3 株酵母菌的鑒定及用于水果采后保鮮初探

宋培勇，張 容，漆楊菊，胡 蓉，王雙雙，曾 鋼

（1.遵義師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，貴州 遵義 563006；2.遵義市第八中學(xué)，貴州 遵義 563099）

酵母菌是單細(xì)胞真核微生物，能發(fā)酵糖類產(chǎn)能，故有“糖菌”之稱，以出芽生殖為主，細(xì)胞壁含葡聚糖和甘露聚糖，常常分布在含糖量較高的酸性環(huán)境中。人類與酵母菌關(guān)系久遠(yuǎn)而密切，如白酒的釀造、面包的制作、B 族維生素和單細(xì)胞蛋白（SCP）的生產(chǎn)、石油脫蠟、美容抗衰、疫苗生產(chǎn)等。酵母菌除了上述諸多用途外，在生物保鮮方面，酵母作為主要的生物拮抗菌，因不產(chǎn)生毒素、遺傳穩(wěn)定、生長(zhǎng)繁殖能力強(qiáng)、可與化學(xué)拮抗劑配合使用等特點(diǎn)而成為研究熱點(diǎn)[1,2]。目前，運(yùn)用到果蔬采后病害防治中的拮抗酵母菌約有20 多種，如季也蒙畢赤酵母、羅倫隱球酵母、假絲酵母、隱球酵母、紅酵母、季氏假絲酵母、畢赤酵母、檸檬形克勒克酵母等[3]。應(yīng)用生物拮抗菌對(duì)果蔬采后病害進(jìn)行生物防治是目前最有希望替代化學(xué)殺菌劑的一種新型保鮮技術(shù)[4]。在人類基因組計(jì)劃的推動(dòng)下，1996 年釀酒酵母全基因組測(cè)序完成[5]；2018 年中、美科學(xué)家更是利用基因編輯技術(shù)各自人工合成了僅有1 條和2 條染色體的釀酒酵母[6,7]。這些研究極大地推動(dòng)了酵母菌基因組學(xué)和后基因組學(xué)的發(fā)展，也為未來(lái)通過(guò)基因工程改造現(xiàn)有拮抗酵母菌，并最終獲得高效廣譜拮抗酵母菌株提供了可能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料：酵母菌XRL-1、XRL-2 和XRL-3，為本實(shí)驗(yàn)室從貴州省鳳岡縣仙人嶺采集的水果梨、李和葡萄中分離、純化并保存。用于測(cè)試生物保鮮效果的水果棗和提子從當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購(gòu)買(mǎi)，山桃從遵義師范學(xué)院校園中采集。

1.1.2 主要儀器：E200F 型生物數(shù)碼顯微鏡（尼康）、Mastercycler nexus gradient 梯度PCR 儀（Eppendorf）、超低溫冰箱（BioRad）、PHS-25 型數(shù)顯PH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、DYY-6C電泳儀（北京六一）。

1.1.3 主要藥品及試劑：PCR引物NL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′和NL4：5′-GGTC CGTGTTTCAAGACGG-3′（上海生工），100 bp DNA Ladde（r北京天根），Taq PCR Mix(2×（)上海生工）。

1.1.4 主要培養(yǎng)基：YEPD 培養(yǎng)基、麥?zhǔn)希∕eClary）培養(yǎng)基、碳源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基和氮源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基，參考相關(guān)文獻(xiàn)[8～10]進(jìn)行配制。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌形態(tài)特征的觀察

（1）菌落形態(tài)：將斜面保存的XRL-1、XRL-2 和XRL-3，無(wú)菌操作轉(zhuǎn)接到Y(jié)EPD 平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d-5 d，觀察菌落大小、顏色等形態(tài)特征。

