鼠尾動脈收縮壓高于正常鹽組，高鹽＋大蒜素組大鼠尾動脈收縮壓低于高鹽組；干預4周后，高鹽組大鼠尿蛋白、血肌酐、KW/BW比值高于正常鹽組，高鹽＋大蒜素組大鼠尿蛋白、血肌酐、KW/BW比值低于高鹽組。HE染色結果顯示，與正常鹽組相比，高鹽組大鼠腎小球基底膜增厚，腎小管上皮細胞肥大，呈空泡變性，腎間質伴有炎性細胞浸潤；與高鹽組相比，高鹽＋大蒜素組大鼠腎組織病理損傷相對減輕，局部可見少量炎性細胞浸潤。Masson染色結果顯示，與正常鹽組相比，高鹽組視野內觀察到大量膠原纖維沉積，腎組織纖維化嚴重；與高鹽組相比，高鹽＋大蒜素組大鼠腎組織纖維化明顯減輕。提示高鹽飲食喂養Dahl鹽敏感大鼠可成功制備SSH模型，且SSH模型大鼠伴有腎組織損傷、膠原纖維沉積及腎功能降低，而補充大蒜素能有效降低SSH模型大鼠收縮壓，減輕其腎組織損傷、膠原纖維沉積，改善其腎功能。LIU等［14］研究發現，大蒜素可有效降低自發性高血壓模型大鼠血壓，并通過抑制鈣調蛋白激酶Ⅱ/核因子κB信號通路而保護大鼠血管和心臟，提示大蒜素對血壓升高引起的靶器官損傷具有一定治療作用。此外，大蒜素還對不同原因腎功能損傷具有保護作用，如其能保護腎組織免受環孢素A引起的腎毒性與氧化應激損傷，進而減少腎小管萎縮和壞死［15］。再者，大蒜素對血壓和腎功能的影響與氯沙坦相當［16］。

氧化應激損傷是活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生的一種負面作用，其是導致多種疾病的重要因素，其中腎臟特別容易受到氧化還原失衡和氧化應激損傷的影響［17］。研究報道，高鹽喂食Dahl鹽敏感大鼠能夠誘導腎臟髓質中ROS含量增加，但不影響大腦中ROS含量，提示高鹽飲食介導的氧化應激損傷與腎臟密切相關［18］；此外，血壓升高可通過直接或間接作用促進腎臟ROS表達增加［19］。丙二醛可以反映氧自由基含量、脂質過氧化水平及氧自由基對腎組織的損傷程度。SOD和GSH作為主要抗氧化酶，在清除氧自由基方面發揮了至關重要的作用，其活性可以反映腎臟清除氧自由基和抵抗脂質過氧化的能力。本研究結果顯示，干預4周后，高鹽＋大蒜素組腎組織丙二醛水平低于高鹽組，腎組織SOD、GSH水平高于高鹽組，提示SSH模型大鼠存在氧化應激損傷，而大蒜素能有效減輕其氧化應激損傷。

Klotho蛋白作為一種抗衰老蛋白，與腎臟及腎臟疾病有關。一方面，Klotho蛋白主要在腎臟遠曲小管表達［20］；另一方面，腎臟病發病過程中伴隨Klotho蛋白水平下降，且補充Klotho蛋白能緩解甚至逆轉多種因素造成的腎臟損傷［21］。此外，Klotho蛋白能抑制腎臟氧化應激損傷，其缺乏已被證明會增加內源性ROS的生成，并加劇氧化應激損傷［22］；相反，外源性補充Klotho可有效增強機體抗氧化防御能力，下調ROS表達水平，進而減輕氧化應激損傷［23］。本課題組前期研究發現，Klotho蛋白能與AT1R結合，進而抑制AT1R表達及其介導的氧化應激損傷，且對高鹽誘導的腎細胞損傷具有保護作用［24］。本研究結果顯示，干預4周后，高鹽組大鼠腎組織Klotho表達水平及其mRNA、蛋白相對表達量低于正常鹽組，AT1R表達水平及其mRNA、蛋白相對表達量高于正常鹽組；干預4周后，高鹽＋大蒜素組大鼠腎組織Klotho表達水平及其mRNA、蛋白相對表達量高于高鹽組，AT1R表達水平及其mRNA、蛋白相對表達量低于高鹽組；提示SSH模型大鼠Klotho蛋白表達下調，AT1R表達上調，腎臟氧化應激損傷加重；而補充大蒜素能有效上調Klotho蛋白表達，抑制AT1R表達，進而減輕腎臟氧化應激損傷，表明大蒜素對SSH模型大鼠的腎臟保護作用與其調控Klotho/AT1R信號通路、減輕腎臟氧化應激損傷相關。

4 結論

綜上所述，大蒜素能有效改善SSH模型大鼠腎功能，減輕其腎組織損傷、膠原纖維沉積及腎臟氧化應激損傷，其機制可能與大蒜素調控Klotho/AT1R信號通路有關。

作者貢獻：趙偉進行文章的構思與設計，并撰寫論文；張瑤進行結果的分析與解釋；趙偉、唐榮杰、霍迎新進行實驗實施；張瑤、霍迎新進行數據整理；趙偉、廉秋芳進行論文修訂；廉秋芳進行文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。