鹽酸小檗堿對(duì)大鼠體內(nèi)低劑量阿托伐他汀的藥動(dòng)學(xué)影響研究*

余瑞蓮 張慶平 廖輝雄 梁啦迪 崔莉婉

廣東省深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院藥學(xué)部 518109

阿托伐他汀屬于臨床上應(yīng)用較為廣泛的一種降脂藥物,然而作為P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)以及細(xì)胞色素P4503A4酶(Cytochrome P4503A4 enzyme,CYP3A4)雙重底物,其極易和其他藥物發(fā)生多樣性藥物相互作用[1]。鹽酸小檗堿主要是指從黃連、三顆針以及黃柏等植物中提取分離獲得的一種生物堿,亦可稱之為黃連素,其對(duì)細(xì)菌具有微弱的抵抗作用,同時(shí)具備抗氧化、降血糖、抗炎、降血壓以及降血脂等作用[2]。其降血脂的主要作用機(jī)制可能是通過抑制肝臟前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(Proproteininvertase subtilin 9,PCSK9)活性實(shí)現(xiàn),繼而引起低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)受體的表達(dá)升高,進(jìn)一步減少血循環(huán)中的LDL-C水平[3]。隨著近年來相關(guān)研究的不斷深入,不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)小檗堿所引發(fā)的藥物相互作用主要和CYP450酶及P-gp的活性有關(guān)。小檗堿可對(duì)外源性以及內(nèi)源性P-gp以及CYP3A4均產(chǎn)生一定影響[4]。由此推測(cè),鹽酸小檗堿和阿托伐他汀聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可能產(chǎn)生藥物相互作用。鑒于此,本文通過研究鹽酸小檗堿對(duì)大鼠體內(nèi)低劑量阿托伐他汀的藥動(dòng)學(xué)影響及機(jī)制,旨在探討鹽酸小檗堿對(duì)阿托伐他汀體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響,研究這兩者是否存在相互作用,在避免產(chǎn)生不良相互作用反應(yīng)的同時(shí),更好利用兩者相互作用產(chǎn)生的協(xié)同作用,為臨床用藥給予指導(dǎo),使患者可以多一個(gè)備選治療方案,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取18只SD健康雄性大鼠進(jìn)行研究,以隨機(jī)雙盲對(duì)照法將其分成A組、B組、C組,每組6只。8～10周齡,體重180～200g,由空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證編號(hào)SCXK(陜)2019-001]。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房,自由飲食,自然光照,環(huán)境相對(duì)濕度為50%～55%,溫度為22～26℃,明暗周期為12h/12h,行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)全過程符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 干預(yù)方式 A組予以10mg/kg的阿托伐他汀鈣灌胃處理;B組首先予以小檗堿30mg/kg灌胃,5min后阿托伐他汀鈣10mg/kg相繼灌胃;C組首先予以小檗堿90mg/kg灌胃,5min后阿托伐他汀鈣10mg/kg相繼灌胃。

1.3 觀察指標(biāo) 對(duì)比各組大鼠給藥前以及給藥2h、4h、6h、8h后阿托伐他汀鈣含量,各組大鼠體內(nèi)阿托伐他汀藥動(dòng)學(xué)參數(shù),各組大鼠肝臟CYP450以及P-gp表達(dá),以及肝組織UGT、GST及GSH水平。(1)利用液相質(zhì)譜(LC-MS)法分別檢測(cè)三組大鼠阿托伐他汀鈣血藥濃度,其中LC1260型高效液相色譜儀,色譜柱為C18、5μm、4.6mm×250mm(購(gòu)自安捷倫)。色譜純選用乙腈及四氫呋喃(均購(gòu)自賽浮瑞);分析純選用乙酸銨(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán))、乙酸(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán))以及N,N-二甲基甲酰胺(購(gòu)自恒興化學(xué)試劑);阿托伐他汀鈣(批號(hào):100590-202005);鹽酸小檗堿(批號(hào):H50020620)。(2)應(yīng)用DAS 2.0軟件繪制阿托伐他汀的藥時(shí)曲線,計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如達(dá)峰時(shí)間(Time to reach maximum concentration,tmax)、峰濃度(Maximum plasma concentration,Cmax)、消除半衰期(The apparent elimination half-life,t1/2)、清除率(Clearance,CL)和平均滯留時(shí)間(Mean residence time,MRT)等參數(shù)。其中檢測(cè)波長(zhǎng)選擇244nm,流速以1.5ml/min為宜,柱溫以35℃為宜,進(jìn)樣量即20μl。流動(dòng)相A參數(shù)如下:醋酸鹽緩沖液∶乙腈∶四氫呋喃=67∶21∶12;流動(dòng)相B參數(shù)如下:醋酸鹽緩沖液∶乙腈∶四氫呋喃=27∶61∶12。(3)采集所有大鼠肝臟組織,利用PCR法及ELISA法檢測(cè)細(xì)胞色素P450(CYP450)以及P-糖蛋白(P-gp)蛋白表達(dá)情況,以及各組大鼠肝臟組織UGT、GST及GSH含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠給藥前后阿托伐他汀鈣含量對(duì)比 B組、C組大鼠給藥2h后血漿阿托伐他汀鈣含量均高于A組,且C組大鼠給藥2h后血漿阿托伐他汀鈣含量高于B組(均P<0.05);三組大鼠給藥前以及給藥4h、6h、8h后的血漿阿托伐他汀鈣含量對(duì)比均不明顯(均P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠給藥前后阿托伐他汀鈣含量對(duì)比