（2）細(xì)胞形態(tài)：用接種環(huán)挑取少許酵母菌于滴有無(wú)菌水的載玻片上，涂勻，加蓋玻片，在微分干涉顯微鏡下觀察，并拍照記錄。

（3）子囊孢子：無(wú)菌操作將酵母菌轉(zhuǎn)接到麥?zhǔn)檄傊囵B(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h 后，挑取少許酵母菌于滴有生理鹽水的載玻片上，混勻，火焰上方固定，自然風(fēng)干，以孔雀綠-番紅染色法染色后，在普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡或微分干涉顯微鏡下觀察，拍照并記錄結(jié)果。

1.2.3 生理生化特性

（1）碳源同化/糖發(fā)酵試驗(yàn)。液體培養(yǎng)基的配制：蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g、糖（淀粉/乳糖/葡萄糖/蔗糖）1 g、蒸餾水100 mL，pH7.6，113 ℃滅菌30 min。在超凈工作臺(tái)中制作酵母菌懸液，以移液槍接種1 mL 酵母菌懸液于含不同碳源的蛋白胨培養(yǎng)液試管中（內(nèi)有倒置德漢氏小管），每種碳源各設(shè)3 管，另加有各種碳源的培養(yǎng)液各設(shè)一不接菌種的試管作為對(duì)照組，每一試管中滴入2～3 滴1.6%溴甲酚紫乙醇溶液指示劑，用PHS-25 型數(shù)顯pH 酸堿計(jì)測(cè)量后，以1% NaOH 調(diào)pH 至7.6，并做好標(biāo)記，28 ℃培養(yǎng)2～3天。試管中顏色為紫色不產(chǎn)酸，黃色則產(chǎn)酸；德漢氏小管中有氣泡則證明能產(chǎn)氣，反之則不能。

（2）氮源同化試驗(yàn)。配制氮源同化培養(yǎng)基：硫酸銨0.198 g/尿素0.090 g/蛋白胨3 g/硝酸鈉0.127 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀0.2 g，七水合硫酸鎂0.2 g，蒸餾水1000 mL，氯化鈉0.2 g，碳酸鈣5 g，瓊脂15～20 g，調(diào)節(jié)至pH7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min，將菌株接種于平板上，每種菌接3 個(gè)平板，28℃培養(yǎng)3～7天。觀察菌株生長(zhǎng)情況。

1.2.4 模板制備和PCR 擴(kuò)增

（1）酵母菌基因組DNA 模板制備[11]挑取酵母菌接種于YEPD平板上，28℃培養(yǎng)2 天，經(jīng)4℃過(guò)夜后，按文獻(xiàn)報(bào)道的方法制備DNA 模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）26S rDNA D1/D2 區(qū)PCR 擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增引物為通用引物[12]：NL-1 和NL-4。

PCR 擴(kuò)增程序[13]：94 ℃3 min；94 ℃40 s，48 ℃45 s，72 ℃45 s，5 個(gè)循環(huán)；94 ℃40 s，53 ℃45 s，72℃45 s，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃8 min。

1.2.5 PCR 產(chǎn)物測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析

將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序（由上海生工完成），將測(cè)序結(jié)果在NCBI 中進(jìn)行Blast 比對(duì)分析，獲得最相近菌株的26S rDNA D1/D2 序列，在MEGA4.1 中以鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

根據(jù)26S rDNA D1/D2 序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析，并結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征[9,14]，對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行分類鑒定。

1.2.6 水果生物保鮮試驗(yàn)

選取3 種水果棗子、提子和山桃，每種水果，設(shè)3 個(gè)試驗(yàn)組（即XRL-1、XRL-2 和XRL-3 處理組）和1 個(gè)對(duì)照組（即無(wú)菌水處理組），每個(gè)組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5 個(gè)水果。將XRL-1、XRL-2 和XRL-3 酵母菌YEPD 液體培養(yǎng)物先測(cè)其OD600值，用無(wú)菌水稀釋使各OD600值一致，用無(wú)菌燒杯分裝，將水果放于盛有酵母菌液的燒杯中浸1 min，整齊擺放在臺(tái)面上指定位置，然后連續(xù)觀察記錄2 周，以比較酵母菌對(duì)水果的保鮮效果，并利用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件（IBM SPSS Statistics 19）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果做單因素方差分析[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母菌的形態(tài)特征

