miR-4534對宮頸癌細胞增殖的影響及其臨床病理意義

相 麗 王會月 王 緒 張榮善

1 揚州大學醫學院,江蘇省揚州市 225009; 2 寶應縣婦幼保健院; 3 寶應縣人民醫院

宮頸癌(Cervical cancer,CC)是發展中國家婦女最常見的癌癥之一,在全球癌癥中宮頸癌發病率排名第三[1],目前其發病機制還未闡明。微小RNA(miRNA)是一種包含21～23個核苷酸的單鏈RNA,其主要功能是抑制編碼RNA轉錄后翻譯來調節基因表達或誘導靶信使RNA的降解[2]。在癌癥中miRNAs可作為癌基因和(或)抑癌基因發揮重要的生物學功能[3]。雖然文獻報道宮頸癌組織中有一些微小RNA表達水平異常[4],但miR-4534在宮頸癌中的研究還知之甚少。本文就miR-4534在宮頸癌中的表達水平、臨床病理意義及對增殖的影響進行探討。

1 材料和方法

1.1 樣本和資料 選取2021年1月—2022年12月期間在揚州大學附屬醫院和寶應縣婦幼保健院接受宮頸癌根治術并確診為宮頸鱗狀細胞癌(CSCC)的71例患者作為研究對象,年齡38～66歲,中位年齡50歲。納入標準:(1)臨床資料、病理資料無缺失者;(2)術前未接受放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療者;(3)對本研究知情同意者。排除標準:(1)合并其他部位惡性腫瘤者;(2)自身免疫性疾病、感染性疾病患者。臨床標本使用及病理資料收集均經醫院倫理委員會批準,并與患者簽署知情同意書。

1.2 質粒和細胞 miR-4534 mimic和si-miR-4534質粒合成于南京金斯瑞生物科技公司。宮頸癌細胞株C33A細胞購自上海中科院細胞庫。通過Lipofectamine 2000細胞轉染試劑盒將miR-4534 mimic和si-miR-4534質粒轉染至C33A細胞株,并將細胞株均放置含10%胎牛血清DMEM培養基的培養瓶中,然后放置在37℃,含有5% CO2濃度細胞培養箱內進行培育。

1.3 實時熒光定量PCR實驗 CSCC組織總RNA的抽提是通過TRIZOL試劑裂解萃取并通過分光光度計測定RNA濃度。然后通過Prime ScriptTMⅡ1st Strand合成cDNA試劑盒(Takara公司)合成cDNA 。實時熒光定量PCR運用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(Takara公司)并按試劑說明書進行。miR-4534的上游引物為GACUUGUGAAUGACCCCCUU,下游引物為AUUAAGUACCCAAGACCCCU。將包含反應體系的檢測樣本在Applied Biosystems 7500 R-T PCR system進行qRT-PCR實驗,實驗步驟包括:(1)預變性:95℃,時間為30s。(2)PCR反應:重復:40個循環,95℃,時間為5s; 60℃,時間為45s。

1.4 CCK-8細胞增殖活性實驗 主要步驟:接種C33A細胞懸液100μl 于96孔板,在細胞培養箱中孵育過夜。取出C33A細胞培養瓶,加入10μl體積的CCK-8,充分混合。繼續培養細胞3h。置于孔板于搖床振蕩約1min,用酶標儀讀取450nm光吸收值(注意在結果中需要減去具有培養基和CCK8溶液而沒有細胞的孔的吸光值),計算細胞增殖活性。

1.5 免疫組化實驗 組織切片厚度4μm,脫蠟至水洗。用H2O2滅活組織切片內源性的過氧化物酶。使用抗原修復液修復抗原。使用羊血清封閉液封閉。去除封閉液后滴加即用型Ki-67一抗, 4℃冰箱過夜;滴加生物素標記的二抗,37℃培養箱中孵育1h;滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液,37℃孵育30min;DAB染色液顯色,蘇木素復藍,透明,封片,光鏡下觀察。陽性染色為棕黃色顆粒。用PBS緩沖液代替一抗作空性對照。

1.6 裸鼠皮下荷瘤實驗 BALB/C-nu/nu裸鼠來源于揚州大學動物實驗中心,裸鼠重量23～27g,5～7周齡,分為實驗組20只和對照組20只,飼養在SPF級動物培養箱里。在第4天于裸鼠右側腋腹壁的皮下接種C33A細胞100μl,約5×106個細胞。接種后每天監測裸鼠及皮下瘤組織生活和生長情況。50d后拉頸迅速處死裸鼠,完整剝離瘤體, 對腫瘤體積大小和重量進行測量,并給予拍照。移植瘤做相關實驗。裸鼠研究獲得揚州大學動物實驗倫理委員會批準。

1.7 統計學方法 使用SPSS16.0和Graph Pad 5.0軟件分析數據和編輯圖片。計數資料組間采用Pearson’s法χ2檢驗,計量資料采用均數±標準差表示,符合正態分布,兩組間t檢驗,多組間ANOVA檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CSCC組織中miR-4534的表達 通過微小RNA表達譜并設置相關條件:miRNA表達水平上調、FC≥1.5且P<0.01,因而得到5個表達水平上調的miRNA:miR-548ac、miR-4534 (FC = 2.47,P= 0.001)、miR-483-5p、miR-564和miR-92b-5p。然后將這5個miRNA在71對CSCC組織中進行qRT-PCR驗證,結果如圖1所示,僅有miR-4534和miR-92b-5p表達水平升高(t=10.456、6.417,P<0.05)。本文選擇表達水平更高的miR-4534作為研究對象。

