半枝蓮含藥血清對膀胱癌T24細胞凋亡和黏附力的影響探究*

孫業香 王瀟瀟 王麗華 呂常旭

煙臺南山學院,山東省龍口市 265713

膀胱癌是臨床最常見的泌尿系統惡性腫瘤,也是全球最普遍的癌癥之一[1]。據全球癌癥負擔統計,全世界每年診斷超過18萬新發癌癥病例,其中3.0%的新發癌癥診斷和2.1%的癌癥死亡是由膀胱癌引起的,且隨著世界人口結構的變化及各種不同風險因素的變化,其發病率和死亡率也隨之變化[2]。膀胱癌具有多發性、多器官和易復發的特點,即使經規范化治療,仍有較高的復發率,且本病的病因復雜,涉及基因、蛋白、代謝等因素對癌細胞生長、侵襲、凋亡等生命活動的影響[3]。近年來,越來越多的學者從影響癌細胞生命活動方面進行研究,以期為膀胱癌的治療尋找新的方向和靶點。半枝蓮為唇形科植物半枝蓮的干燥全草,中醫認為其具有清熱解毒、活血化瘀、消腫止痛等多種功效,并具有抗癌作用[4-5],但其具體的抗癌機制及對膀胱癌細胞的作用仍有待進一步探究。本研究使用膀胱癌T24細胞株研究半枝蓮含藥血清對其凋亡及黏附力的影響,為半枝蓮在膀胱癌中的治療研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物與細胞。SPF級雄性Wistar大鼠(中山大學,粵SCXK2021-0029),體重240～260g,6～8周齡;人膀胱癌T24細胞株(中山大學生命科學院細胞庫)。

1.1.2 藥品與試劑。半枝蓮提取物(10∶1水提物,蘭州沃特萊斯生物科技有限公司);10%胎牛血清、RPMI-1640培養基(Gibco,內蒙古奧普賽生物科技有限公司);胰蛋白酶(北京索寶來公司)3-2(4,5-二甲基噻唑-2)-2-四甲基偶氮噻唑藍(MTT);DMSO溶液(Sigma公司);兔源一抗B-細胞淋巴瘤因子2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體、Bcl-2關聯X蛋白(Recombinant Bcl-2 Associated X Protein,Bax)抗體、胱天蛋白酶3(Caspase-3,CASP3)蛋白、二抗羊抗兔IgG(英國Abcam公司);CytoFLEX S流式細胞儀(貝克曼庫爾特有限公司,中國),Annexin V-APC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司);Fresco21離心機(賽默飛世爾科技有限公司,中國);FYL-YS-430L電熱恒溫孵育箱(北京福意電器有限公司);DM IL KED倒置熒光顯微鏡(徠卡顯微系統貿易有限公司,上海);低溫冰箱(中國海爾公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養。人膀胱癌T24細胞于10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的RPMI-1640培養基置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養,2～3d換液1次,至細胞融合至70%～80%用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 含藥血清制備[6]。Wistar大鼠適應性飼養1周后編號,隨機分為無藥血清組、半枝蓮低劑量組、半枝蓮中劑量組、半枝蓮高劑量組,5只/組,半枝蓮低、中、高劑量組分別以1.5g/(kg·d)、3g/(kg·d)、6g/(kg·d)(加入10ml蒸餾水制成混懸液)灌胃,2次/d,連續灌胃3d。無藥血清組采用蒸餾水灌胃,2次/d。末次灌胃后2h將大鼠以30mg/kg、3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,固定于手術臺,使用注射器經右心室抽血,室溫下靜置凝固,2 400r/min離心10min,分離上層血清,滅活處理后以0.22μm的微孔濾膜無菌過濾后于-20℃冰箱保存。

1.2.3 細胞分組及干預。對數生長期人膀胱癌T24細胞分為無藥血清組、半枝蓮低劑量組、半枝蓮中劑量組、半枝蓮高劑量組,以10%大鼠血清(各組細胞對應各組大鼠)培養,分別于24h和48h兩個時間點采用流式細胞儀檢測各濃度下T24細胞的凋亡率,實驗均重復3次。

1.2.4 細胞增殖情況。對數生長期T24細胞,以胰酶消化重懸,1×103個/孔接種于96孔板中恒溫培養,設置5個復孔,加入培養基100μl,于培養24h、48h時每孔加入CCK-8溶液10μl,在細胞培養箱中繼續培養4h,以酶標儀測定450nm處吸光度(A)值。計算細胞增殖抑制率=[1-(對照孔A值-實驗孔A值)/對照孔A值]×100%。