XRL-1 菌落表面濕潤(rùn)光滑，乳白色，大而厚，圓形，邊緣整齊1.3mm；呈單個(gè)細(xì)胞，圓形或橢圓形，長(zhǎng)4.3m、寬3.7m；在YEPD培養(yǎng)基上可見(jiàn)芽殖；在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上未見(jiàn)子囊孢子，見(jiàn)圖1。

圖1 XRL-1 菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)（10×100）

XRL -2 菌落表面濕潤(rùn)粘稠，乳白色，圓形或橢圓形，少數(shù)形狀不規(guī)則，從培養(yǎng)基表面微微凸起，邊緣整齊或不整齊2.6mm；呈單個(gè)細(xì)胞，圓形或橢圓形，少數(shù)呈扇形，長(zhǎng)平均5.4m，寬平均4.2m；在YEPD 培養(yǎng)基上可見(jiàn)芽殖；在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上見(jiàn)子囊孢子，見(jiàn)圖2。

圖2 XRL-2 子囊孢子（10×100）

XRL-3 菌落表面濕潤(rùn)光滑有光澤，乳白色，圓形或橢圓形，明顯突起，邊緣不整齊2.4mm；細(xì)胞呈檸檬形或卵圓形；在YEPD培養(yǎng)基上可見(jiàn)兩極芽殖，在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上未見(jiàn)子囊孢子。

2.2 生理生化特性

碳源同化/糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明：4 種供試碳源葡萄糖、乳糖、蔗糖和淀粉，XRL-1 均能利用；XRL-2只能利用葡萄糖和蔗糖；XRL-3 只能利用葡萄糖、乳糖和蔗糖，但對(duì)蔗糖利用作用不如葡萄糖和乳糖；葡萄糖是3 株酵母菌均能利用的通用碳源，見(jiàn)表1。

表1 碳源同化/糖發(fā)酵及氮源同化結(jié)果

氮源同化試驗(yàn)結(jié)果表明：4 種供試氮源蛋白胨、尿素、硝酸鈉和硫酸銨，XRL-1 和XRL-2 菌株均能利用，但XRL-3 僅能利用蛋白胨，蛋白胨是3 株酵母菌的通用氮源，見(jiàn)表1。

2.3 26S rDNA D1/D2 區(qū)PCR 擴(kuò)增、測(cè)序、比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用26S rDNA D1/D2 區(qū)PCR 擴(kuò)增通用引物NL1 和NL4 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3 所示：XRL-1、XRL-2和XRL-3 均擴(kuò)增到約600 bp 大小的片段，條帶清晰、整齊、明亮，與有關(guān)文獻(xiàn)[16,17]報(bào)道的一致，說(shuō)明已成功擴(kuò)增到了目的片段。

圖3 酵母菌26S rDNA D1/D2 區(qū)PCR 擴(kuò)增

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，進(jìn)入NCBI 官網(wǎng)進(jìn)行Blast 比對(duì)，結(jié)果如表2 所示：XRL-1 與Wickerhamomyces anomalus strain FBKL2.8007 相似性為100.00%，XRL-2 與Saccharomyces cerevisiae isolate LMQA SNR 106 的相似性為99.83%，XRL-3 與Hanseniaspora uvarum strain SC-12 的相似性為99.66%。

表2 26S rDNA D1/D2 區(qū)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物BLAST 比對(duì)結(jié)果