2.2 各組大鼠體內(nèi)阿托伐他汀藥動(dòng)學(xué)參數(shù)對(duì)比 B組、C組大鼠tmax水平低于A組,且C組大鼠tmax水平低于B組;B組、C組大鼠Cmax、t1/2、CL以及MRT水平均高于A組,且C組大鼠Cmax、t1/2、CL以及MRT水平均高于B組(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠體內(nèi)阿托伐他汀藥動(dòng)學(xué)參數(shù)對(duì)比

2.3 各組大鼠肝臟CYP450以及P-gp表達(dá)對(duì)比 B組、C組肝臟CYP450以及P-gp表達(dá)均高于A組(均P<0.05);且B組和C組肝臟CYP450以及P-gp表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

2.4 各組大鼠肝組織UGT、GST及GSH對(duì)比 B組、C組大鼠肝組織UGT、GST活性均低于A組,且C組UGT、GST活性均低于B組;B組、C組大鼠肝組織GSH活性均高于A組,且C組GSH活性高于B組(均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠肝組織UGT、GST及GSH對(duì)比

3 討論

近年來,雙重藥物相互作用的研究受到國(guó)內(nèi)外廣大研究學(xué)者的重視,尤其是有關(guān)P-gp和CYP3A4的概念,所受到的關(guān)注較多。其中腸壁細(xì)胞中CYP 3A所參與的藥物代謝以及P-gp所參與的藥物逆轉(zhuǎn)運(yùn),會(huì)在一定程度上限制進(jìn)入全身循環(huán)的藥物濃度,從而影響藥物口服生物利用度[5]。同時(shí),腸道中P-gp和CYP3A4之間會(huì)相互影響,前者可通過延長(zhǎng)藥物與后者相關(guān)酶的接觸,繼而抑制藥物的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)一步有助于藥物被腸壁CYP3A4代謝,最終影響藥物代謝的程度[6]。作為P-gp和CYP3A4雙重底物的阿托伐他汀,極易和其他藥物發(fā)生復(fù)雜的藥物相互作用[7]。如果聯(lián)合用藥使阿托伐他汀的生物利用度增加,則應(yīng)考慮降低阿托伐他汀的起始劑量和維持劑量。目前臨床由于小檗堿與他汀類不同的降血脂機(jī)制,他汀類藥物與小檗堿已常常聯(lián)合用于降血脂治療,而這兩者是否相互作用并未徹底闡明[8]。因此,探討鹽酸小檗堿對(duì)阿托伐他汀鈣藥代動(dòng)力學(xué)的影響是很有必要,并具有重大的臨床用藥指導(dǎo)意義。