1.2.5 細胞凋亡情況。對數生長期細胞以胰酶消化重懸,4×103個/孔接種于6孔板中恒溫培養,流式細胞儀技術檢測T24細胞的凋亡周期變化。

1.2.6 細胞黏附力情況。96孔培養板預鋪Matrigel基質膠每孔10μg/50μl,于超凈臺內風干。96孔板中加入含有2%的BSA培養基,100μl/孔,細胞培養箱內封阻1h,PBS沖洗,加入各組細胞混懸液100μl/孔,每組5個復孔,培養48h,棄培養液,PBS洗滌,去掉未黏附細胞,加入EPMI-1640培養基及MTT溶液各50μl,繼續培養4h,每孔加入150μl DMSO,震蕩10min,于酶標儀上檢測570nm波長處的吸光度(A)值。細胞黏附率=[1-(對照孔A值-實驗孔A值)/對照孔A值]×100%。

1.2.7 凋亡相關蛋白表達。取各組培養48h后的T24細胞,PBS洗滌,離心收集上清,4℃環境下12 000r/min離心20min,棄上清液提取細胞蛋白,加入上樣緩沖液混勻,水浴變性,檢測蛋白濃度,以12%SDS-PAGE電泳,轉膜,5%脫脂奶粉封閉2h,TBST洗滌,加入Bcl-2、Bax、Caspase-3及內參蛋白GAPDH一抗孵育液,4℃孵育過夜,TBST洗滌,加入二抗孵育2h,TBTS洗滌,顯色、成像使用Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

2 結果

2.1 半枝蓮含藥血清對膀胱癌T24細胞增殖影響 各組細胞24h及48h的增殖抑制率比較,差異有統計學意義(P<0.05);均為:半枝蓮高劑量組>半枝蓮中劑量組>半枝蓮低劑量組>無藥血清組(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞增殖抑制率比較

2.2 半枝蓮含藥血清對膀胱癌T24細胞凋亡影響各組細胞凋亡率以及細胞周期G0/G1期、S期、G2期比較,差異有統計學意義(P<0.05);凋亡率、GO/G1顯示:無藥血清組<半枝蓮低劑量組<半枝蓮中劑量組<半枝蓮高劑量組(P<0.05);S、G2顯示:無藥血清組>半枝蓮低劑量組>半枝蓮中劑量組>半枝蓮高劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞凋亡及周期情況比較

2.3 半枝蓮含藥血清對膀胱癌T24細胞黏附力影響 各組細胞黏附率比較,差異有統計學意義(F=85.362,P<0.001),即無藥血清組(27.22±4.20)%<半枝蓮低劑量組(35.66±5.41)%<半枝蓮中劑量組(45.44±6.58)%<半枝蓮高劑量組(56.50±8.42)%(F=19.662,P<0.05)。

2.4 半枝蓮含藥血清對膀胱癌T24細胞凋亡相關蛋白表達影響 各組細胞Bcl-2、Bax、CASP3相對表達量比較,差異有統計學意義(P<0.05);Bcl-2顯示:無藥血清組>半枝蓮低劑量組>半枝蓮中劑量組>半枝蓮高劑量組(P<0.05);Bax、CASP3顯示:無藥血清組<半枝蓮低劑量組<半枝蓮中劑量組<半枝蓮高劑量組(P<0.05)。見表3。

表3 各組細胞凋亡相關蛋白表達比較

3 討論

在惡性腫瘤的發生發展過程中,癌細胞的凋亡、侵襲、轉移是病情進展及預后不佳的重要因素。凋亡是細胞自身調節的一種機制,在腫瘤中發揮重要的調節作用,可以防止腫瘤細胞的過度增生和擴散,并促進腫瘤細胞的死亡和清除[7]。侵襲和轉移是腫瘤增殖生長和遠處轉移的特性,與治療效果及預后息息相關,細胞與其周圍基質間的黏附情況是影響其侵襲能力的重要因素[8]。因此,促進癌細胞凋亡,增加其黏附力,從而抑制侵襲、轉移在惡性腫瘤的治療中有重要作用。

