基于網絡藥理學及分子對接分析扶正解毒湯治療膀胱癌的作用機制*

江前前 楊 靜

1 安徽中醫藥大學第一臨床醫學院,安徽省合肥市 230012; 2 徐州市中醫院

膀胱癌是泌尿系統癌癥中最常見的惡性腫瘤之一。根據2021年全球癌癥統計,2020年膀胱癌發病573 278例,發病率排名第十;死亡212 536例,死亡率排名第十三,其發病率和死亡率呈逐年升高的趨勢[1]。目前膀胱癌的主要治療方式包括手術、放化療及免疫靶向治療,治療后容易復發,且藥物副反應較多,因此,尋找防治膀胱癌的更有效手段刻不容緩。

我國傳統中醫藥治療具有取材廣、毒副作用小等優勢,是目前國內外研究的熱點,研究表明,中藥有效成分可以通過調控膀胱癌的多種信號通路,對膀胱癌細胞具有阻滯細胞周期、抑制細胞增殖和遷移、誘導細胞凋亡等多種治療作用[2]。祖國醫學認為導致癌癥真正發病與否取決于人體正氣衰弱,正常人體臟腑組織經氣及血液運行需要“氣”的推動,正氣虧損則氣血行而不暢,遂結而成形有塊。扶正解毒湯中重用黃芪為君,四君子為臣,益氣健脾,增補后天之本,輔以白花蛇舌草、山慈菇、預知子等解毒散結之藥,全方配伍得當,養正除積,體現了攻補兼施、標本兼顧的治療原則。本研究借助網絡藥理學,構建“中藥成分—靶點—疾病”網絡,從生物信息學角度探索扶正解毒湯治療膀胱癌的潛在作用靶點和可能的作用機制,為臨床治療提供理論依據。

1 資料和方法

1.1 扶正解毒湯組成中藥的活性成分及靶基因獲取 利用TCMSP數據庫篩選出扶正解毒湯中中藥成分及靶基因,利用UniProt數據庫獲取對應的靶點蛋白。

1.2 藥物與疾病共同靶點的篩選 使用GeneCards數據庫,獲得膀胱癌的治療靶點。利用Venny軟件獲得扶正解毒湯與膀胱癌的共同靶點。

1.3 網絡模型的構建與分析 利用Cytoscape_v3.9.1軟件得到“中藥—活性成分—共同靶點”網絡圖。使用network analyzer對扶正解毒湯中中藥的活性成分進行分析。

1.4 構建蛋白質—蛋白質相互作用 在STRING數據庫中輸入共同靶點,利用Cytoscape軟件中的CytoNCA插件獲得前10位核心靶點。

1.5 分子對接驗證 分別從TCSMP和PDB數據庫中獲取核心活性成分的mol2格式和4種核心基因的3D結構,利用PyMOL軟件、Autodock軟件去氫、加水,將獲得的數據輸入Autodock軟件中進行分子對接,利用PyMOL軟件對分子對接的結果進行可視化。

1.6 通路富集分析 將共同靶點輸入DAVID數據庫,導出扶正解毒湯治療膀胱癌的GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析的結果,通過R軟件進行可視化。

2 結果

2.1 扶正解毒湯的有效成分及作用靶點 通過TCMSP數據庫獲得黃芪有20個潛在活性成分、人參有22個潛在活性成分、白術有7個潛在活性成分、茯苓有15個潛在活性成分、甘草有92個潛在活性成分、白花蛇舌草有7個潛在活性成分、山慈菇有3個潛在活性成分、預知子有6個潛在活性成分,共收集到2 023個靶點,刪除重復項,得到250個靶點基因。

2.2 疾病靶點整合 以“bladder cancer”為檢索詞檢索疾病數據庫,得到個10 489疾病基因,歸納整理結果,得到4 064個疾病基因,將疾病基因與活性成分靶點取交集,得到交集靶點197個。

2.3 藥物—成分—靶點網絡圖 利用Cytoscape對197個共同靶點繪制“中藥—活性成分—靶點”網絡圖,見圖1,使用network analyzer計算分析得到333個節點,2 488條邊,平均度值為11.4,根據度值篩選前10名活性成分,見表1。

表1 排名前10的中藥活性成分

圖1 “中藥—活性成分—靶點”網絡圖

2.4 PPI網絡圖及核心靶點 PPI網絡包含195個節點,8 124條邊,由STRING數據庫原始構造,其中節點代表蛋白質,邊緣代表蛋白質—蛋白質相互作用,為了進一步可視化和分析蛋白質—蛋白質相互作用,檢索到的PPI數據隨后被導入Cytoscape軟件中,通過CytoNCA插件獲得排名前10的核心靶點為AKT1、TP53、IL6、JUN、VEGFA、CASP3、IL1B、ESR1、EGFR、MAPK3(見圖2),其中IL6、ESR1、MAPK3、JUN基因在膀胱癌中低表達。

圖2 交集靶點核心網絡圖

2.5 分子對接驗證結果 將篩選得到的核心靶點

與相應的5個中藥關鍵活性成分(槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、異鼠李素)進行分子對接,得到的靶點—成分對接結果顯示均結合穩定見表2。AKT1與豆甾醇結合能為-8.77kcal/mol,與氨基酸殘基LYS-202、GLN-199、PRO198形成氫鍵,VEGFA與β-谷甾醇結合能為-8.37kcal/mol,與氨基酸殘基PHE-47形成氫鍵,VEGFA與豆甾醇結合能為-8.02kcal/mol,與氨基酸殘基GLN-37形成氫鍵。AKT1與β-谷甾醇結合活性最強,結合能為-8.79kcal/mol,其中與氨基酸殘基ILE-153、GLN-77形成氫鍵,見圖3。這驗證了網絡藥理學的預測。