利用XRL-1、XRL-2 和XRL-3 的26S rDNA D1/D2 區(qū)序列和 Wickerhamomyces anomalus strain FBKL2.8007、Saccharomyces cerevisiae isolate LMQA SNR 106 和 Hanseniaspora uvarum strain SC-12 的相應(yīng)序列，利用Mega4.1 構(gòu)樹(shù)軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖4 所示，XRL-1、XRL-2和XRL-3與相應(yīng)的同源菌株聚為一支，同時(shí)也可以看出，在3株酵母菌中，XRL-2 和XRL-3 親緣關(guān)系更近。

圖4 根據(jù)酵母菌26S rDNA D1/D2 區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

根據(jù)26S rDNA D1/D2 區(qū)序列Blast 比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，將試驗(yàn)菌株XRL-1、XRL-2 和XRL-3 分別鑒定為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus ）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。

2.4 水果生物保鮮

水果保鮮結(jié)果如表3 所示，單因素方差分析表明：酵母菌XRL-1、XRL-2 和XRL-3 對(duì)棗子、提子和山桃的保鮮效果在第一周均無(wú)顯著性差異（p>0.05）；在第二周對(duì)山桃亦無(wú)顯著差異（p>0.05），但對(duì)棗子和提子差異顯著（p<0.05），就棗子保鮮效果而言，多重比較表明XRL-1、XRL-2 和XRL-3 與對(duì)照組之間以及XRL-1 與XRL-2 和XRL-3 之間差異顯著（p<0.05），XRL-2 與 XRL-3 之間差異不顯著（p>0.05）；就提子的保鮮效果而言，多重比較表明XRL-1 與XRL-3 和對(duì)照組之間差異顯著（p<0.05），但XRL-1 與XRL-2 以及XRL-2 與對(duì)照組和XRL-3之間差異不顯著。提示不同的酵母菌拮抗活性存在明顯差異，3 種酵母菌中以異常威克漢姆酵母對(duì)棗子和提子的保鮮效果在第二周最佳，這與王遠(yuǎn)見(jiàn)（2022）[18]和藍(lán)黃博恩（2023）[19]報(bào)道的比較一致；第一周無(wú)顯著性差異可能和酵母菌的接種方法及其水果的定植有關(guān)。而山桃無(wú)論在第一周還是第二周，3 種酵母菌的保鮮效果并無(wú)顯著差異，推斷可能因?yàn)樯教沂且吧又煌乃赡艽嬖诓煌奈⑸飬^(qū)系，引起水果褐變或霉變的致病菌不同，水果中各種抗性酶的活性亦有高低，致使酵母菌對(duì)不同水果的保鮮效果各異。

表3 3 株酵母菌對(duì)3 種水果的生物保鮮效果（表中數(shù)據(jù)為褐變或霉變率/%）

3 結(jié)論

對(duì)從貴州省鳳岡縣仙人嶺李、梨和葡萄3 種水果中分離的3 株酵母菌XRL-1、XRL-2 和XRL-3 開(kāi)展了形態(tài)學(xué)、生理生化以及分子生物學(xué)鑒定，將XRL-1、XRL-2 和XRL-3 分別鑒定為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。3 株酵母菌對(duì)水果棗子、提子和山桃采后保鮮的效果并不一致：在棗子采后保鮮上，XRL-1 與XRL-2、XRL-3 與對(duì)照組相比，在第一周無(wú)顯著性差異，但在第二周差異顯著（p<0.05）；在提子采后保鮮上，XRL-1、XRL-2 和XRL-3 與對(duì)照組相比，在第一周無(wú)顯著性差異，但在第二周XRL-1 與XRL-3 和對(duì)照組之間差異顯著（p<0.05）；在山桃采后保鮮上，XRL-1、XRL-2 和XRL-3 與對(duì)照組相比，在第一周和第二周均無(wú)顯著性差異（p>0.05）。用酵母菌作為拮抗菌劑用于果蔬生物保鮮，尚需要進(jìn)一步深入開(kāi)展以下研究：拮抗酵母篩選與基因工程改良，拮抗酵母復(fù)合菌劑研究，果蔬采后微生物區(qū)系變化研究等。