本文結(jié)果發(fā)現(xiàn),B組、C組大鼠給藥2h后血漿阿托伐他汀鈣含量均高于A組,且C組大鼠給藥2h后血漿阿托伐他汀鈣含量高于B組(均P<0.05);三組大鼠給藥前以及給藥4h、6h、8h后的血漿阿托伐他汀鈣含量對(duì)比均不明顯(均P>0.05)。提示鹽酸小檗堿對(duì)大鼠體內(nèi)低劑量阿托伐他汀的藥動(dòng)學(xué)有一定影響,即會(huì)在一定程度上提高阿托伐他汀的血藥濃度。考慮導(dǎo)致此結(jié)果的具體作用機(jī)理,可能和小檗堿影響P-gp以及CTP450酶的活性有關(guān)。其中CYP酶屬于關(guān)鍵性氧化酶之一,可幫助機(jī)體代謝大多數(shù)臨床治療藥物,且主要機(jī)理在于能參與藥物代謝的Ⅰ期,而鹽酸小檗堿及其他汀類藥物均可通過調(diào)控CYP酶的代謝,競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CYP的活性位點(diǎn),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)阿托伐他汀藥動(dòng)學(xué)的調(diào)控。然而,目前臨床上針對(duì)小檗堿對(duì)P-gp以及CTP450酶活性的影響研究存在一定差異。其中辛華雯團(tuán)隊(duì)[9]的研究發(fā)現(xiàn),小檗堿對(duì)大鼠肝、腸細(xì)胞中的CYP3A酶有抑制作用,而在Hep G2細(xì)胞中,推測(cè)小檗堿對(duì)CYP3A4呈雙向作用即低劑量(50mg/kg)誘導(dǎo),高劑量(200mg/kg)抑制。譚文超[10]也發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿(250mg/kg)對(duì)大鼠肝CYP 3A的活性有一定抑制作用。有學(xué)者認(rèn)為復(fù)方黃連素片對(duì)體外肝微粒體CYP 3A4表現(xiàn)為抑制作用。Guo Y等[11]在健康人中發(fā)現(xiàn),重復(fù)口服小檗堿(0.3g tid)可降低健康人CYP3A4活性。Chatterjee P[12]和Zhao Y[13]兩個(gè)團(tuán)隊(duì)研究認(rèn)為,因小檗堿化學(xué)結(jié)構(gòu)中缺乏6位的親脂性、大體積的官能團(tuán),對(duì)肝CYP3A4只有很弱的抑制作用,與CYP 3A4藥物底物之間可能無臨床意義的全身相互作用。而Qiu等[14]發(fā)現(xiàn)小檗堿(10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg)對(duì)大鼠腸道和肝臟CYP3A活性無明顯影響。推測(cè)正常劑量的小檗堿對(duì)人體內(nèi)CYP3A的活性可能沒有抑制作用。陳健龍等、孫育等、張永國(guó)等[15-17]也認(rèn)為小檗堿質(zhì)量濃度在2 000μg/L以下時(shí),對(duì)人肝微粒體中的CYP3A4活性沒有明顯影響。與以上結(jié)論不同,有研究發(fā)現(xiàn),在Hep G2細(xì)胞中,小檗堿質(zhì)量依賴性誘導(dǎo)CYP3A4的活性,增加其mRNA和蛋白表達(dá)。本文結(jié)果還發(fā)現(xiàn)了B組、C組大鼠tmax水平低于A組,且C組大鼠tmax水平低于B組;B組、C組大鼠Cmax、t1/2、CL以及MRT水平均高于A組,且C組大鼠Cmax、t1/2、CL以及MRT水平均高于B組。這反映了小檗堿可能會(huì)對(duì)阿托伐他汀藥動(dòng)學(xué)造成影響,但本研究主要對(duì)象為大鼠,和人體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)變化是否一致仍需深入研究證實(shí)[18-20]。B組、C組肝臟CYP450以及P-gp表達(dá)均高于A組。提示應(yīng)用鹽酸小檗堿的主要機(jī)理在于可影響大鼠體內(nèi)的藥物代謝酶表達(dá),繼而影響了大鼠對(duì)藥物的吸收,最終影響藥物生物利用度,值得臨床重點(diǎn)關(guān)注。B組、C組大鼠肝組織UGT、GST活性均低于A組,且C組上述指標(biāo)活性均低于B組;B組、C組大鼠肝組織GSH活性均高于A組,且C組GSH活性高于B組。UGT、GST均參與了藥物結(jié)合代謝,通過誘導(dǎo)Ⅱ相代謝生成藥物的非活性形式,從而促使藥物被排出體位,進(jìn)而發(fā)生解毒作用。而GSH則具有完全相反的作用,GST可通過和其發(fā)生特異性結(jié)合,進(jìn)而產(chǎn)生親水性產(chǎn)物,進(jìn)一步代謝及排泄。由此推測(cè),鹽酸小檗堿對(duì)大鼠體內(nèi)低劑量阿托伐他汀的藥動(dòng)學(xué)的影響機(jī)制之一可能和調(diào)控UGT、GST、GSH活性有關(guān)。

綜上所述,鹽酸小檗堿對(duì)大鼠體內(nèi)低劑量阿托伐他汀的藥動(dòng)學(xué)有一定影響,臨床聯(lián)合應(yīng)用時(shí)需謹(jǐn)慎。然而,本研究屬于動(dòng)物實(shí)驗(yàn),無法證實(shí)其在人體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)變化。因此,在今后的研究中可能考慮開展臨床試驗(yàn),以獲取更為準(zhǔn)確、真實(shí)的數(shù)據(jù),從而指導(dǎo)臨床工作,這也是本次研究的不足之處,今后可進(jìn)一步深入開展研究。