表2 分子對接信息

圖3 AKT1與β-谷甾醇分子對接結果展示圖

2.6 GO與KEGG信號通路分析 通過DAVID數據庫,獲得GO和KEGG富集分析結果顯示扶正解毒湯抗膀胱癌的細胞定位主要富集胞漿、核質、細胞質,參與基因表達的正向調控,細胞對腫瘤壞死因子的反應,細胞凋亡等生物學過程;并通過酶、蛋白質結合,蛋白激酶結合等分子功能發揮作用。KEGG信號通路富集分析結果顯示扶正解毒湯抗膀胱癌機制主要涉及PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、P53信號通路等。將獲得的結果利用R語言獲得氣泡圖見圖4、圖5。

圖4 GO富集分析可視化

圖5 KEGG富集分析可視化

3 討論

3.1 扶正解毒湯治療膀胱癌核心活性成分 本研究獲得126個活性成分,篩選出5種核心活性成分,包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、異鼠李素,槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗癌等多種作用。體內外實驗均表明,槲皮素可以通過抑制細胞增殖、促進細胞凋亡等多種方式發揮抗腫瘤作用[3]。山柰酚是最常見的類黃酮,其不僅可以促進腫瘤細胞凋亡,同時可以通過雄激素依賴性途徑抑制細胞增殖,并抑制腫瘤細胞的血管生成模擬物和侵襲[4]。β-谷甾醇、豆甾醇屬于植物甾醇,具有降低膽固醇、抗腫瘤、預防心腦血管疾病等功能,研究表明植物甾醇不僅能促進癌細胞凋亡,阻滯細胞周期的S期,還能增強機體免疫能力[5]。研究表明,異鼠李素可以通過阻斷腫瘤細胞的細胞周期,增強抗腫瘤藥物活性、增加抑癌基因表達或抑制致癌基因表達,誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞擴散等多種途徑發揮抗腫瘤作用[6]。鑒于此,本研究認為扶正解毒湯是通過多種有效成分協同作用,其核心成分可通過誘導細胞凋亡,抑制腫瘤細胞增殖及轉移等途徑發揮抗腫瘤作用。

3.2 扶正解毒湯治療膀胱癌作用靶點分析 本研究篩選得到扶正解毒湯和膀胱癌之間相關的作用靶點共197個,通過PPI網絡分析及GEPIA數據庫篩選得到關鍵靶點有AKT1、TP53、VEGFA、CASP3、IL1B、EGFR等。AKT1屬于AKT家族成員,是重要的促癌基因,可通過PI3K被胞外激活,研究表明AKT1基因調控細胞增殖、生長和細胞凋亡主要是通過AKT/蛋白激酶B信號通路[7]。TP53為腫瘤的抑制基因,主要通過調節細胞周期從而抑制癌細胞的發展[8]。研究發現:TP53基因是膀胱癌中突變頻率的,高達到47%[9]。VEGFA是參與腫瘤生長和血管生成的最重要組織因子,VEGFA高表達可以加速細胞增殖、遷移和侵襲,反之可以抑制膀胱癌細胞的活力和活動性,促進腫瘤細胞的凋亡[10]。CASP3的表達與腫瘤類型的腫瘤微環境相關,研究發現其不僅可以通過促進細胞凋亡在腫瘤抑制中起著至關重要的作用,還可以參與B淋巴細胞活化、抗原呈遞、免疫反應、趨化因子受體和炎癥功能[11]。鑒于此,本研究認為扶正解毒湯是通過多靶點共同作用。

3.3 扶正解毒湯治療膀胱癌信號通路分析 本研究通過KEGG分析,獲得PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路與膀胱癌相關的通路,PI3K/AKT信號通路是細胞應激過程中關鍵的調節因子,在腫瘤細胞存活和增殖中的作用非常重要,并且與自噬和細胞凋亡有關[12]。在各種惡性腫瘤中,PI3K/AKT途徑激活可有助于細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡和代謝[13]。在膀胱癌中,觀察到PI3K/AKT信號在超過40%的病例中被組成型激活[14]。MAPK信號通路在腫瘤細胞增殖、侵襲及凋亡等過程中發揮重要作用[15]。MAPK家族中的p38 MAPK、ERK在組織損傷或病原體感染之后會出現過度激活,它們的過度激活在癌癥的發展和進展中起著重要作用[16]。而抑制ERK1/2和p38 MAPK可以誘導膀胱癌細胞周期阻滯,抑制其生長和增殖[17]。鑒于此,本研究認為扶正解毒湯通過下調Bcl-2的表達和活化p38,誘導膀胱癌T24和BIU87細胞凋亡,還通過抑制或者阻斷PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路活化抑制膀胱癌細胞增殖和轉移。

綜上所述,本研究通過網絡藥理學和分子對接的方法,對扶正解毒湯所含有的成分、靶點、信號通路與膀胱癌之間的復雜關系進行分析,初步篩選出可能作用于膀胱癌的中藥有效成分,驗證了扶正解毒湯對于膀胱癌的基本藥理學作用和相關作用機制,為進一步的臨床試驗研究提供背景依據。