目前靶向治療為惡性腫瘤的重要治療方式之一,關于膀胱癌的靶向治療藥物有BGJ398、多韋替尼、厄達替尼等,但存在藥物安全性及治療準確性等問題。隨著中醫藥在癌癥治療中研究的深入,中草藥被證實能從多層面、多環節和多部位發揮明顯的多靶點效應,成為惡性腫瘤靶向治療的研究熱點。半枝蓮屬中醫藥中清熱解表藥物,其性溫、苦、寒,歸肺、腎經,具有清熱解毒、活血化瘀及利水消腫的作用[9]。現代藥理研究表明,半枝蓮中含有黃酮類、二萜類、二萜內酯類及多糖等化學成分,具有解熱、鎮痛、抗癌、抗炎、抗病毒、免疫調節、護肝等多種作用[10],因此被應用于癌癥的相關研究。目前關于含有半枝蓮的中藥復方制劑及半枝蓮有效成分的抗癌作用已有較多研究,但關于其在人前列腺癌方面的研究較少。張峰等在體外細胞研究發現,半枝蓮總黃酮能上調遷移侵襲蛋白的表達,抑制人胃腺癌細胞的增殖、誘導細胞凋亡,提高其放療敏感性[11]。劉明勝等將半枝蓮醇提取物應用于結直腸癌細胞HCT-116,結果表明半枝蓮醇提取物能抑制結直腸癌細胞的克隆形成,促進凋亡,其機制可能與調控circ_0092283/miR-198通路有關[12]。亦有相關研究證實半枝蓮及其相關提取物在乳腺癌、肝細胞癌中均發揮良好的抗癌效果[13-14]。本研究中,與無藥血清組比較,半枝蓮低/中/高劑量組的增殖抑制率、凋亡率且其變化程度與劑量有明顯的關系,這說明半枝蓮含藥血清可抑制人膀胱癌T24細胞的增殖,提高細胞與基質間的黏附力,有明顯的體外抗膀胱癌活性。

細胞的凋亡受細胞凋亡調節蛋白和細胞存活調節蛋白平衡的影響。Bcl-2家族蛋白在線粒體介導的內在細胞凋亡途徑中有重要作用,在癌細胞中屬于抗凋亡蛋白,其過度表達能增強細胞對細胞毒素的抵抗性,抑制多數腫瘤化療藥物引起的靶細胞凋亡[15]。Bax亦屬于Bcl-2家族成員,為促凋亡蛋白,能引起線粒體外膜的透化觸發細胞凋亡,細胞中的Bax蛋白被激活后可釋放凋亡信號因子,促進細胞凋亡[16]。Bcl-2與Bax的比值失衡則可造成細胞的過度凋亡或過度增殖,影響細胞的發生發展。CASP3是保守蛋白質家族中廣泛表達的成員,能特異性地切割天冬氨酸殘基上的肽鍵,引起細胞凋亡,是多種細胞動物體內所有凋亡蛋白中的主要執行對象,直接參與調控凋亡,導致細胞染色質濃縮、被吞噬敏感性增加[17]。本研究中經半枝蓮含藥血清干預的各組細胞G0/G1期、Bax與CASP3相對表達量增加均增加,細胞S期、G2期及Bcl-2蛋白相對表達量均下降,且呈劑量依賴性,說明半枝蓮含藥血清能在體外將膀胱癌T24細胞阻滯于G0/G1期,誘導細胞的凋亡,與既往對半枝蓮抗癌作用研究的特性相符。趙鴻翔等[18]進行的動物實驗表明,雄性SD大鼠腦室內注射β淀粉樣蛋白25-35、三氯化鋁及重組人轉化生長因子,能引起線粒體凋亡因子Bcl-2、Bax、Bal-xL及Bak的異常改變,半枝蓮黃酮能逆轉這一改變,可說明半枝蓮能通過增加Bax的表達,抑制Bcl-2的表達,促進人膀胱癌T24細胞的凋亡,抑制其增殖,發揮相關抗癌作用。

綜上所述,半枝蓮含藥血清能抑制人膀胱癌T24細胞的增殖,誘導凋亡,提高細胞黏附力,可作為抗膀胱癌藥物進行研究。本研究的不足之處在于僅從細胞實驗方面驗證了半枝蓮在對人膀胱癌T24細胞的抗癌作用,后續仍需進一步建立動物皮下移植瘤模型,深入進行多機制探討,為膀胱癌的防治研究提供更加全面的參考。