圖1 qRT-PCR 驗證差異性表達的miRNAs

2.2 miRNA-4534的表達及臨床病理意義 根據miR-4534的表達水平,探討其與臨床病理資料的相關性。根據表達水平的高低,將表達水平高于對照組的50例為高表達組;其余21例為正常表達(與對照組表達近似)+低表達組(表達水平低于對照組)。統計結果如表1所示,miRNA-4534的表達與腫瘤直徑和分化程度密切相關(均P<0.05),而與患者年齡、HPV感染、淋巴結轉移和TNM 分期無相關性(均P>0.05)。這一結果提示miR-4534參與了CSCC的生長增殖過程。

表1 兩組臨床病理特征比較

2.3 miRNA-4534對宮頸癌細胞增殖活性的影響 2.2實驗結果提示miR-4534與腫瘤直徑相關,因此本文進一步通過CCK-8實驗研究miR-4534對CSCC細胞增殖活性的影響。如圖2所示,在72h時,與過表達對照組(0.67±0.05)相比,過表達miR-4534 (0.92±0.04)促進了C33A細胞的增殖活性;與減低表達對照組(0.70±0.06)相比,降低miR-4534表達(0.48±0.03)則抑制了C33A細胞的增殖活性,差異均有統計學意義(P均<0.05)。

圖2 CCK-8增殖活性實驗結果

2.4 裸鼠實驗降低miRNA-4534表達對宮頸癌細胞生長的影響 已知在CSCC中miR-4534表達水平上調,故在體內裸鼠實驗中僅驗證降低miR-4534表達后對宮頸癌生長的影響。BALB/C裸鼠實驗分為兩組,即降低miR-4534表達組(si-miR-4534表達組,20只,5周)和對照組(20只,5周);每只裸鼠在右側腋腹壁的皮下接種C33A細胞 2×106個/100μl。每天監測并制作出移植瘤生長曲線。50d后,拉頸處死裸鼠,取出移植瘤并測量體積和大小,拍照,然后對組織進行免疫組化實驗。實驗結果如下:降低miR-4534表達后移植瘤生長體積和重量均明顯小于對照組(P<0.05)。見圖3。

圖3 裸鼠實驗中移植瘤的生長體積和重量

另外, Ki-67染色顯示降低miR-4534組的Ki-67陽性細胞比例為(28.3±3.1)%,明顯低于對照組(76.2±6.4)%的陽性比例(P<0.05),見圖4。

圖4 Ki-67染色結果

3 討論

近年來研究表明miRNA中既有促進宮頸癌發生發展的miRNAs,又有抑制宮頸癌進展的miRNAs。例如,miR-139-3p能通過負調控宮頸癌細胞中的NOB1來抑制細胞增殖、遷移和侵襲,并誘導細胞凋亡[2]。miR-424通過上調靶基因Chk1的表達促進宮頸癌癥的進展。miR-424可能成為預測癌癥患者預后的潛在指標和候選靶向治療[5]。上調的miR-93能下調CDKN1A表達,能使患者生存率最短[6]。宮頸癌中miR-92a直接靶向p21發揮致癌作用,從而促進細胞周期進展[7]。miR-1297的低表達水平與癌癥分化不良和淋巴結轉移顯著相關[8];miR-195的表達降低與癌癥患者的晚期臨床分期和淋巴結轉移有關[9];miR-218與宮頸癌細胞遷移和侵襲、誘導上皮—間充質轉化和侵襲相關[10]。

miR-4534定位于基因位點chr22: 37988794-37988853[+](GRCh38;GCA_000001405.15),其成熟基因序列為GGAUGGAGGAGGGGUCU。通過miRNA表達譜分析研究表明[11]在宮頸癌中miR-4534、miR-483-5p、miR-92b-5p和miR-548ac均表達水平升高,但對于miR-4534在宮頸癌中的作用研究并未深入探討。而miR-4534在前列腺癌中過度表達,促進了前列腺癌細胞的增殖、遷移/侵襲[12]。因此本文研究miRNA-4534在宮頸癌中的作用。

本研究發現,在71例CSCC組織中miRNA-4534表達水平升高,說明miRNA-4534發揮著促癌基因的作用。進一步分析miRNA-4534表達與CSCC臨床病理意義時發現,miR-4534表達與腫瘤大小和分化程度密切相關,而與患者年齡、HPV感染、淋巴結轉移和TNM 分期之間無相關性;表明miRNA-4534在CSCC中miR-4534表達水平越高,癌細胞分化程度越低,就越能生長,進一步說明miR-4534是一個促癌基因,可成為CSCC增殖的生物標志物。進一步行功能研究發現過表達miR-4534后,細胞的增殖活性升高;降低miR-4534表達后,細胞的增殖活性下降,再次提示miR-4534參與了CSCC細胞的生長過程。在裸鼠移植瘤實驗中,敲低miR-4534表達后移植瘤生長緩慢,體積較小,瘤體重量也較輕。Ki-67染色發現,敲低組中Ki-67陽性比例明顯低于對照組。實驗結果進一步驗證了miRNA-4534能促進CSCC細胞的生長和增殖。

綜上所述,miR-4534在CSCC中表達水平上調,與腫瘤的分化程度和直徑大小密切相關;miR-4534促進CSCC細胞的生長增殖,發揮促癌基因的作用。本研究探討了miRNA-4534在CSCC生長過程中的作用,為今后診斷和治療CSCC提供新的思路。